Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Résumé

L’ADN mitochondrial (mt) des mammifères est une petite molécule d’ADN intra-mitochondrial circulaire, double brin, codant pour 13 sous-unités de la chaîne de transport d’électrons. Contrairement au génome nucléaire diploïde, la plupart des cellules contiennent beaucoup plus de copies d’ADNmt, allant de moins de 100 à plus de 200 000 copies selon le type de cellule. Le nombre de copies d’ADNmt est de plus en plus utilisé comme biomarqueur pour un certain nombre de maladies et de maladies dégénératives liées à l’âge et, par conséquent, la mesure précise du nombre de copies d’ADNmt devient un outil clé dans les contextes de recherche et de diagnostic. Les mutations dans l’ADNmt, se produisant souvent sous forme de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) ou de délétions, peuvent exister dans toutes les copies de l’ADNmt dans la cellule (appelé homoplasmie) ou sous la forme d’un mélange de copies mutées et d’ADNmt WT (appelées hétéroplasmie). Les mutations hétéroplasmiques de l’ADNmt sont une cause majeure de pathologie mitochondriale clinique, que ce soit dans les maladies rares ou dans un nombre croissant de maladies courantes d’apparition tardive telles que la maladie de Parkinson. La détermination du niveau d’hétéroplasmie présente dans les cellules est une étape critique dans le diagnostic des maladies mitochondriales rares et dans la recherche visant à comprendre les troubles courants d’apparition tardive où les mitochondries peuvent jouer un rôle. Le nombre de copies d’ADNmt et l’hétéroplasmie ont traditionnellement été mesurés par des tests quantitatifs basés sur la (q)PCR ou le séquençage profond. Cependant, l’introduction récente de la technologie ddPCR a fourni une méthode alternative pour mesurer les deux paramètres. Il offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes, y compris la capacité de mesurer le nombre absolu de copies d’ADNmt et une sensibilité suffisante pour effectuer des mesures précises à partir de cellules individuelles, même à un faible nombre de copies. Présenté ici est un protocole détaillé décrivant la mesure du nombre de copies d’ADNmt dans des cellules individuelles à l’aide de ddPCR, appelée PCR de génération de gouttelettes dorénavant, avec l’option de mesure simultanée de l’hétéroplasmie dans les cellules présentant des délétions d’ADNmt. La possibilité d’étendre cette méthode pour mesurer l’hétéroplasmie dans les cellules avec des SNP d’ADNmt est également discutée.

Introduction

L’ADN mitochondrial (mt) des mammifères est un petit génome d’ADN circulaire (environ 16,5 Kb) résidant dans la matrice mitochondriale qui code pour 37 gènes, comprenant deux ARNr, 22 ARNt et 13 gènes codant pour des protéines¹. Contrairement au génome nucléaire, qui contient une copie (haploïde) ou deux copies (diploïdes) de chaque gène par cellule, l’ADNmt est présent en plusieurs copies dans les mitochondries de chaque cellule, allant de dizaines de copies (par exemple, spermatocytes matures) à des centaines de milliers de copies (par exemple, des ovocytes)^2,3. Une conséquence de cet....

Protocole

Toutes les expériences ont suivi les directives ARRIVE et ont été approuvées par l’organisme d’examen éthique du bien-être animal de l’Université de Cambridge (AWERB).

REMARQUE : Toutes les étapes de préparation des échantillons avant la génération de gouttelettes doivent être effectuées dans une aire de travail pré-PCR propre, idéalement dans une armoire stérilisée aux UV si possible. Le protocole décrit ici utilise un équipement de PCR spécifique de génération de gouttelettes (voir le tableau des matériaux), et bien que la méthode générale devrait être applicable à d’autres systèmes, il est recommandé de consulter les lig....

Résultats

Après la génération de gouttelettes, une couche transparente de gouttelettes opaques est visible flottant au-dessus de la phase pétrolière dans chaque puits (Figure 1B). La formation de gouttelettes peut être affectée négativement par la présence de détergents dans le lysat d’entrée lors de la réalisation d’expériences sur des cellules individuelles. En utilisant le protocole de lyse décrit au point 2.1.2., des rendements en gouttelettes supérieurs au niveau recommandé de 10 000 sont systéma.......

