Le protocole présente une méthode pour isoler les lysats de protéines de cellules entières des processus faciaux d’embryons de souris disséqués ou de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires de souris cultivées et effectuer un transfert occidental ultérieur pour évaluer les niveaux de protéines phosphorylées.
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Article de méthode
Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Ces changements morphologiques sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Ici, deux exemples de contextes physiologiquement pertinents dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymates palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5. Pour surmonter la barrière commune de la déphosphorylation lors de l’isolement des protéines, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des phosphoprotéines sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des phosphoprotéines après le transfert western des lysats de protéines de cellules entières. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses phosphoprotéines actives au cours du développement craniofacial.
Introduction
Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Chez la souris, ce processus commence au jour embryonnaire (E) 9,5 avec la formation de la proéminence frontonasale et de paires de processus maxillaires et mandibulaires, chacun contenant des cellules de la crête neurale crânienne post-migratoire. Les processus nasaux latéraux et médiaux proviennent de la proéminence frontonasale avec l’apparition des fosses nasales et finissent par fusionner pour former les narines. De plus, les processus nasaux médiaux et les processus maxillaire....
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado et effectuées conformément aux directives et réglementations de l’établissement. Des souris femelles 129S4 âgées de 1,5 à 6 mois et logées à une température sous-thermoneutre de 21 à 23 °C ont été utilisées pour les récoltes d’embryons. Un flux de travail schématique du protocole est représenté à la figure 1. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux, équipements, logiciels, réactifs et animaux utilisés d....
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Résultats
Lorsque l’on tente de caractériser la phosphorylation de protéines isolées à partir de processus faciaux de souris et/ou de cellules de mésenchyme palatales cultivées, les résultats représentatifs révéleront idéalement une bande distincte et reproductible après un transfert western avec un anticorps anti-phosphoprotéine qui se situe à la hauteur ou près de la hauteur de la bande protéique totale correspondante (Figure 3 ). Cependant, si une phosphorylation étendue de la protéine se produit, .......
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Discussion
Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de sonder les événements critiques de signalisation dépendant de la phosphorylation au cours du développement craniofacial de manière robuste et reproductible. Ce protocole comporte plusieurs étapes essentielles qui garantissent une collecte appropriée des données et une analyse des résultats. Qu’il s’agisse d’isoler des phosphoprotéines des processus faciaux de souris et/ou de cultiver des cellules de mésenchyme palatal, il est impératif de se déplacer rapidement et efficace.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
129S4 souris étaient un cadeau du Dr Philippe Soriano, Icahn School of Medicine à Mount Sinai. Ce travail a été soutenu par des fonds des National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 et K02 DE028572 à K.A.F., F31 DE029976 à M.A.R. et F31 DE029364 à B.J.C.D.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Bloc pour mini bain sec | Research Products International Corp | 400783 | |
| Système d’imagerie ChemiDoc XRS+ avec logiciel Image Lab | Bio-Rad | 1708265 | imageur de chimiluminescence |
| CO2, incubateur | VWR | 10810-902 | |
| panneau, 11 x 13 po | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Cellule d’électrophorèse, 4 gels, pour mini-gels préfabriqués avec mini module trans-blot | Bio-Rad | 1658030 | |
| Microcentrifugeuse 5415 D avec rotor F45-24-11 (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini bain sec | Produits de recherche International Corp | 400780 | |
| Agitateur orbital | VWR | 89032-092 | |
| PH-mètre | VWR | 89231-662 | |
| Alimentation pour SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Bac à glace rectangulaire, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 Stéréomicroscope avec support K LAB, LED éclairage annulaire | Zeiss | 4350649020000000 | microscope de dissection |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Revolver à tube | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Mélangeur vortex | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Bain-marie | VWR | 89501-472 | |
| Boîte à transfert western | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| MatériauxBoîtes de | |||
| culture cellulaire, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Plaques de culture cellulaire, 12 puits | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Élévateurs de cellules | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Tubes coniques, polypropylène, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Pince fine Dumont #5 | Outils de science fine | 11254-20 | |
| Cuillère à embryon | Outils de science fine | 10370-17 | |
