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Article de méthode

Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines

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DOI :

10.3791/63834

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1 avril 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le protocole présente une méthode pour isoler les lysats de protéines de cellules entières des processus faciaux d’embryons de souris disséqués ou de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires de souris cultivées et effectuer un transfert occidental ultérieur pour évaluer les niveaux de protéines phosphorylées.

Résumé

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Ces changements morphologiques sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Ici, deux exemples de contextes physiologiquement pertinents dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymates palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5. Pour surmonter la barrière commune de la déphosphorylation lors de l’isolement des protéines, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des phosphoprotéines sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des phosphoprotéines après le transfert western des lysats de protéines de cellules entières. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses phosphoprotéines actives au cours du développement craniofacial.

Introduction

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Chez la souris, ce processus commence au jour embryonnaire (E) 9,5 avec la formation de la proéminence frontonasale et de paires de processus maxillaires et mandibulaires, chacun contenant des cellules de la crête neurale crânienne post-migratoire. Les processus nasaux latéraux et médiaux proviennent de la proéminence frontonasale avec l’apparition des fosses nasales et finissent par fusionner pour former les narines. De plus, les processus nasaux médiaux et les processus maxillaires fusionnent pour générer la lèvre supérieure. Parallèlement, la palatogenèse est initiée par la formation d’excroissances distinctes - les plateaux palataux secondaires - du côté oral des processus maxillaires à E11.5. Au fil du temps, les étagères palatines se développent vers le bas de chaque côté de la langue, s’élèvent à une position opposée au-dessus de la langue et finissent par fusionner à la ligne médiane pour former un palais continu qui sépare les cavités nasale et buccale par E16.51.

Ces changements morphologiques tout au long du développement craniofacial sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Par exemple, les récepteurs de la membrane cellulaire, tels que les sous-familles de récepteurs β du facteur de croissance transformant (TGF), y compris les récepteurs de protéines morphogénétiques osseuses (BMPR) et diverses familles de récepteurs tyrosine kinase (RTK), sont autophosphorylés lors de la liaison et de l’activation du ligand dans les cellules de la crête neurale crânienne 2,3,4 . De plus, le récepteur transmembranaire couplé à la protéine G Smoothened devient phosphorylé dans les cellules de la crête neurale crânienne et l’ectoderme craniofacial en aval de la liaison du ligand sonic hedgehog (SHH) au récepteur Patched1, ce qui entraîne une accumulation lissée au niveau de la membrane ciliaire et une activation de la voie SHH5. De telles interactions ligand-récepteur peuvent se produire par signalisation autocrine, paracrine et / ou juxtacrine dans des contextes craniofaciaux. Par exemple, BMP6 est connu pour signaler de manière autocrinale lors de la différenciation des chondrocytes6, tandis que le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 8 est exprimé dans l’ectoderme de l’arc pharyngé et se lie aux membres de la famille FGF des RTK exprimés dans le mésenchyme de l’arc pharyngé de manière paracrine pour initier le modelage et l’excroissance des arcs pharyngés7, 8,9,10. En outre, la signalisation Notch est activée dans les chondrocytes et les ostéoblastes pendant le développement du squelette craniofacial par la signalisation juxtacrine lorsque les ligands transmembranaires Delta et / ou Jagged se lient aux récepteurs Transmembranaires Notch sur les cellules voisines, qui sont ensuite clivés et phosphorylés11. Cependant, il existe d’autres paires de ligands et de récepteurs importantes pour le développement craniofacial qui ont la flexibilité de fonctionner à la fois dans la signalisation autocrine et paracrine. À titre d’exemple, au cours de la morphogenèse des dents murines, il a été démontré que le ligand PDGF)-AA du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)-AA signale de manière autocririne pour activer le RTK PDGFRα dans l’épithélium12 de l’organe de l’émail. En revanche, dans les processus faciaux murins au milieu de la gestation, les transcriptions codant pour les ligands PDGF-AA et PDGF-CC sont exprimées dans l’ectoderme craniofacial, tandis que le récepteur PDGFRα est exprimé dans le mésenchyme dérivé de la crête neurale crânienne sous-jacente, ce qui entraîne une signalisation paracrine 13,14,15,16,17 . Quel que soit le mécanisme de signalisation, ces événements de phosphorylation des récepteurs entraînent souvent le recrutement de protéines adaptatrices et/ou de molécules de signalisation, qui se phosphorylent fréquemment elles-mêmes pour initier des cascades de kinases intracellulaires telles que la voiemapk(e) de la protéine kinase activée par le mitogène (MAPK) 18,19.

