Article de méthode

Démonstration de l’innervation de la peau poilue et glabre dans un motif 3D à l’aide de multiples approches de coloration fluorescente et de nettoyage des tissus

DOI :

10.3791/63807

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20 mai 2022

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’épaisseur des coupes tissulaires limitait l’étude morphologique de l’innervation de la peau. Le présent protocole décrit une technique unique de nettoyage des tissus pour visualiser les fibres nerveuses cutanées dans des coupes de tissus épaisses de 300 μm sous microscopie confocale.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’innervation de la peau est une partie importante du système nerveux périphérique. Bien que l’étude des fibres nerveuses cutanées ait progressé rapidement, la plupart de la compréhension de leurs caractéristiques distributives et chimiques provient de la coloration histochimique et immunohistochimique conventionnelle sur des coupes de tissus minces. Avec le développement de la technique de nettoyage des tissus, il est devenu possible de voir les fibres nerveuses cutanées sur des sections de tissus plus épaisses. Le présent protocole décrit de multiples colorations fluorescentes sur des coupes de tissus d’une épaisseur de 300 μm à partir de la peau plantaire et dorsale de l’arrière-pied de rat, les deux sites typiques de la peau poilue et glabre. Ici, le peptide lié au gène de la calcitonine marque les fibres nerveuses sensorielles, tandis que la phalloïdine et le récepteur hyaluronane endothélial 1 des vaisseaux lymphatiques marquent respectivement les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Sous un microscope confocal, les fibres nerveuses sensorielles marquées ont été suivies complètement sur une plus longue distance, en faisceaux dans la couche cutanée profonde et en style libre dans la couche superficielle. Ces fibres nerveuses couraient parallèlement ou entouraient les vaisseaux sanguins, et les vaisseaux lymphatiques formaient un réseau tridimensionnel (3D) dans la peau poilue et glabre. Le protocole actuel fournit une approche plus efficace pour étudier l’innervation de la peau que les méthodes conventionnelles existantes du point de vue de la méthodologie.

Introduction

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La peau, le plus grand organe du corps, servant d’interface clé avec l’environnement, est densément innervée par de nombreuses fibres nerveuses 1,2,3. Bien que l’innervation de la peau ait été largement étudiée précédemment avec diverses méthodes histologiques, telles que la coloration sur des coupes de peau et de tissus de monture entière 4,5,6, la démonstration efficace détaillée des fibres nerveuses cutanées reste un défi 7,8. Compte tenu de cela, le présent protocole a développé une technique unique pour exposer plus clairement les fibres nerveuses cutanées dans la section de tissu épais.

En raison de la limite par l’épaisseur des sections, l’observation des fibres nerveuses de la peau innervées n’est pas assez précise pour décrire avec précision la relation entre les fibres nerveuses peptidiques liées au gène de la calcitonine (CGRP) et les tissus et organes locaux à partir des informations d’image acquises. L’émergence de la technologie de nettoyage des tissus 3D fournit une méthode réalisable pour résoudre ce problème 9,10. Le développement rapide d’approches de nettoyage des tissus a offert de nombreux outils pour étudier les structures tissulaires, les organes entiers, les projections neuronales et les animaux entiers ces derniers temps11. Le tissu cutané transparent pourrait être imagé dans une section beaucoup plus épaisse par microscopie confocale pour obtenir les données permettant de visualiser les fibres nerveuses cutanées.

Dans la présente étude, la peau plantaire et dorsale d’un pied postérieur de rat a été sélectionnée comme les deux sites cibles de la peau poilue et glabre 3,4,7. Pour tracer les fibres nerveuses cutanées à une plus grande distance, le tissu cutané a été tranché à l’épaisseur de 300 μm pour la coloration immunohistochimique et histochimique, suivie d’un traitement de nettoyage des tissus. Le CGRP a été utilisé pour marquer les fibres nerveuses sensorielles12,13. En outre, pour mettre en évidence les fibres nerveuses cutanées sur le fond tissulaire, la phalloïdine et le récepteur hyaluronique endothélial 1 des vaisseaux lymphatiques (LYVE1) ont également été utilisés pour marquer les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques, respectivement14,15.

