Article de méthode

Puce de glomérule rénal isogénique conçue à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

DOI :

10.3791/63821

⸱

4 novembre 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole visant à concevoir un système personnalisé d’organe sur puce qui récapitule la structure et la fonction de la barrière de filtration glomérulaire rénal en intégrant des cellules endothéliales épithéliales et vasculaires génétiquement appariées différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Ce système de bio-ingénierie peut faire progresser la médecine de précision rénale et les applications connexes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’insuffisance rénale chronique (IRC) affecte 15% de la population adulte américaine, mais la mise en place de thérapies ciblées a été limitée par le manque de modèles fonctionnels capables de prédire avec précision les réponses biologiques humaines et la néphrotoxicité. Les progrès de la médecine rénale de précision pourraient aider à surmonter ces limites. Cependant, les modèles in vitro précédemment établis du glomérule rénal humain - le site principal pour la filtration du sang et une cible clé de nombreuses maladies et toxicités médicamenteuses - utilisent généralement des populations cellulaires hétérogènes avec des caractéristiques fonctionnelles limitées et des antécédents génétiques inégalés. Ces caractéristiques limitent considérablement leur application pour la modélisation de maladies spécifiques au patient et la découverte thérapeutique.

Cet article présente un protocole qui intègre l’épithélium glomérulaire (podocytes) dérivé de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS) et l’endothélium vasculaire d’un seul patient pour concevoir une puce de glomérule rénal microfluidique isogénique et vascularisée. La puce glomérule résultante est composée de couches de cellules endothéliales et épithéliales dérivées de cellules souches qui expriment des marqueurs spécifiques à la lignée, produisent des protéines de membrane basale et forment une interface tissu-tissu ressemblant à la barrière de filtration glomérulaire du rein. La puce de glomérule modifiée filtre sélectivement les molécules et récapitule les lésions rénales induites par les médicaments. La capacité de reconstituer la structure et la fonction du glomérule rénal à l’aide de types de cellules isogéniques crée la possibilité de modéliser la maladie rénale avec la spécificité du patient et de faire progresser l’utilité des organes sur puce pour la médecine rénale de précision et les applications connexes.

Introduction

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Les dispositifs d’organe sur puce sont des modèles 3D dynamiques in vitro qui utilisent la stimulation moléculaire et mécanique, ainsi que la vascularisation, pour former des interfaces tissus-tissus qui modélisent la structure et la fonction d’organes spécifiques. Les dispositifs d’organe sur puce précédemment établis qui visaient à récapituler le glomérule du rein (puces de glomérule) étaient constitués de lignées cellulaires animales1 ou de lignées cellulaires primaires et immortalisées humaines de sources hétérogènes 2,3. L’utilisation de sources cellulaires génétiquement h....

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Protocole

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1. Préparer les solutions de matrice membranaire basale et les substrats revêtus

  1. Décongeler la matrice 1 de la membrane basale pendant la nuit sur la glace à 4 °C. Aliquote selon la suggestion du fabricant pour le taux de dilution. À l’aide d’un tube conique et d’une pipette de 50 mL, bien mélanger une quantité appropriée de matrice membranaire basale 1 dans 25 mL de DMEM/F12 froid jusqu’à décongélation et dissolution complète.
    1. Pour dissoudre une aliquote congelée, prélever ~200 μL dans les 25 mL de DMEM/F12 froid et les transférer dans le tube aliquote congelé. Pipeter de haut en bas jusqu’à ce que la matrice soit complètement décon....

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Résultats

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Nous montrons ici qu’un modèle 3D in vitro fonctionnel du glomérule peut être vascularisé et épithélialisé à partir d’une source isogénique de cellules iPS humaines. Plus précisément, ce protocole fournit des instructions sur la façon d’appliquer la technologie des cellules iPS humaines, en particulier leur capacité à se différencier en types de cellules spécialisées, pour générer un épithélium glomérulaire rénal (podocytes) et un endothélium vasculaire (viCE) qui peuvent être intégrés à des dispositifs microflu.......