Les effecteurs intracellulaires terminaux de ces cascades peuvent alors phosphoryler un ensemble de substrats, tels que les facteurs de transcription, la liaison à l’ARN, les protéines de matrice cytosquelettique et extracellulaire. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 et Sox926 font partie des facteurs de transcription phosphorylés dans le contexte du développement craniofacial. Cette modification post-traductionnelle (PTM) peut affecter directement la susceptibilité aux PTM alternatifs, la dimérisation, la stabilité, le clivage et/ou l’affinité de liaison à l’ADN, entre autres activités 20,21,25,26. De plus, la protéine de liaison à l’ARN Srsf3 est phosphorylée dans le contexte du développement craniofacial, ce qui conduit à sa translocation nucléaire27. En général, il a été démontré que la phosphorylation des protéines de liaison à l’ARN affecte leur localisation subcellulaire, les interactions protéine-protéine, la liaison à l’ARN et / ou la spécificité de la séquence28. En outre, la phosphorylation de l’actomyosine peut entraîner des réarrangements cytosquelettiques tout au long du développement craniofacial29,30, et la phosphorylation des protéines de la matrice extracellulaire, telles que les petites glycoprotéines liées à l’azote du ligand liant l’intégrine, contribue à la biominéralisation au cours du développement du squelette31. À travers ce qui précède et de nombreux autres exemples, il est évident qu’il existe de vastes implications pour la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial. En ajoutant un niveau supplémentaire de régulation, la phosphorylation des protéines est encore modulée par les phosphatases, qui contrecarrent les kinases en éliminant les groupes phosphate.

Ces événements de phosphorylation aux niveaux du récepteur et de la molécule effectrice sont essentiels pour la propagation des voies de signalisation et entraînent finalement des changements dans l’expression des gènes dans le noyau, entraînant des activités cellulaires spécifiques, telles que la migration, la prolifération, la survie et la différenciation, qui entraînent une formation correcte du visage des mammifères. Compte tenu de la spécificité contextuelle des interactions protéiques avec les kinases et les phosphatases, des changements qui en résultent dans les PTM et de leurs effets sur l’activité cellulaire, il est essentiel que ces paramètres soient étudiés dans un cadre physiologiquement pertinent pour acquérir une compréhension complète de la contribution des événements de phosphorylation au développement craniofacial. Ici, des exemples de deux contextes dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines et, par conséquent, l’activation des voies de signalisation au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymes palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5 - à la fois primaires32 et immortalisées33 . À E11.5, les processus maxillaires sont en train de fusionner avec les processus nasaux latéraux et médiaux1, représentant ainsi un point temporel critique pendant le développement craniofacial de la souris. En outre, les processus maxillaires et les cellules dérivées des plateaux palataux ont été choisis ici parce que ces dernières structures sont des dérivés de la première, offrant ainsi aux chercheurs la possibilité d’interroger la phosphorylation des protéines in vivo et in vitro dans des contextes connexes. Cependant, ce protocole est également applicable aux processus faciaux alternatifs et aux points temporels de développement.

Un problème critique dans l’étude des protéines phosphorylées est qu’elles sont facilement déphosphorylées lors de l’isolement des protéines par des phosphatases environnementales abondantes. Pour surmonter cette barrière, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des protéines phosphorylées sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des protéines phosphorylées. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses voies de signalisation actives au cours du développement craniofacial.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado et effectuées conformément aux directives et réglementations de l’établissement. Des souris femelles 129S4 âgées de 1,5 à 6 mois et logées à une température sous-thermoneutre de 21 à 23 °C ont été utilisées pour les récoltes d’embryons. Un flux de travail schématique du protocole est représenté à la figure 1. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux, équipements, logiciels, réactifs et animaux utilisés dans ce protocole.