Ces approches ont fourni une méthode simple qui peut être appliquée pour démontrer une vue à haute résolution des fibres nerveuses cutanées et aussi pour visualiser la corrélation spatiale entre les fibres nerveuses, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques de la peau, ce qui peut fournir beaucoup plus d’informations pour comprendre l’homéostasie de la peau normale et l’altération cutanée dans les conditions pathologiques.

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Protocole

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La présente étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (numéro de référence D2018-04-13-1). Toutes les procédures ont été effectuées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Trois rats mâles adultes (Sprague-Dawley, poids 230 ± 15 g) ont été utilisés dans cette étude. Tous les animaux ont été logés dans un cycle lumière/obscurité de 12 h avec une température et une humidité contrôlées et ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau.

1. Perfusion et préparation des échantillons

  1. Injecter 250 mg/kg de solution de tribromoéthanol (voir tableau des matériaux) par voie intrapéritonéale dans le rat pour induire l’euthanasie.
  2. Une fois la respiration arrêtée, utilisez des ciseaux chirurgicaux en acier inoxydable pour ouvrir la cavité thoracique du rat. Utiliser des aiguilles de 20 G pour perfuser via le ventriculecardiaque gauche 13 à raison de 3 mL/min avec 100 mL de solution saline normale à 0,9 % suivie de 250 à 300 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate de 0,1 M (PB, pH 7,4) (Figure 1A,B).
  3. Après la perfusion, utilisez un scalpel pour enlever la peau du dos et de la plante de la patte postérieure.
    1. Pour les échantillons nécessitant une section congelée, post-fixer les tissus dans du paraformaldéhyde à 4 % dans 0,1 M PB pendant 2 h; puis cryoprotéger les tissus dans 25% de saccharose dans 0,1 M PB pendant plus de 24 h à 4 °C
    2. Pour les échantillons dont la section épaisse nécessite un nettoyage des tissus, post-fixer les tissus dans 4% de paraformaldéhyde dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) pendant 2 h; puis cryoprotéger les tissus dans 1x PBS à 4 °C (Figure 1C–E).

2. Triple coloration fluorescente avec CGRP, phalloïdine et LYVE1 suivie d’un traitement de nettoyage des tissus

REMARQUE: Une triple coloration fluorescente avec CGRP, phalloïdine et LYVE1 a été appliquée pour révéler les fibres nerveuses, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques dans la peau poilue et glabre sur des coupes de tissus d’une épaisseur de 300 μm après un traitement de nettoyage des tissus.

  1. Préparer 2% d’agarose dans 1x PBS en chauffant dans un micro-four pendant 2 min jusqu’à ce que l’agarose se dissout (voir tableau des matériaux).
  2. Après le lavage, incorporez les tissus cutanés dans de l’agarose à 2 % à 37 °C et placez-les à l’intérieur de la glacière pour le refroidissement (Figure 1F, G).
  3. Fixez le tissu monté sur le microtome vibratoire avec l’eau glacée et coupez-les en tranches à une épaisseur de 500 μm dans le sens transversal. Utilisez les paramètres suivants pour régler la trancheuse de vibration et terminer le tranchage : vitesse, 0,50 mm/s, et amplitude, 1,5 mm (Figure 1H-K).
  4. Après le tranchage, retirez l’agarose des sections et stockez-les dans une plaque à six puits avec 1x PBS (pH 7,4) (Figure 1L).
  5. Incuber les coupes tissulaires dans une solution de Triton X-100 à 2 % dans 1x PBS (TriX-PB) pendant la nuit à 4 °C. Reportez-vous à la figure 2 pour la procédure suivante.
  6. Placez les sections de tissu dans le tampon bloquant et faites pivoter à 72 tr/min sur le shaker pendant la nuit à 4 °C.
    REMARQUE: La composition tampon bloquante est de 10% de sérum d’âne normal, de 1% de Triton-X 100 et de 0,2% d’azoture de sodium dans 1x PBS (voir tableau des matériaux).
  7. Transférer les coupes tissulaires dans la solution contenant les anticorps primaires de l’anti-CGRP monoclonal de souris (1:500) et de l’anticorps polyclonal anti-LYVE1 de mouton (1:500) dans un tampon de dilution dans le tube de microcentrifugation (voir tableau des matériaux), et faire pivoter sur le shaker pendant 2 jours à 4 °C.
    REMARQUE: La composition tampon de dilution est de 1% de sérum d’âne normal, 0,2% de Triton-X 100 et 0,2% d’azoture de sodium dans 1x PBS.
  8. Lavez les coupes de tissu deux fois avec un tampon de lavage à température ambiante, puis conservez-les sur le shaker pendant la nuit à 4 ° C dans le tampon de lavage.
    REMARQUE: La composition du tampon de lavage est de 0,2% Triton-X 100 dans 0,1 M PB (pH 7,4).
  9. Le lendemain, transférer les coupes de tissus dans la solution mélangée contenant les anticorps secondaires de l’âne anti-souris IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) et de l’âne anti-mouton IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), ainsi que de la phalloïdine Alexa-Flour594 (1:1000) (voir table des matériaux) dans un tube de microcentrifuge et tourner à 72 tr/min sur le shaker pendant 5 h à 4 °C.
  10. Lavez les sections de tissu dans une plaque à six puits avec tampon de lavage pendant 1 h, deux fois, à température ambiante. Conservez les sections de tissus dans un tampon de lavage sur le shaker pendant la nuit à 4 °C.
  11. Transférer les coupes de tissu dans le réactif de nettoyage des tissus (voir Tableau des matériaux, son volume était cinq fois supérieur au volume de l’échantillon) et faire pivoter doucement à 60 tr/min sur le shaker pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE: Après ce traitement, les sections de tissu deviennent claires (Figure 2B).
  12. Montez les tissus nettoyés sur la glissière, encerclez les tissus avec une entretoise et collez l’espace avec un réactif de nettoyage des tissus frais et un couvercle.

