Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement des phosphoprotéines phosphatases endogènes et de leurs protéines en interaction à partir de cellules et de tissus et leur identification et quantification par spectrométrie de masse protéomique.
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Article de méthode
Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs
Dans cet article
Résumé
Résumé
La plupart des processus cellulaires sont régulés par phosphorylation dynamique des protéines. Plus des trois quarts des protéines sont phosphorylées et les phosphoprotéines phosphatases (PPP) coordonnent plus de 90 % de toute la déphosphorylation cellulaire de la sérine/thréonine. La dérégulation de la phosphorylation des protéines a été impliquée dans la physiopathologie de diverses maladies, y compris le cancer et la neurodégénérescence. Malgré leur activité généralisée, les mécanismes moléculaires contrôlant les PPP et ceux contrôlés par les PPP sont mal caractérisés. Ici, une approche protéomique appelée perles inhibitrices de la phosphatase et spectrométrie de masse (PIB-MS) est décrite pour identifier et quantifier les PPP, leurs modifications post-traductionnelles et leurs interacteurs en aussi peu que 12 heures en utilisant n’importe quelle lignée cellulaire ou tissu. PIB-MS utilise un inhibiteur non sélectif du PPP, la microcystine-LR (MCLR), immobilisé sur des billes de sépharose pour capturer et enrichir les PPP endogènes et leurs protéines associées (appelées PPPome). Cette méthode ne nécessite pas l’expression exogène de versions marquées de PPP ni l’utilisation d’anticorps spécifiques. PIB-MS offre un moyen innovant d’étudier les PPP conservés de manière évolutive et d’élargir notre compréhension actuelle de la signalisation de déphosphorylation.
Introduction
La phosphorylation des protéines contrôle la plupart des processus cellulaires, y compris, mais sans s’y limiter, la réponse aux dommages à l’ADN, la signalisation du facteur de croissance et le passage par la mitose 1,2,3. Dans les cellules de mammifères, la majorité des protéines sont phosphorylées à un ou plusieurs résidus de sérine, de thréonine ou de tyrosine à un moment donné, les phosphosérines et les phosphothréonines représentant environ 98 % de tous les sites de phosphorylation 2,3. Alors que les kinases ont....
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Protocole
REMARQUE: La génération de PIB se fait comme décrit par Moorhead et al., où 1 mg de microcystine et environ 6 mL de sépharose sont couplés pour générer des PIBs avec une capacité de liaison allant jusqu’à 5 mg / mL17.
1. Préparation de l’échantillon
REMARQUE: Une quantité de départ typique pour PIB-MS est de 1 mg de protéines totales par condition. Pour cette expérience, environ 2,5 x 106 cellules HeLa ont été utilisées pour extraire 1 mg de protéines. Ce calcul doit être effectué pour chaque lignée cellulaire ou tissu utilisé dans une expérience....
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Résultats
Figure 2 : Identification de liants PIB spécifiques. (A) Divers types de tissus ou de cellules peuvent être analysés via PIB-MS. Les cellules HeLa en triplicate biologique ont été soit traitées avec du DMSO ou l’inhibiteur de PPP MCLR, incubées avec des PIBs, et analysées via LC-MS/MS. (B) Volc.......