1. Récolte d’embryons de souris E11.5

  1. Euthanasier la souris femelle 11,5 jours après la détection du bouchon vaginal lors de l’accouplement chronométré dans une chambre de CO2 en utilisant le débit de CO 2 approuvé parl’IACUC requis pour un déplacement d’environ 50% (2,95 L / min dans une chambre 360 dans3 ) et la durée d’exposition (voir tableau des matériaux). Effectuer la luxation cervicale comme méthode secondaire d’euthanasie. Procéder immédiatement à la dissection.
  2. Posez le corps de la souris sur une planche de dissection avec le côté ventral tourné vers le haut. Vaporisez l’abdomen de la souris avec 70% d’éthanol.
  3. Ouvrez la cavité abdominale en pinçant et en soulevant la peau antérieure à l’ouverture vaginale avec une pince Semken droite et en coupant la peau soulevée et les couches sous-jacentes avec des ciseaux chirurgicaux à lame droite à un angle de 45 ° de chaque côté pour générer une forme en « V » qui s’étend à chaque surface latérale à peu près à mi-chemin entre les membres antérieurs et les membres postérieurs.
  4. À l’aide de la pince Semken, saisissez l’une des cornes utérines et coupez sous l’oviducte et au-dessus du col de l’utérus avec les ciseaux chirurgicaux. Coupez le mésomètre pour permettre l’élimination complète de la corne utérine.
  5. Transférer la corne utérine disséquée dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate histologique (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasique, 10,14 mM Na2HPO4 dibasique, pH 7,4] dans une boîte de Pétri de 10 cm.
  6. Retirez la deuxième corne utérine du côté opposé de la cavité abdominale en utilisant la même procédure décrite aux étapes 1.4-1.5.
  7. Placez la boîte de Petri de 10 cm contenant les deux cornes utérines sur de la glace si vous ne procédez pas immédiatement à la dissection d’embryons individuels (c.-à-d. si une deuxième souris femelle est disséquée).
  8. Sous un stéréomicroscope disséquant, disséquez soigneusement chaque embryon des cornes utérines avec une pince fine Dumont #5. Retirez lentement le myomètre, le décidua et le chorion. Déchirez et retirez l’amnion relativement transparent entourant l’embryon et coupez le cordon ombilical reliant l’embryon au placenta.
  9. Transférer chaque embryon disséqué à 2,5 mL de PBS histologique dans un puits individuel d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits sur glace à l’aide d’une pipette de transfert en plastique coupée ou d’une cuillère à embryons.
    REMARQUE: Si vous travaillez avec une portée qui peut contenir des embryons de plus d’un génotype, conservez l’amnion entourant chaque embryon pour le génotypage en plaçant chacun dans son propre tube de microcentrifuge prémarqué de 0,5 mL sur de la glace.