3. Triple coloration fluorescente avec CGRP, phalloïdine et LYVE1 suivant l’approche conventionnelle

NOTE: À titre de comparaison, la même coloration a été effectuée sur des coupes de tissus d’une épaisseur de 30 μm selon les techniques conventionnelles.

  1. Trancher les coupes de tissu à 30 μm sur un microtome dans le sens transversal et les monter sur la lame.
  2. Ajouter la solution bloquante avec 3% de sérum d’âne normal et 0,3% de Triton X-100 dans 0,1 M PB et incuber les sections pendant 30 min à température ambiante.
  3. Retirer la solution bloquante et incuber les sections avec la solution contenant les anticorps primaires de l’anti-CGRP monoclonal de souris (1:500) et de l’anticorps polyclonal anti-LYVE1 de mouton (1:500) dans un tampon de dilution pendant la nuit à 4 °C.
  4. Le lendemain, laver les coupes de tissu avec 0,1 M PB (pH 7,4) trois fois, ajouter la solution mélangée contenant les anticorps secondaires de l’âne anti-souris IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) et de l’âne anti-mouton IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), ainsi que de la phalloïdine Alexa-Flour594 (1:1000) sur les sections et incuber pendant 1 h à température ambiante.
  5. Avant l’observation microscopique, laver les sections dans 0,1 M PB (pH 7,4) trois fois, puis les recouvrir de couvercles dans 50% de glycérine.

4. Imagerie et analyses

  1. Observez les échantillons colorés sous un microscope fluorescent, puis prenez les images à l’aide d’un microscope confocal.
  2. Capturez 30 images (piles Z), chacune dans des images de 10 μm, de chaque section de 300 μm d’épaisseur et intégrez une seule image mise au point à l’aide d’un processeur d’image du système de microscopie confocale (voir Tableau des matériaux).
    1. Effectuez les étapes suivantes dans le logiciel de traitement d’image de la configuration confocale pour l’analyse tridimensionnelle (3D) : Définir le plan focal de départ | Définir le plan focal d’extrémité | Définir la taille des | Choisissez le motif de profondeur | | de capture d’image Série Z.
      REMARQUE: Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission des signaux de fluorescence bleue étaient respectivement de 401 nm et 421 nm. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission des signaux de fluorescence verte étaient respectivement de 499 nm et 519 nm. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission des signaux de fluorescence rouge étaient respectivement de 591 nm et 618 nm. 152 μm est le diamètre du sténopé confocal (objectif 10x, NA: 0,4). La résolution de capture d’image était de 1024 × 1024 pixels.
  3. Pour les échantillons conventionnels (étape 3), capturez 30 images (piles Z) dans des images de 1 μm de chaque section de 30 μm d’épaisseur et traitez ces images comme mentionné ci-dessus (étapes 4.1-4.2).
  4. Démontrez les images dans le modèle de reconstruction 3D avec le système de traitement d’image.
  5. Effectuez des reconstructions 3D en important des images confocales Z-stack dans Imaris 9.0 (logiciel d’imagerie cellulaire, voir Tableau des matériaux) et créez des rendus de surface basés sur l’intensité des taches : Ajoutez de nouvelles surfaces | Choisissez le canal source | Déterminez les paramètres dans l’option lisse de Surfaces Detail | Déterminez les paramètres dans l’option de seuil de l’intensité absolue | Classer les surfaces | Terminer.
  6. Acquérir des données dans la surface des fibres nerveuses positives avec le logiciel d’imagerie cellulaire. Sélectionnez l’image rendue | Statistiques | | détaillées Valeurs spécifiques | Volume.