Discussion

Le protocole décrit ici est applicable à un large éventail de types de cellules et d’espèces en plus de ceux discutés ci-dessus, bien qu’une optimisation minutieuse des nouveaux modèles de dosage soit essentielle pour garantir que la précision et la répétabilité de la méthode sont maintenues lors de l’abandon des combinaisons amorce/sonde précédemment validées. Lorsque vous travaillez avec des cellules individuelles, il est essentiel de s’assurer que le prélèvement d’échantillons est effectué aussi précisément que possib.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
50 % Tween-20 solution	Novex	3005
Huile génératrice de gouttelettes automatisée  ;	Bio Rad	1864110	Formulation d’huile commerciale utilisée pour générer l’émulsion huile/gouttelettes (utilisée à l’étape 4.1 du protocole)
Machine PCR C1000 avec bloc de puits	profonds Thermocycleur de PCR Bio Rad 1851197 équipé d’un bloc chauffant à puits profond, utilisé pour la lyse cellulaire (étape 2.1.2 du protocole) et le cyclage PCR (étape 5 du protocole)
Bloc de refroidissement de la plaque de collecte	Bio Rad	12002819	Bloc de refroidissement qui maintient les échantillons au frais pendant la génération de gouttelettes (utilisé à l’étape 4.3 du protocole)
Plaques ddPCR à 96 puits  ;	Pointes	12001925	96 puits conçues pour être utilisées dans le générateur de gouttelettes QX200 AutoDG, utilisé pour la préparation des échantillons (étape 3.4 du protocole) et la collecte des gouttelettes (étape 4.3 du protocole)
huile de lecteur de gouttelettes ddPCR  ;	Bio Rad	1863004	Formulation d’huile commerciale utilisée par le lecteur de gouttelettes (utilisée à l’étape 6.1 du protocole)
ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP)	Bio Rad	1863023	Supermix commercial à utiliser dans des expériences ddPCR utilisant des sondes (utilisées à l’étape 3.3 du protocole)
Cartouches de générateur de gouttelettes automatisées DG32  ;	Cartouches bio-Rad	1864108	microfluidiques utilisées dans le générateur de gouttelettes QX200 AutoDG pour générer l’émulsion huile/gouttelettes (utilisée à l’étape 4.3 du protocole)
Sérum fœtal bovin	Gibco	10270-106	Sérum fœtal bovin qualifié
Couvercles de plaque métalliques  ;	Bio Rad	1814040	Couvercles de plaques en aluminium utilisés pour sceller les plaques de collecte de gouttelettes après génération de gouttelettes (utilisé à l’étape 4.6 du protocole)
Cellules HEK 293T	Takara	632180	Sous-clone commercial de la lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine transformée, HEK 293, exprimant l’antigène SV40 Large-T
Cellules HeLa	cellules ECACC	93021013	Cellules de carcinome épithéloïde du col de l’utérus
Gbco		13345364	4,5 g/L de D-Glucose, avec de la L-glutamine et du pyruvate de sodium
Cybrides humains	de l’Université de Miami
Fibroblastes embryonnaires de souris.	Université de Newcastle	Immortalisé à partir de souris
Eau sans nucléase	Ambion	AM9937
Joints de plaque PCR Pierce		SP-0027	Joints de plaque adhésifs transparents, uniquement utilisés avant la génération de gouttelettes (le joint de feuille doit être utilisé à l’étape 4.6)
Poubelles à pointe de pipette	Bio Rad	1864125	Bac de collecte jetable utilisé pour collecter les pointes jetées dans le générateur de gouttelettes QX200 AutoDG (utilisé à l’étape 4.3 du protocole)
Pointes de pipette pour le système AutoDG  ;	Bio Rad	1864120	Pointes de pipette filtrées conçues pour être utilisées dans le générateur de gouttelettes QX200 AutoDG (utilisé à l’étape 4.3 du protocole)
Cellules primaires de fibroblastes dermiques humains	Newcastle Biobank
Amorces/Sondes	IDT	N/A	Les séquences exactes d’amorces/sondes dépendront du dosage. Les amorces et les sondes utilisées dans cette étude sont indiquées dans le tableau 1
protéinase K 20 mg/mL	Ambion	AM2546
PX1 Scelleuse de plaques PCR	Bio Rad	1814000	Applique des joints en aluminium sur les plaques d’échantillon ddPCR après la génération de gouttelettes (utilisé à l’étape 4.6 du protocole)
Logiciel QX Manager	Bio Rad	12012172	Logiciel de configuration et d’analyse du lecteur de gouttelettes (utilisé dans les étapes 6 et 7 du protocole)
Générateur de gouttelettes QX200 AutoDG	Bio Rad	1864101	Générateur de gouttelettes microfluidique automatisé (utilisé dans l’étape 4 du protocole)
Lecteur de gouttelettes QX200	Bio Rad	1864003	Lecteur de gouttelettes (utilisé dans l’étape 6 du protocole)
Cristaux préréglés Trizma pH 8,3	Sigma	T8943-100G

de pipette à plaques Bio Rad C57Bl/6 Solution de