2. Disséquer les processus maxillaires des embryons de souris E11.5

  1. Préparez trois boîtes de Petri de 10 cm contenant 10 mL de PBS histologique et conservez-les sur de la glace pour les utiliser en rotation entre les embryons.
  2. Transférer un embryon d’un puits individuel de la plaque de culture cellulaire de 12 puits à l’une des boîtes de Petri de 10 cm avec l’histologie PBS sur glace à l’aide d’une pipette de transfert en plastique coupé ou d’une cuillère à embryons.
  3. Sous le microscope à dissection, séparez chaque processus maxillaire du visage à l’aide de la pince fine. Tout d’abord, coupez la face antérieure d’un processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus nasal latéral et le processus maxillaire (Figure 2A).
  4. Deuxièmement, coupez la face postérieure du processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus maxillaire et le processus mandibulaire (Figure 2A).
  5. Troisièmement, pour séparer complètement le processus maxillaire, faites une coupe verticale des côtés antérieur à postérieur du processus maxillaire du côté oculaire du processus maxillaire où les indentations naturelles référencées ci-dessus se terminent (Figure 2A-C).
  6. Répétez ces trois coupes pour le processus maxillaire du côté opposé du visage.
  7. À l’aide d’un pipot Pasteur de 9 po avec une petite ampoule en latex de 2 mL, transférer la paire disséquée de procédés maxillaires et une petite gouttelette d’environ 30 μL de PBS histologique dans une boîte de Petri étiquetée de 35 mm sur de la glace (Figure 2D).
  8. Suivez les étapes 2.3 à 2.7 pour chaque embryon, en faisant pivoter les trois boîtes de Petri de 10 cm contenant du PBS histologique sur de la glace entre les embryons. Placez des paires individuelles de processus maxillaires disséqués dans des boîtes de Petri séparées de 35 mm sur de la glace.
    REMARQUE: La séparation de l’ectoderme maxillaire et du mésenchyme (étapes 2.9-2.17) peut être effectuée après avoir disséqué les processus maxillaires de tous les embryons de la portée. Si des processus maxillaires intacts contenant à la fois l’ectoderme et le mésenchyme sont souhaités, passez à l’étape 2.18 ci-dessous.
  9. Préparer 250 μL de trypsine fraîche à 2 % dans le PBS de culture tissulaire et 250 μL de sérum bovin fœtal (FBS) à 10 % dans le PBS de culture tissulaire et conserver sur glace.
  10. Placer une deuxième petite gouttelette d’environ 30 μL de trypsine à 2 % dans la boîte de Petri de 35 mm séparée de la première petite gouttelette de PBS histologique contenant les processus maxillaires. Transférer la paire de procédés maxillaires dans la petite gouttelette de trypsine à 2 % à l’aide de la pipette Pasteur (Figure 2D).
  11. Incuber le plat sur de la glace pendant 15 min.
  12. Retirez la boîte de Petri de 35 mm de la glace et placez-la sous le microscope à dissection.
  13. À l’aide de la pince fine, retirez lentement et soigneusement la couche d’ectoderme de chaque processus maxillaire (Figure 2E).
    REMARQUE: Si l’ectoderme ne se sépare pas du mésenchyme dans une feuille intacte, incuber dans 2% de trypsine à température ambiante (RT) jusqu’à 5 minutes supplémentaires avant de poursuivre la séparation. Si le tissu commence à se désintégrer dans la trypsine à 2%, déplacez les processus maxillaires vers le FBS à 10% comme décrit ci-dessous pour neutraliser la trypsine et terminer la séparation de l’ectoderme et du mésenchyme.
  14. Une fois que l’ectoderme et le mésenchyme du processus maxillaire sont séparés (Figure 2F), transférez les tissus souhaités de la paire de processus maxillaires à une troisième petite gouttelette d’environ 30 μL de 10% FBS - séparée des deux petites gouttelettes précédentes - à l’aide du pipet Pasteur (Figure 2D).
  15. Placez la boîte de Petri de 35 mm sur de la glace pour arrêter la trypsinisation.
  16. Incuber les tissus du processus maxillaire sur de la glace dans 10% FBS pendant 1-2 min, puis transférer les tissus des deux processus maxillaires à une quatrième petite gouttelette d’environ 30 μL de PBS histologique précroché sur glace - séparée des trois petites gouttelettes précédentes - à l’aide du pipot Pasteur (Figure 2D).
  17. Incuber les tissus du processus maxillaire dans le PBS d’histologie pendant 1 min tout en faisant tourbillonner doucement le PBS d’histologie autour des tissus du processus maxillaire avec la pointe du pipot Pasteur pour s’assurer que tout FBS est rincé du tissu.
  18. Transférer la paire de tissus maxillaires de traitement dans un tube de microcentrifugation marqué de 1,5 mL sur de la glace à l’aide de la pipette Pasteur, minimisant ainsi le transfert de PBS histologique. Enlever tout excès de PBS histologique dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec le pipet Pasteur.
  19. Suivez les étapes ci-dessus pour disséquer les processus maxillaires de chaque embryon de la portée.
  20. Traiter les échantillons immédiatement pour isoler les lysats de protéines cellulaires entières (ci-dessous) ou les stocker à -80 °C à long terme. Avant le stockage à long terme, congeler le tube de microcentrifugation de 1,5 mL dans un bain de 100 % d’EtOH sur de la glace carbonique pendant 5 min.

