Mesure directe des forces dans les faisceaux de microtubules actifs reconstitués

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour reconstituer des faisceaux de microtubules in vitro et quantifier directement les forces exercées en leur sein en utilisant le piégeage optique simultané et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Ce test permet de mesurer à l’échelle nanométrique les forces et les déplacements générés par les ensembles de protéines au sein de réseaux de microtubules actifs.

Résumé

Les réseaux de microtubules sont utilisés dans les cellules pour accomplir un large éventail de tâches, allant de l’action en tant que pistes pour le transport des vésicules au travail en tant que réseaux spécialisés pendant la mitose pour réguler la ségrégation chromosomique. Les protéines qui interagissent avec les microtubules comprennent des moteurs tels que les kinésines et la dynéine, qui peuvent générer des forces actives et des mouvements directionnels, ainsi que des protéines non motrices qui réticulent les filaments dans des réseaux d’ordre supérieur ou régulent la dynamique des filaments. À ce jour, les études biophysiques des protéines associées aux microtubules se sont massivement concentrées sur le rôle des protéines monomotrices nécessaires au transport des vésicules, et des progrès significatifs ont été réalisés dans l’élucidation des propriétés génératrices de force et de la régulation mécanochimique des kinésines et des dynéines. Cependant, pour les processus dans lesquels les microtubules agissent à la fois comme cargaison et piste, comme lors du glissement du filament dans la broche mitotique, on comprend beaucoup moins la régulation biophysique des ensembles de protéines de réticulation impliquées. Ici, nous détaillons notre méthodologie pour sonder directement la génération de force et la réponse dans les réseaux minimaux de microtubules réticulés reconstitués à partir de microtubules purifiés et de protéines mitotiques. Les paires de microtubules sont réticulées par des protéines d’intérêt, un microtubule est immobilisé sur une lame de couverture de microscope et le deuxième microtubule est manipulé par un piège optique. La microscopie simultanée à fluorescence par réflexion interne totale permet une visualisation multicanal de tous les composants de ce réseau de microtubules lorsque les filaments s’écartent pour générer de la force. Nous démontrons également comment ces techniques peuvent être utilisées pour sonder les forces de poussée exercées par les ensembles kinésine-5 et comment les forces de freinage visqueuses apparaissent entre les paires de microtubules glissantes réticulées par le MAP PRC1 mitotique. Ces tests donnent un aperçu des mécanismes d’assemblage et de fonction des fuseaux et peuvent être plus largement adaptés pour étudier la mécanique du réseau de microtubules denses dans divers contextes, tels que l’axone et les dendrites des neurones et des cellules épithéliales polaires.

Introduction

Les cellules utilisent des réseaux de microtubules pour effectuer une grande variété de tâches mécaniques, allant du transport des vésicules ^1,2,3 à la ségrégation chromosomique pendant la mitose 4,5,6. De nombreuses protéines qui interagissent avec les microtubules, telles que les protéines motrices moléculaires kinésine et dynéine, génèrent des forces et sont régulées par des charges mécaniques. Pour mieux comprendre le fonctionnement de ces molécules critiques, les chercheurs ont....

Protocole

1. Préparation des microtubules

REMARQUE: Lors de l’utilisation de protéines de réticulation marquées GFP, rouge (par exemple, rhodamine) et rouge lointain (par exemple, HiLyte647 biotinylé, appelé rouge lointain biotinylé dans le reste du texte), le marquage fluorophore organique des microtubules fonctionne bien. Une diaphonie minimale entre les trois canaux peut être obtenue pendant l’imagerie en utilisant un filtre de fluorescence interne totale (TIRF) quadribande de haute qualité.

1. Préparer les stocks de semences de microtubules GMPCPP
   1. Mettre en suspension 1 mg de tubuline lyophilisée non marquée dans 84....

Résultats

La préparation de faisceaux de microtubules adaptés à l’analyse biophysique est considérée comme réussie si plusieurs des critères clés sont remplis. Tout d’abord, l’imagerie en trois couleurs devrait révéler deux microtubules alignés avec une concentration de protéine de réticulation décorant préférentiellement la région de chevauchement (Figure 5B, C et Figure 6B). Idéalement, la distance entre le bord de chevauchement et l’ex.......