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Discussion

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Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour dériver l’endothélium vasculaire et l’épithélium glomérulaire (podocytes) à partir d’une lignée cellulaire iPS humaine isogénique et l’utilisation de ces cellules pour concevoir un système 3D d’organe sur puce qui imite la structure, l’interface tissu-tissu et la fonction de filtration moléculaire du glomérule rénal. Cette puce glomérule est équipée d’un endothélium et d’un épithélium glomérulaire qui, ensemble, constituent une barrière pour filtrer sélectivement les molé.......

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Déclarations de divulgation

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S.M. est un inventeur d’un brevet lié à la différenciation des podocytes par rapport aux cellules iPS humaines. L’autre auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Pratt School of Engineering de l’Université Duke, la Division de néphrologie du Département de médecine de Duke, une bourse Whitehead en recherche biomédicale et une bourse de recherche Genentech pour S. Musah. Y. Roye est récipiendaire de la bourse de la Duke University-Alfred P. Sloan Foundation et de la bourse d’études supérieures William M. « Monty » Reichert du département de génie biomédical de l’Université Duke. La lignée cellulaire UD11 (clone #11 de l’Université Duke) a été générée à l’installation principale de Duke iPSC et nous a été fournie par le laboratoire Bursac de l’Université Duke. Les auteurs remercient N. Abutaleb, J....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
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Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 594Thermo/Life TechnologiesA32744 ; A32754 ; A-11076 ; A32790 ; A21203 ; A11015
Collagène IVThermo/Life Technologies14-9871-82
NéphrineProgenGP-N2
PECAM-1R& D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
Matrices de membrane basale
Corning Fibronectin, HumanCorning356008Membrane basale (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentIwai North AmericaN8922012Matrice de membrane basale (2)
Matrice qualifiée hESC Matrigel, fiole de 5 mLBD Biosciences354277(1) ; peut présenter une variation d’un lot à l’autre
Cellules
fortesDU11cellules iPS humainesLa lignée cellulaire iPS DU11 (clone #11 de l’Université Duke) a été générée à la plateforme iPSC de Duke et nous a été fournie par le laboratoire Bursac de l’Université Duke. La lignée a été testée et s’est avérée exempte de mycoplasmes (dernier test en novembre 2021) et d’anomalies du caryotype (juillet 2019)
Culture medium facteurs de croissance et suppléments de milieu
0.5M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
2-MercaptoethanolThermo/Life Technologies21985023
Albumine de sérum bovin, Texas Red conjuguéThermo/Life TechnologiesA23017
Acide rétinoïque tout-trans (500 mg)Stem Cell Technologies72262
Supplément sans sérum B27Thermo/Life Technologies17504044
supplément B-27 (50x) sans vitamine AThermo/Life Technologies12587010
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004Peut présenter une variation d’un lot à l’autre
Kit complet de milieux avec milieux de culture CultureBoost-RCell Systems4Z0-500-R
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies12634028
DMEM/F12 avec supplément GlutaMAXThermo/Life Technologies10565042DMEM/F12 avec glutamine
Forskoline (activateur de l’adénylyl cyclase)Abcamab120058
Supplément de glutaMAXThermo/Life Technologies35050061supplément de glutamine
FBS inactivé par la chaleurThermo/Life Technologies10082147
solution d’héparineStem Cell Technologies7980
Human Activin AThermo/Life TechnologiesPHC9544
Humain BMP4Preprotech120-05ET
Humain BMP7Thermo/Life TechnologiesPHC9544
Humain VEGFThermo/Life TechnologiesPHC9394
Inulin-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 mediumStem Cell Technologies05850Milieux de culture cellulaire iPS humains (CCM). Ajouter 5x supplément selon le fabricant. Human iPS CCM peut être stocké jusqu’à 6 mois à -20 °C.