3. Isoler les lysats de protéines cellulaires entières des processus maxillaires de souris

  1. Si les procédés maxillaires ont déjà été congelés à -80 °C, décongelez-les sur de la glace.
  2. Ajouter 0,1 mL de tampon de lyse NP-40 glacé (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10 % de glycérol, 1 % de Nonidet P-40, 2 mM d’EDTA ; conservé à 4 °C) avec des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase (1x cocktail complet d’inhibiteurs de mini protéase [dissous dans l’eau ; conservé à -20 °C], 1 mM de PMSF [dissous dans de l’isopropanol ; stocké à 4 °C], 10 mM de NaF [entreposés à -20 °C; éviter le gel/dégel], 1 mM de Na3VO4 [entreposé à -20 °C], 25 mM de β-glycérophosphate [conservé à 4 °C]) ajoutés immédiatement avant utilisation sur glace.
    REMARQUE: Le fractionnement cellulaire peut également être effectué pour isoler les fractions de protéines cytoplasmiques, nucléaires, membranaires ou mitochondriales.
  3. Pipet de haut en bas 10 fois avec un pipetman de 200 μL.
  4. Vortex pendant 10 s, puis pipet de haut en bas 10 fois avec un pipetman de 200 μL. Évitez de générer des bulles.
  5. Incuber à 4 °C pendant 2 h en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 mL/2 mL avec un revolver à tube.
  6. Centrifuger les échantillons à 13 500 × g pendant 20 min à 4 °C.
  7. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL sur de la glace avec un pipimètre de 200 mL.
  8. Quantifier la concentration en protéines avec le kit d’analyse des protéines, en utilisant 10 μL de lysat de protéine + 10 μL de tampon de lyse NP-40 pour les échantillons expérimentaux et 3-5 dilutions d’albumine sérique bovine (fraction V) (BSA) dans le tampon de lyse NP-40 à une plage de 0,25-2,0 mg / mL comme étalons protéiques.
  9. Procéder à l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) (étape 5) ou congeler rapidement les lysats restants sur de la glace carbonique et les conserver à -80 °C à long terme.

4. Isoler les lysats de protéines cellulaires entières des cellules primaires et/ou immortalisées du mésenchyme palatal embryonnaire (MEPM) de souris

NOTE: L’isolement et la culture de cellules MEPM primaires à partir d’embryons de souris E13.5 et de cellules MEPM immortalisées ont déjà été décrits 32,33,34. La stimulation des cellules avec un facteur de croissance (étapes 4.1-4.7) peut être effectuée avant la lyse cellulaire. Si des cellules non stimulées sont souhaitées, passez à l’étape 4.8 ci-dessous.

  1. Aspirer le milieu de croissance [milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 50 U/mL de pénicilline, 50 μg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 10 % FBS] des cellules MEPM à ~70 % de confluence dans une boîte de culture cellulaire de 6 cm à l’aide d’un pipet Pasteur de 5,75 po attaché à un système de vide.
  2. Lavez les cellules avec 1 mL de PBS de culture tissulaire.
  3. Ajouter 3 mL de milieu de famine sérique [DMEM avec 50 U/mL de pénicilline, 50 μg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 0,1 % FBS] préavertissé dans un bain-marie à 37 °C.
  4. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 23 h.
  5. Remplacer le milieu de famine sérique par 3 mL de milieu de famine sérique frais et préavertissé.
  6. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 h.
  7. Stimuler les cellules avec le facteur de croissance de choix à une concentration déterminée empiriquement pendant la durée souhaitée.
  8. Aspirer le milieu des cellules MEPM à une confluence de 80% à 100% à l’aide d’une pipette Pasteur de 5,75 » fixée à un système de vide.
  9. Laver les cellules deux fois avec une culture tissulaire glacée PBS (1 mL pour un plat de culture cellulaire de 6 cm); inclinez la plaque sur le côté lors du dernier lavage pour vous assurer que tout le PBS de culture tissulaire est aspiré.
  10. Lyser les cellules en ajoutant un tampon de lyse NP-40 glacé avec de la protéase et des inhibiteurs de la phosphatase ajoutés immédiatement avant utilisation (0,1 mL pour une boîte de culture cellulaire de 6 cm) sur de la glace.
  11. Incuber la plaque sur de la glace pendant 5 min avec rotation environ toutes les minutes pour assurer une couverture complète de la plaque.
  12. Grattez les cellules de la plaque à l’aide d’un élévateur de cellules prérefroidi et transférez la suspension de cellules dans un tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 mL sur de la glace.
  13. Incuber la suspension de la cellule à 4 °C pendant 30 min tout en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 mL/2 mL avec un revolver à tube.
  14. Passez aux étapes 3.6 à 3.9 décrites ci-dessus.