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Résultats

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Après une triple coloration fluorescente, les fibres nerveuses, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques ont été clairement marqués avec CGRP, phalloïdine et LYVE1, respectivement, dans la peau poilue et glabre (Figure 3,4). Avec le traitement de nettoyage, les fibres nerveuses CGRP positives, les vaisseaux sanguins phalloïdine positifs et les vaisseaux lymphatiques LYVE1 positifs peuvent être imagés à une plus grande profondeur pour acquérir l’information struct...

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Discussion

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La présente étude fournit une démonstration détaillée des fibres nerveuses cutanées dans la peau poilue et glabre en utilisant l’immunofluorescence sur des sections de tissus plus épaisses avec un traitement de nettoyage et une vue 3D pour mieux comprendre l’innervation de la peau. Le temps d’incubation des anticorps allant jusqu’à 1-2 jours et un processus de nettoyage de nuit sont importants. Ces deux étapes clés affectent directement l’effet de coloration par immunofluorescence des sections épaisses. Un autre problème...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par le Fonds d’innovation de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (Code de projet no. CI2021A03404) et le Fonds national d’innovation interdisciplinaire en médecine traditionnelle chinoise (Code de projet no. ZYYCXTD-D-202202).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x solution saline tamponnée au phosphateSolarbio Life SciencesP1020pH 7,2-7,4, 0,01 Mol
2,2,2-TribromoethanolSigma Life ScienceT48402-5G
Microscopie confocale à fluorescenceOlympus CorporationFluoview FV1200
Donkey anti-souris IgG H& L Alexa-Flour488Abcam plc.ab150105
Âne anti-mouton IgG H& L Alexa-Flour405Abcam plc.ab175676
Tube EPWuxi NEST Biotechnology Co.6150011,5 mL
Platine de congélation Système de microtome coulissantLeica BiosystemsCM1860
Imaris SoftwareOxford Instrumentsv.9.0.1
IRIS standard ciseauxWPI (World Precision Instruments Inc.)
iSpacerSunJin Lab co.IS005
Micro forceps-StrRWDF11020-11
Anticorps monoclonal anti-CGRPde souris Santa cruz biotechnology, Inc.sc-57053
Formol à tampon neutreSolarbio Life SciencesG216110 %
Sérum d’âne normalJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-1210 mL
Pompe péristaltiqueLonger Precision Pump Co., LtdBT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594Thermo Fisher ScientificA12381
RapiClear 1.52 solutionSunJin Lab co.RC15200110 mL
Agarose régulièreGene Company LimitedG-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-StrRWDF13038-12
Mouton polyclonal anti-LYVE1 anticorpsR& D Systems, Inc.AF7939
Plaque à six puitsCorning Incorporated3335
Azoture de sodiumSigma Life ScienceS200225 g
SaccharoseSigma Life ScienceV900116500 g
Super GlueHenkel AG & Co.Pattex 502
Poignées chirurgicalesRWDS32003-12
Triton X-100Solarbio Life Sciences9002-93-1100 mL
UrethaneSigma Life ScienceU2500500 g
VANNAS ciseaux à ressortRWDS1014-12
Microtome vibrantLeica BiosystemsVT1200S
503242

Références

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