Reproductibilité et précision améliorées de la quantification à haut débit des données de croissance bactérienne à l’aide d’un lecteur de microplaques

Summary

Ici, un protocole à haut débit est présenté pour mesurer les données de croissance, y compris les courbes de croissance, le taux de croissance et le taux de croissance maximal. Le protocole a été vérifié et validé à l’aide de deux bactéries productrices de biofilm. Les résultats et l’approche appliqués dans cette étude peuvent être étendus à d’autres protocoles à haut débit utilisant des lecteurs de microplaques.

Abstract

Cette étude visait à développer un protocole reproductible, fiable et à haut débit pour surveiller la croissance bactérienne dans des plaques à 96 puits et analyser le taux de croissance maximal. Les courbes de croissance et les taux de croissance maximaux de deux espèces bactériennes ont été déterminés. Des problèmes tels que (i) la condensation du couvercle, (ii) la correction de la longueur du trajet, (iii) la taille de l’inoculation, (iv) l’intervalle de temps d’échantillonnage et (v) le biais spatial ont été étudiés. La répétabilité du protocole a été évaluée à l’aide de trois réplications techniques indépendantes, avec un écart-type de 0,03 entre les essais. Les taux de croissance maximaux de Bacillus mycoides et de Paenibacillus tundrae ont été déterminés à 0,99 h⁻¹ ±± 0,03 h⁻¹ et 0,85 h⁻¹ ± 0,025 h⁻¹, respectivement. Ces bactéries sont plus difficiles à surveiller optiquement en raison de leur affinité à s’agglutiner. Cette étude démontre l’importance cruciale de la taille de l’inoculation, de la correction de la longueur du trajet, du réchauffement des couvercles, des intervalles de temps d’échantillonnage et du biais spatial des plaques de puits pour obtenir des données fiables, précises et reproductibles sur les lecteurs de microplaques. Le protocole développé et ses étapes de vérification peuvent être étendus à d’autres méthodes utilisant des lecteurs de microplaques et des protocoles à haut débit, réduisant ainsi les erreurs innées des chercheurs et les coûts des matériaux.

Introduction

L’intérêt croissant pour la manipulation multi-omique, y compris les études du mécanisme et du métabolisme des bactéries, souligne l’importance des méthodes automatisées et à haut débit telles que l’enregistrement des données de croissance ^1,2. Les données de croissance comprenant des paramètres cinétiques, tels que les taux de croissance maximaux, peuvent aider à caractériser les réponses bactériennes à différentes conditions physiques, chimiques et antibactériennes. Les données sur le taux de croissance sont une variable de réponse standard utilisée pou....

Protocol

REMARQUE : Toutes les étapes de ce protocole doivent être suivies dans des conditions stériles (c.-à-d. entre deux flammes ou une enceinte de sécurité biologique). Tous les matériaux et outils sont autoclavés pendant 20 min. Consultez la table des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole. Les mains gantées sont désinfectées, maintenues humides avec un désinfectant pour les mains ou une solution d’alcool à 70 % pendant au moins 1 min, et ne sont pas retirées de l’enceinte de sécurité par la suite. Sinon, la procédure de désinfection doit être répétée avant de réintroduire les mains dans ....

Results

Validation de la lecture OD et facteur de correction de la longueur du trajet
Des échantillons fractionnés de cultures de B. mycoides ont été prélevés à différents moments et mesurés à l’aide du lecteur de microplaques et du spectrophotomètre (figure 1A). Cette étape a été prise pour valider les résultats sur différents appareils. Les données de l’OD₆₀₀ étaient corrélées, mais ne correspondaient pas (figure 1B). La corréla.......

Discussion

Les lecteurs de microplaques permettent d’obtenir des taux de croissance constants et reproductibles. Cette technologie minimise l’erreur humaine et permet un échantillonnage à haut débit. La faible quantité de culture requise par échantillon fait de cette approche une alternative attrayante et peu coûteuse au comptage des cellules à l’aide de flacons ou de tubes à essai. Les lecteurs de microplaques permettent d’obtenir une grande taille d’échantillon, ce qui augmente la puissance stati.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifugeuse  ;	Eppendorf	5810 R
Tubes à centrifuger - 15 mL  ;	ThermoFisher- Scientifique  ;	339650	Tubes de
centriguge stériles - 50 mL  ;	ThermoFisher- Scientifique  ;	339652
Boucle d’inoculation stérile jetable, 10 & micro ; L	Cole-Parmer  ;	UZ-06231-08
Fioles Erlenmeyer stériles - 250 mL  ;	Cole-Parmer  ;	; UZ-34502-59	Verre  ;
Isopropanol  ;	ThermoFisher- Scientifique  ;	396982500	&ge ; 99.0
Tampon phosphate salin	Sigma-Aldrich	P4417
pointes Pipett 1 000 & micro ; L	ThermoFisher- Scientifique  ;	; UZ-25001-76
Embouts Pipett 10 mL  ;	ThermoFisher- Scientifique  ;	UZ-25001-83
Embouts Pipett 200 & micro ; L	ThermoFisher- Scientifique  ;	UZ-25001-85
Embouts Pipett 5 mL  ;	ThermoFisher- Scientifique  ;	; UZ-25001-80
Pipette 1 000 & micro ; L	Cole-Parmer  ;	UZ-07909-11
Pipette 10 mL	Cole-Parmer  ;	UZ-07909-15
Pipette 200 & micro ; L	Cole-Parmer  ;	; UZ-07909-09
Pipette 5 mL  ;	Cole-Parmer  ;	UZ-07859-30
Bouillon de soja tryptique  ;	Millipore	22091	Convient pour la microbiologie