5. Transfert occidental de lysats de protéines de cellules entières provenant de processus faciaux de souris et / ou de cellules MEPM pour les phosphoprotéines

  1. Préparez des échantillons de lysat de protéines de cellules entières pour SDS-PAGE.
    1. Déterminer la quantité de protéines à charger, en fonction de l’abondance des protéines dans le tissu ou la cellule; 12,5 μg est généralement suffisant pour les protéines exprimées de manière robuste dans les lysats de protéines de cellules entières.
    2. Ajouter un volume égal de 2x tampon Laemmli [20% de glycérol, 4% de FDS, 0,004% de bleu de bromophénol, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] avec 10% de β-mercaptoéthanol ajouté immédiatement avant utilisation.
      ATTENTION : β-mercaptoéthanol est corrosif pour la peau ou les yeux, toxique, dangereux s’il est avalé et présente une toxicité aquatique. Portez des gants, un manteau de laboratoire, un écran facial et des lunettes de sécurité dans une hotte à fumée chimique. Éliminer conformément aux directives de santé et de sécurité environnementales.
    3. Mélanger par vortex.
    4. Chauffer les échantillons à 100 °C pendant 5 min dans un mini bain sec.
    5. Mélanger par vortex et placer les échantillons sur de la glace.
    6. Centrifuger à 9 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Placer brièvement les échantillons sur la glace avant de les charger dans le gel SDS-PAGE, ou conserver à -20 °C à long terme.
  2. Effectuez SDS-PAGE à l’aide d’une cellule d’électrophorèse avec un gel protéique préfabriqué de 4% à 15% et un tampon d’électrophorèse35.
  3. Électrotransférez les protéines vers une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide d’un tampon de transfert avec 0% à 20% de méthanol (0% à 10% pour les protéines supérieures à 100 kDa; 20% pour les protéines inférieures à 100 kDa) ajouté immédiatement avant l’utilisation35.
  4. Bloquez la membrane et sondez la phosphoprotéine d’intérêt.
    1. Après le transfert, laver la membrane dans 1x solution saline tamponnée tris (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] pendant 5 min dans une boîte western blot.
    2. Incuber la membrane dans 5 mL de tampon bloquant [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; bien mélangé et filtré à travers un filtre à seringue de 25 mm avec des pores de 0,2 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL avec embout luer] pendant 1 h dans une boîte à transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
      REMARQUE: N’utilisez pas le lait comme agent bloquant lors de la caractérisation des phosphoprotéines car il contient la caséine phosphoprotéine, ce qui peut provoquer un signal de fond élevé et non spécifique.
    3. Lavez la membrane trois fois pendant 5 minutes chacune dans TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    4. Incuber la membrane dans 5 mL d’anticorps primaire dilué dans un tampon bloquant à 4 °C pendant la nuit dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une palette de 50 mL avec un revolver à tube.
      REMARQUE: Consultez la fiche technique des anticorps pour connaître la concentration appropriée pour le transfert western.
    5. Lavez la membrane trois fois à TA pendant 5 minutes chacune dans TBS-T dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    6. Incuber la membrane dans 5 mL d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) approprié dilué dans un tampon bloquant pendant 1 h dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    7. Lavez la membrane trois fois pendant 5 minutes chacune dans TBS-T dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    8. Incuber la membrane dans un substrat de transfert western à chimiluminescence améliorée (ECL) [mélange de volumes égaux à partir de bouteilles 1 et 2; 0,5 mL de chacun pour de grandes membranes (8,6 cm x 6,7 cm)] pendant 1 min, en veillant à ce que toute la membrane soit continuellement exposée au substrat de western blotting ECL.
    9. Drainez la membrane de l’excès de substrat de western blotting ECL et développez-la immédiatement à l’aide d’un imageur de chimiluminescence.
  5. Décaper la membrane et ressasser pour obtenir la protéine totale d’intérêt.
    1. Placer la membrane PVDF dans une pochette transparente avec doublure en polyéthylène contenant 5 mL de tampon de décapage [2 % SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] avec 8 μL/mL de β-mercaptoéthanol ajouté immédiatement avant utilisation.
    2. Incuber à 50 °C pendant 30 min avec bascule dans un four d’hybridation à 11 tours par minute.
    3. Lavez la membrane trois fois à TA pendant 5 minutes chacune dans TBS-T dans une boîte de transfert western avec agitation sur un agitateur orbital.
    4. Passez aux étapes 5.4.2 à 5.4.9 décrites ci-dessus.
  6. Quantifier les densités de bande western blot à l’aide du logiciel ImageJ, en normalisant les niveaux de la protéine phosphorylée d’intérêt aux niveaux de la protéine totale d’intérêt36.