N-2 Supplément (100x)Thermo/Life Technologies17502048
Milieux neurobasauxThermo/Life Technologies21103049Mésoderme latéral Milieu basal
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)Thermo/Life Technologies14190-250
Pénicilline-streptomycine liquide (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK inhibiteur (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011Milieu de culture cellulaire endothéliale (CCM). Ajouter un supplément selon le fabricant. La CCM endothéliale peut être conservée jusqu’à deux semaines à 4 ° ; C ou -20 ° ; C jusqu’à 6 mois.
Inhibiteur du TGF-Bêta (SB431542)Stem Cell Technologies72234
Enzymes et autres réactifs
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Tampon de détachement
cellulaire Dimethyl Suloxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
, 70 % (vol/vol), qualitébiotechnologique VWR97065-058
Paraformaldéhyde (PFA)Thermo/Life Technologies28906
Eau distillée stérileThermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05 %Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) Module de moyeuEmulateORB-HM1
Boîte de Pétri ronde 100mm x 15 mmFisherbrandFB087579B
120 x 120 mm Boîte de culture cellulaire carréeVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
Pipettes aspirantes, emballées individuellementCorning29442-462
Unité d’aspirationSP Bel-ArtF19917-0150
Centrifugeuse Avanti J-15RBeckman CoulterB99516
Tube à centrifuger conique, 15 mLCorning352097
Tube à centrifuger conique, 50 mLCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000Microscope fluorescent pour prendre des images de Cellules.
HémocytomètreVWR100503-092
Heracell VIOS 160i Incubateur CO2Thermo/Life Technologies51030403
Zeiss inversé Axio Observer équipé d’une caméra AxioCam 503Carl Zeiss Micrscopy491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(caméra)
Kimberly-Clark gants en nitrileVWR40101-346
Kimwipes, grandVWR21905-049
Leoca SP8 Microscope
Réservoir de média (POD Portable Module)ÉmulerPOD-1
Agitateur de microplaquesVWR12620-926
Puce d’organeEmulateS-1 Puce
Porte-puce d’orgueÉmulerAK-CCR
P10 pointes de pipette barrière de précisionDenville ScientificP1096-FR
P100 pointes de pipette barrièreDenville ScientificP1125
P1000 pointes de pipette barrièreDenville ScientificP1121
P20 pointes de pipette barrièreDenville ScientificP1122
P200 pointes de pipette barrièreDenville ScientificP1122
Plasma AsherQuorum techK1050X RFCe graveur/Asher/nettoyeur plasma a été utilisé dans le cadre de l’installation d’instrumentation des matériaux partagés (SMiF) de l’Université Duke.
Tube à essai en polystyrène à fond rond avec filtre à cellulesPipetteCorning 352235
10 mL, emballée individuellementCorning356551
Pipette sérologique, 25 mL, emballée individuellementCorning356525
Pipette sérologique, 5 mL, emballée individuellementCorning356543
Steriflip, 0,22 & micro ; m, PESEMD MilliporeSCGP00525
Tubes de microcentrifugation stérilesThomas Scientific1138W14
T75cm2 flacon de culture cellulaire avec capuchon d’aérationCorning430641U
Plaques 12 puits traitées pour culture tissulaireCorning353043
Plaques 6 puits traitées pour culture tissulaireCorning353046
Modulateur de vide et pompe perstaltique (Zoe Culture Module)ÉmulerZOE-CM1Bioréacteur à puce d’organe
VE-Cadherin CD144 Anticorps anti-humain - APC conjuguéMiltenyi Biotec130-126-010
Élévateur de cellules à large biseauCorning3008
MACS
CD144 Microbilles, humainMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 MicroBead Kit, humainMiltenyi Biotec130-091-935
LS colonnesMiltenyi Biotec130-042-401
Anticorps secondaires conjugués Matrice de membrane basale Solution d’éthanolconfocal droit sérologique ,

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripot....

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Mots-clés

Organe sur puce isog niqueBarri re de filtration glom rulaireDiff renciation des podocytesCellules endoth liales vasculairesPuce microfluidiqueTest de n phrotoxicitM decine de pr cisionMod lisation de maladies sp cifique au patient

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