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Discussion
PIB-MS est une approche protéomique chimique utilisée pour profiler quantitativement le PPPome à partir de diverses sources d’échantillons en une seule analyse. Beaucoup de travail a été fait en utilisant des billes inhibitrices de kinase pour étudier le kinome et comment il change dans le cancer et d’autres états pathologiques 10,11,12,13. Pourtant, l’étude du PPPome est à la traîne. Nous prév.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
A.N.K. reconnaît le soutien des NIH R33 CA225458 et R35 GM119455. Nous remercions les laboratoires Kettenbach et Gerber pour leur discussion utile.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acétonitrile (ACN) | Honeywell | AH015-4 | ATTENTION : L’ACN est inflammable et toxique ; portez des gants et travaillez dans une hotte chimique. |
| Acétonitrile anhydre | Sigma-Aldrich | 271004-100ML ATTENTION | : L’ACN est inflammable et toxique ; portez des gants et utilisez une hotte chimique. |
| Centrifugeuse de paillasse | Eppendorf | modèle n° 5424 | |
| Acide bêta-glycérophosphorique, sel disodique pentahydraté | Acros Organics | 410991000 | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | modèle n° 5810 R version 15 ampères | |
| Eau | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce tissue broyeur | Fisherbrand Pellet Pestles | 12-141-363 | |
| Disque d’extraction en phase solide Empore, C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Tubes Eppendorf, 1,5 mL | Eppendorf | 22363204 | CRITIQUE : D’autres tubes peuvent lessiver le polymère dans l’échantillon, contaminant ainsi l’analyse. |
| Tubes Eppendorf, 2 mL | Eppendorf | 22363352 | CRITIQUE : D’autres tubes peuvent lessiver du polymère dans l’échantillon, contaminant ainsi l’analyse. |
| Collecteur à plaque d’extraction | Tubes Waters | WAT097944 | |
| Falcon, 50 mL | VWR | 21008 | |
| Aiguille et piston | |||
| Crémaillère générique à | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Chlorure d’hydrogène (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | ATTENTION : Le HCl est corrosif ; Portez des gants et travaillez dans une hotte chimique. |
| Solution d’hydroxylamine 50 % (poids/vol) | 467804 | Sigma-Aldrich | |
| , 65 ° ; C | VWR | modèle n° 1380FM | |
| Koptec Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | V1001 | |
| Méthanol pour HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | ATTENTION : Le MeOH est inflammable et toxique ; portez des gants et travaillez dans une hotte chimique. |
| Microcystine LR (MCLR) | Cayman Chemical | 10007188 | ATTENTION : La MCLR est toxique ; portez des gants lors de la manipulation et évitez tout contact avec la peau. |
| PBS, 1&fois ; sans calcium ni magnésium, pH 7,4 ± ; 0,1 | Corning | ; 21-040-CV | |
| Bandelettes de test de pH, telles que les bandelettes de test de pH MilliporeSigma MColorpHast et les papiers indicateurs | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | Pour le protocole de génération des PIB, voir Moorhead et al., 2007. | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pointes de pipette, 10 &mu ; L | Eppendorf | 22491504 | CRITIQUE : D’autres pointes peuvent lessiver le polymère dans les échantillons, contaminant ainsi l’analyse. |
| Pointes de pipette, 1000 &mu ; L | Eppendorf | 22491555 | CRITIQUE : D’autres pointes peuvent lessiver le polymère dans les échantillons, contaminant l’analyse. |
| Pointes de pipette, 200 &mu ; L | Eppendorf | 22491539 | CRITIQUE : D’autres pointes peuvent lessiver le polymère dans les échantillons, contaminant l’analyse. |
| seringue en plastique, 10 mL | BD | 309604 | |
| Cocktail inhibiteur de protéase III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos ou Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer. | Thermo Scientific | ||
| Centrifugeuse de paillasse réfrigérée | Eppendorf | modèle n° 5424 R | |
| Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Rotation 8 tr/min |
| Plaque de prélèvement d’échantillons, 96 puits, 1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| Qualité de séquençage trypsine modifiée | Promega | V511C | |
| Azoture de sodium | EMD Chemicals | SX0299-1 | ATTENTION : L’azoture de sodium est explosif et toxique ; portez des gants, travaillez dans une hotte chimique et évitez tout contact avec les métaux. |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sonicateur Fisher Chemical | S27110 | |
| (sonifieur numérique Branson) | modèle no. SFX 250 | ||
| SPE C18 plaque de dessalage | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads particules modifiées au carboxylate magnétique (billes SP3) | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| Thermomixeur | Eppendorf | modèle n° 5350 | |
| TMT10plex Isobaric Label Reproduct Set plus TMT11-131C Réactif d’étiquetage, 3 & times ; 0.8 mg par tag | ThermoFisher | A37725 | |
| Acide trifluoroacétique (TFA) | Honeywell | T6508-25ML | ATTENTION : Le TFA est corrosif et irrite la peau au contact. Portez des gants et des lunettes de protection, et travaillez dans une hotte chimique. |
| Tris Base | Research Products International | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Centrifugeuse à vide et piège à vapeur | Thermo Scientific | modèle nos. SpeedVac SPD120 et RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries Eau | ||
| LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
Références
- Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
- Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
- Bra....
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Réimpressions et autorisations