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Résultats

Lorsque l’on tente de caractériser la phosphorylation de protéines isolées à partir de processus faciaux de souris et/ou de cellules de mésenchyme palatales cultivées, les résultats représentatifs révéleront idéalement une bande distincte et reproductible après un transfert western avec un anticorps anti-phosphoprotéine qui se situe à la hauteur ou près de la hauteur de la bande protéique totale correspondante (Figure 3 ). Cependant, si une phosphorylation étendue de la protéine se produit, ...

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Discussion

Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de sonder les événements critiques de signalisation dépendant de la phosphorylation au cours du développement craniofacial de manière robuste et reproductible. Ce protocole comporte plusieurs étapes essentielles qui garantissent une collecte appropriée des données et une analyse des résultats. Qu’il s’agisse d’isoler des phosphoprotéines des processus faciaux de souris et/ou de cultiver des cellules de mésenchyme palatal, il est impératif de se déplacer rapidement et efficace...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

129S4 souris étaient un cadeau du Dr Philippe Soriano, Icahn School of Medicine à Mount Sinai. Ce travail a été soutenu par des fonds des National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 et K02 DE028572 à K.A.F., F31 DE029976 à M.A.R. et F31 DE029364 à B.J.C.D.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Equipment
Bloc pour mini bain secResearch Products International Corp400783
Système d’imagerie ChemiDoc XRS+ avec logiciel Image LabBio-Rad1708265imageur de chimiluminescence
CO2, incubateurVWR10810-902
panneau, 11 x 13 poFisher Scientific09 002 12
Cellule d’électrophorèse, 4 gels, pour mini-gels préfabriqués avec mini module trans-blotBio-Rad1658030
Microcentrifugeuse 5415 D avec rotor F45-24-11 (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Mini bain secProduits de recherche International Corp400780
Agitateur orbitalVWR89032-092
PH-mètreVWR89231-662
Alimentation pour SDS-PAGEBio-Rad1645050
Bac à glace rectangulaire, maxi 9 LFisher Scientific07-210-093
Stemi 508 Stéréomicroscope avec support K LAB, LED éclairage annulaireZeiss4350649020000000microscope de dissection
TimerVWR62344-641
Revolver à tubeFisher Scientific11 676 341
Mélangeur vortexFisher Scientific02 215 414
Bain-marieVWR89501-472
Boîte à transfert westernFisher ScientificNC9358182
MatériauxBoîtes de
culture cellulaire, 6 cmFisher Scientific12-565-95
Plaques de culture cellulaire, 12 puitsFisher Scientific07-200-82
Élévateurs de cellulesFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Tubes coniques, polypropylène, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Pince fine Dumont #5Outils de science fine11254-20
Cuillère à embryonOutils de science fine10370-17
Tubes de microcentrifugation, 0,5 mLVWR89000-010
Tubes de microcentrifugation, 1,5 mLVWR20170-038
Pipette Pasteur, 5,75"Fisher Pipette Scientific13-678-6A
Pasteur, 9"VWR14672-380
Boîtes de Pétri, 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Boîtes de Pétri, 35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
Sachets, transparents, doublure en polyéthylèneFisher Scientific01-812-25B
Membrane PVDFFisher Scientific IPVH00010
Pince SemkenFine Science Tools11008-13
Petite poire en latex, 2 mLVWR82024-554
Ciseaux chirurgicauxFine Science Tools14002-12
Filtre à seringue, 25 mm, 0.2 &mu ; taille des poresFisher Scientific09-740-108
Seringue avec embout Luer, 10 mLVWRBD309604
Pipette de transfertFisher Scientific13-711-22
Levier d’ouverture de la cassette Western blotBio-Rad4560000
Papier de chromatographie Whatmann 3MM chrFisher Scientific05-714-5
Réactifs
4-15 % Gels de protéines préfabriquées, 10 puits, 30 & micro ; LBio-Rad4561083
&beta ;-glycérophosphate hydrate de sel disodiqueSigma AldrichG5422-25Gconcentration de stock 1 M