| Tubes de microcentrifugation, 0,5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Tubes de microcentrifugation, 1,5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pipette Pasteur, 5,75" | Fisher Pipette Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Boîtes de Pétri, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Boîtes de Pétri, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Sachets, transparents, doublure en polyéthylène | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| Membrane PVDF | Fisher | Scientific IPVH00010 | |
| Pince Semken | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Petite poire en latex, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Ciseaux chirurgicaux | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Filtre à seringue, 25 mm, 0.2 &mu ; taille des pores | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Seringue avec embout Luer, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Pipette de transfert | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Levier d’ouverture de la cassette Western blot | Bio-Rad | 4560000 | |
| Papier de chromatographie Whatmann 3MM chr | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Réactifs | |||
| 4-15 % Gels de protéines préfabriquées, 10 puits, 30 & micro ; L | Bio-Rad | 4561083 | |
| &beta ;-glycérophosphate hydrate de sel disodique | Sigma Aldrich | G5422-25G | concentration de stock 1 M |
| &beta ;-mercaptoéthanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Albumine sérique bovine, fraction V, testée contre les chocs thermiques | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bleu de bromophénol | Fisher Scientific | ||
| Cocktail complet de mini-inhibiteurs de protéase | Sigma Aldrich | 11836153001 | concentration en stock 25x |
| DC kit de dosage des protéines II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, haute teneur en glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, anticorps primaire monoclonal bêta-tubuline de souris, concentré 0,1 mL | Études de développement Hybridoma Bank | E7 | 1:1 000 |
| Substrat de transfert western ECL | Fisher Scientific | PI32106 | faible plage de picogrammes |
| Substrat de transfert western ECL | Genesee Scientific | 20-302B | à faible plage de femtogramme |
| Tampon d’électrophorèse, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | concentration de stock 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Acide éthylènediaminetétraacétique, sel Di Na dihydrique. (Powd. cristallin/Électrophore.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Sérum fœtal bovin, caractérisé, origine américaine, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycérol (certifié ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Anticorps secondaire conjugué HRP, chèvre anti-souris | IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20 000 |
| Anticorps secondaire conjugué HRP, chèvre anti-lapin IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20 000 |
| Solution d’acide chlorhydrique, 6N (certifié) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 détergent non ionique | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | concentration de stock 200 mM |
| Méthanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorps primaire | Technologie de signalisation cellulaire | 9102S | 1:1 000 ; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB ligand recombinant, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| Récepteur PDGF &bêta ; anticorps primaire | Technologie de signalisation cellulaire | 3169S | 1:1 000 |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15140122 | concentration de stock 100 U/mL, 100 & micro ; g/mL |
| de fluorure de phénylméthanesulfonyle, 99 % | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF ; concentration de stock 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorps primaire | Technologie de signalisation cellulaire | 9101S | 1:1 000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Récepteur phospho-PDGF et alpha ; /Récepteur PDGF &bêta ; anticorps primaire | Technologie de signalisation cellulaire | 3170S | 1:1 000 |
| Chlorure de potassium (cristaux blancs) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Phosphate de potassium monobasique (cristaux blancs) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10 % | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Chlorure de sodium (cristallin/biologique, certifié) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Fluorure de sodium (poudre/certifié ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF ; aliquote à usage unique ; concentration de la matière 1 M |
| Orthovanadate de sodium, 99 % | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4 ; concentration de la matière 100 mM |
| Phosphate dibasique de sodium anhydre (granulaire ou en poudre/certifié ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Culture tissulaire PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Tampon de transfert, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | 10x |
| base Tris (cristaux blancs ou poudre cristalline/biologie moléculaire) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsine | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Marqueur de poids moléculaire par transfert Western | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 | souris | don du Dr Philippe Soriano, École de médecine Icahn au Mont Sinaï |
Références
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
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Réimpressions et autorisations
