Method Article

Faire progresser l’imagerie haute résolution des assemblages de virus dans le liquide et la glace

DOI:

10.3791/63856

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July 20th, 2022

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1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

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Ici, des protocoles sont décrits pour préparer des assemblages de virus adaptés à l’analyse liquide-EM et cryo-EM à l’échelle nanométrique en utilisant la microscopie électronique à transmission.

Abstract

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L’intérêt pour la microscopie électronique liquide (EM liquide) a explosé ces dernières années, car les scientifiques peuvent maintenant observer des processus en temps réel à l’échelle nanométrique. Il est extrêmement souhaitable de coupler des informations cryo-EM à haute résolution avec des observations dynamiques, car de nombreux événements se produisent à des échelles de temps rapides - de l’ordre de la milliseconde ou plus. Une meilleure connaissance des structures flexibles peut également aider à la conception de nouveaux réactifs pour lutter contre les agents pathogènes émergents, tels que le SRAS-CoV-2. Plus important encore, l’observation des matériaux biologiques dans un environnement fluide donne un aperçu unique de leur performance dans le corps humain. Les méthodes nouvellement développées ici sont présentées pour étudier les propriétés à l’échelle nanométrique des assemblages de virus dans la glace liquide et vitreuse. Pour atteindre cet objectif, des échantillons bien définis ont été utilisés comme systèmes modèles. Des comparaisons côte à côte des méthodes de préparation des échantillons et des informations structurelles représentatives sont présentées. Les caractéristiques sub-nanométriques sont montrées pour les structures résolues dans la plage de ~3,5-Å-10 Å. Parmi les autres résultats récents qui soutiennent ce cadre complémentaire, citons les connaissances dynamiques des candidats vaccins et des thérapies à base d’anticorps imagées dans un liquide. Dans l’ensemble, ces applications corrélatives font progresser notre capacité à visualiser la dynamique moléculaire, fournissant un contexte unique pour leur utilisation dans la santé et la maladie humaines.

Introduction

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La recherche biomédicale améliore notre compréhension de la santé et des maladies humaines grâce au développement de nouvelles technologies. L’imagerie à haute résolution transforme notre vision du nanomonde - nous permettant d’étudier les cellules et les molécules dans les moindres détails 1,2,3,4,5. L’information statique des composants dynamiques tels que les polymères mous, les assemblages de protéines ou les virus humains ne révèle qu’un instantané limité de leur récit complexe. Pour mieux comprendre l....

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Protocol

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1. Chargement du porte-échantillon pour liquide-EM

  1. Nettoyez les micropuces de nitrure de silicium (SiN) en incubant chaque puce dans 150 mL d’acétone pendant 2 minutes, suivie d’une incubation dans 150 mL de méthanol pendant 2 min. Laissez les copeaux sécher dans un flux d’air laminaire.
  2. Nettoyez au plasma les copeaux séchés à l’aide d’un instrument à décharge luminescente fonctionnant dans des conditions standard de 30 W, 15 mA pendant 45 s en utilisant du gaz argon.
  3. Chargez une micropuce à base sèche dans l’extrémité du porte-échantillon. Ajouter ~0,2 μL d’échantillon (0,2-1 mg/mL d’assemblages de virus dans 50 mM HEPES....

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Results

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Un TEM liquide fonctionnant à 200 kV a été utilisé pour toutes les expériences d’imagerie EM liquide et un cryo-TEM fonctionnant à 300 kV a été utilisé pour toute la collecte de données cryo-EM. Des images et des structures représentatives de plusieurs virus sont présentées pour démontrer l’utilité des méthodes sur divers sujets de test. Il s’agit notamment du virus adéno-associé recombinant de sous-type 3 (AAV), des assemblages sous-viraux du SARS-CoV-2 dérivés du sérum du patient et des particules à double couche du ro.......

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Discussion

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De nouvelles opportunités sont présentées pour rationaliser les flux de travail actuels de liquide EM en utilisant de nouveaux outils automatisés et des technologies adaptées du domaine cryo-EM. Les applications impliquant la nouvelle technique sandwich par micropuce sont importantes par rapport à d’autres méthodes, car elles permettent une analyse d’imagerie à haute résolution dans la glace liquide ou vitreuse. L’une des étapes les plus critiques du protocole consiste à produire des spécimens avec l’épaisseur de liquide.......

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. L’auteur, Madeline J. Dressel-Dukes, est une employée de Protochips, Inc. et Michael Spilman est un employé de DirectElectron.

Acknowledgements

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Les auteurs remercient le Dr Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Département d’ophtalmologie) pour avoir fourni AAV-3 purifié. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health et le National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 à D.F.K.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcétoneFisher Scientific  ; A11-11
Outil de clipsage AutoloaderThermoFisher ScientificN/AÉgalement fournisseur de SubAngstrom
Clips de grille de chargeur automatiqueThermoFisher ScientificN/AClips supérieurs et inférieurs
Grilles EM dorées recouvertes de carboneMicrocopie électronique SciencesCF400-AU-50400-mesh, 5 nm d’épaisseur
Sérum de patient COVID-19RayBiotechCoV-Pos-S-500500 microlitres de sérum PCR+
MéthanolFisher Scientific  ; A412-11 Litre
Micropuces Microwell-integradProtochips, Inc.EPB-42A1-10Réseaux de fenêtres 10x10 mm
TEMWindows micropucesSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 grandes fenêtres, 10 nn
d’épaisseur TEMWindows micropucesSimpore, Inc.  ;SN100-A05Q33A9 petites fenêtres, 5 nm d’épaisseur
Micropuces supérieuresProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm fenêtre
Whatman #1 papier filtreWhatman1001 090100 pièces, 90 mm
équipement  ; Détecteur d’électrons
directs DirectViewEspacement direct des pixels des électrons6 microns
Falcon 3 EC Détecteur d’électrons directsThermoFisher ScientificEspacement des pixels de 14 microns
Gatan 655 Station de pompage sècheGatan, Inc.  ; Embout porte-pompe à 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificunité de préparation d’échantillons à la pointe de la technologie  ;
PELCO easiGlow, unité de décharge luminescenteTed Pella, Inc.  ; Mode de polarité négative
Porte-échantillon Poseidon SelectProtochips, Inc.  ; Compatible FEI ; porte-échantillon
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV ; Liquid TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV ; Cryo-TEM
Logiciel disponible gratuitementLien vers le site webComments (facultatif)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/autre logiciel de traitement d’images
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4programme de recherche CTF
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/progiciel d’analyse de structure moléculaire
de https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biolo....

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