Discussion

Les réseaux de microtubules sont utilisés par une myriade de types de cellules pour accomplir un large éventail de tâches qui sont fondamentalement de nature mécanique. Afin de décrire comment les cellules fonctionnent à la fois dans les états sains et pathologiques, il est essentiel de comprendre comment ces réseaux à l’échelle du micron sont organisés et régulés par les protéines de taille nanométrique qui les construisent collectivement. Les outils biophysiques tels que les pinces optiques sont bien adaptés pour sonde.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Laser à fibre d’ytterbium 10W, 1064nm	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set pour applications TIRF Chroma		TRF89901v2
6x His Tag Anticorps, conjugué de biotine	Invitrogen	#MA1-21315-BTIN
Acétone, grade HPLC	Fisher Scientific	18-608-395
Caséine alpha de lait de vache	Sigma	1002484390
ATP	Fisher Scientific	BP413-25
Benzonase	Novagen	70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000	Laysan Bio, Inc.
BL21 (DE3) Rosetta Cells	Millipore Sigma	71-400-3
Catalase	MP Biomedicals LLC	190311
CFI Apo 100X/1.49NA immersion dans l’huile TIRF objectif	Nikon	N/A
Chloramphénicol	ACROS Organics	227920250
Coverslip Mini-Rack, pour 8 lamelles	Fisher Scientific	C14784
Delicate Task Essuie-glaces	Kimberly-Clark	34120
Dextrose anhydre	Fisher Scientific	BP3501
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
DTT	Fisher Scientific	BP172-25
Ecoline Thermostat à immersion E100 avec 003 Bain	LAUDA-Brinkmann	27709
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
EGTA	Millipore Corporation	32462-25GM
FIJI / Image J	https://fiji.sc/	N/A
Lames de microscope givrées	Corning	12-553-10	75mmx25mm, avec une épaisseur de 0,9-1,1mm
Glucose oxydase	MP Biomedicals LLC	195196	Type VII, sans oxygène ajouté
GMPCPP	Jena Biosciences	JBS-NU-405S	Peut être stocké pendant plusieurs mois à -20 ° ; C et jusqu’à un an à -80 ° ; C
Gold Seal-Cover Glass	Thermo Scientific	3405
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Imidazole	Fisher Scientific	03196-500
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
Dessiccateur de laboratoire	Bel-Art	999320237	190mm taille de plaque
Sulfate de kanamycine	Fischer Scientific	BP906-5
KIF5A K439 (aa :1-439)-6His	Gilbert Lab, RPI	N/A	doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe	Kimberley Clark	Z188956	tissulaire non pelucheuse
, type B	Cargille	16484
Tissu d’objectif	ThorLabs	MC-5
LuNA Lancement laser (4 canaux : 405, 488, 561, 640nm)	Nikon	N/A
Lysozyme	MP Biomedicals LLC	100834
Acétate de magnésium tétrahydraté	Fisher Scientific	BP215-500
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
MPEG-SVA MW-5000	Laysan Bio, Inc.
Neutravadin	Invitrogen	PI31000
Nikon Ti-E microscope inversé	Nikon	N/A	Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Résine	Thermo Scientific	88221
Oligonucléotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC	IDT	N/A
Oligonucléotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG	IDT	N/A
Tube en polycarbonate à paroi épaisse à toit ouvert, 0,2 mL, 7 mm x 22 mm	Beckman Coulter	343755
Optima-TLX Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	361544
Paclitaxel (équivalent Taxol)	Thermo Fisher Scientific	P3456
PIPES	ACROS Organics	172615000
PMSF	Millipore	7110-5GM
Tubuline porcine, biotine label	Cytoskeleton, Inc.	T333P
Tubuline porcine, HiLyte 647 Fluor	Cytoskeleton, Inc.	TL670M	rouge lointain
Tubuline porcine,	cytosquelette	TL590M
Tubuline porcine,	Cytosquelette	T240
Acétate de potassium	Fisher Scientific	BP364-500
Prime 95B caméra sCMOS	Photométrique	N/A
Détecteur de quadrant Tête de capteur	ThorLabs	PDQ80A
Quikchange Lightning Kit	Agilent Technologies	210518
Bicarbonate de sodium	Fisher Scientific	S233-500
Phosphate de sodium dibasique anhydre	Fisher Scientific	BP332-500
Lunettes à couvercle carré	Corning	12-553-450	18 mm x 18 mm, avec une épaisseur de 0,13-0,17 mm
Microsphères de streptavidine	Polysciences Inc.	24162-1
Superose-6 Colonne	GE Healthcare	29-0915--96
TCEP	Thermo Scientific	77720
TLA-100 Rotor à angle fixe	Beckman Coulter	343840
Nettoyeur à ultrasons (sonicateur)	Vevor	JPS-08A(DD)	304 acier inoxydable, fréquence 40 kHz, puissance 60 W
Vectabond APTES solution	Vector Laboratories	SP-1800-7
Nettoyant pour vitres alimenté Windex avec Ammoniac-D	S.C. Johnson	SJN695237