&beta ;-mercaptoéthanolSigma AldrichM3148-100ML
Albumine sérique bovine, fraction V, testée contre les chocs thermiquesFisher ScientificBP1600-100
Bleu de bromophénolFisher Scientific
Cocktail complet de mini-inhibiteurs de protéaseSigma Aldrich11836153001concentration en stock 25x
DC kit de dosage des protéines IIBio-Rad500-0112
DMEM, haute teneur en glucoseGibco11965092
E7, anticorps primaire monoclonal bêta-tubuline de souris, concentré 0,1 mLÉtudes de développement Hybridoma BankE71:1 000
Substrat de transfert western ECLFisher ScientificPI32106faible plage de picogrammes
Substrat de transfert western ECLGenesee Scientific20-302Bà faible plage de femtogramme
Tampon d’électrophorèse, 5 LBio-Rad1610772concentration de stock 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallonDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
Acide éthylènediaminetétraacétique, sel Di Na dihydrique. (Powd. cristallin/Électrophore.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
Sérum fœtal bovin, caractérisé, origine américaine, 500 mLHyCloneSH30071.03
Glycérol (certifié ACS)Fisher ScientificG33-4
Anticorps secondaire conjugué HRP, chèvre anti-sourisIgG Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20 000
Anticorps secondaire conjugué HRP, chèvre anti-lapin IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20 000
Solution d’acide chlorhydrique, 6N (certifié)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 détergent non ioniqueFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-glutamineGibco25030081concentration de stock 200 mM
MéthanolFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorps primaireTechnologie de signalisation cellulaire9102S1:1 000 ; anti-Erk1/2
PDGF-BB ligand recombinant, ratFisher Scientific520BB050
Récepteur PDGF &bêta ; anticorps primaireTechnologie de signalisation cellulaire3169S1:1 000
Pénicilline-StreptomycineGibco15140122concentration de stock 100 U/mL, 100 & micro ; g/mL
de fluorure de phénylméthanesulfonyle, 99 %Fisher ScientificAC215740100PMSF ; concentration de stock 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorps primaireTechnologie de signalisation cellulaire9101S1:1 000, anti-phospho-Erk1/2
Récepteur phospho-PDGF et alpha ; /Récepteur PDGF &bêta ; anticorps primaireTechnologie de signalisation cellulaire3170S1:1 000
Chlorure de potassium (cristaux blancs)Fisher ScientificBP366-500KCl
Phosphate de potassium monobasique (cristaux blancs)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS solution, 10 %Bio-Rad161-0416
Chlorure de sodium (cristallin/biologique, certifié)Fisher ScientificS671-3NaCl
Fluorure de sodium (poudre/certifié ACS)Fisher ScientificS299-100NaF ; aliquote à usage unique ; concentration de la matière 1 M
Orthovanadate de sodium, 99 %Fisher ScientificAC205330500Na3VO4 ; concentration de la matière 100 mM
Phosphate dibasique de sodium anhydre (granulaire ou en poudre/certifié ACS)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Culture tissulaire PBSFisher Scientific21-031-CV
Tampon de transfert, 5 LBio-Rad161077110x
base Tris (cristaux blancs ou poudre cristalline/biologie moléculaire)Fisher ScientificBP152-1
TrypsineBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Marqueur de poids moléculaire par transfert WesternBio-Rad1610374
Software
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Animals
Female 129S4sourisdon du Dr Philippe Soriano, École de médecine Icahn au Mont Sinaï
Four d’hybridation Fisher Scientific UVP95003001 AC403140050 concentration de stock

Références

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Mots-clés

Isolement de lysats prot iquesD veloppement craniofacialPhosphorylation des prot inesWestern BlotInhibiteurs de phosphataseTampon de lyse cellulaireTransduction du signal
Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines
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