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Article de méthode

Immunoétiquetage et comptage des synapses rubanées chez les cochlées de gerbille jeunes adultes et âgées

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DOI :

10.3791/63874

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21 avril 2022

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1Cluster of Excellence "Hearing4all" and Research Centre Neurosensory Science, Department of Neuroscience, School of Medicine and Health Science, Carl von Ossietzky University Oldenburg

Dans cet article

Résumé

Un protocole pour le traitement des cochlées de gerbilles jeunes adultes et âgées par immunomarquage des structures synaptiques afférentes et des cellules ciliées, extinction de l’autofluorescence dans les tissus âgés, dissection et estimation de la longueur des cochlées et quantification des synapses dans des piles d’images obtenues par imagerie confocale est présenté.

Résumé

La perte de synapses ruban reliant les cellules ciliées internes et les fibres nerveuses auditives afférentes est supposée être l’une des causes de la perte auditive liée à l’âge. La méthode la plus courante pour détecter la perte de synapses rubanées est l’immunomarquage, car elle permet un échantillonnage quantitatif à partir de plusieurs emplacements tonotopiques dans une cochlée individuelle. Cependant, les structures d’intérêt sont enfouies profondément à l’intérieur de la cochlée osseuse. Les gerbilles sont utilisées comme modèle animal pour la perte auditive liée à l’âge. Ici, les protocoles de routine pour la fixation, l’immunomarquage des montures entières cochléaires de gerbille, l’imagerie confocale et la quantification du nombre et des volumes de synapses du ruban sont décrits. En outre, les défis particuliers associés à l’obtention de bons matériaux auprès de personnes vieillissantes précieuses sont mis en évidence.

Les gerbilles sont euthanasiées et perfusées cardiovasculairement, ou leurs bulles tympaniques sont soigneusement disséquées hors du crâne. Les cochlées sont ouvertes à l’apex et à la base et directement transférées au fixateur. Quelle que soit la méthode initiale, les cochlées sont postfixées puis décalcifiées. Le tissu est ensuite marqué avec des anticorps primaires contre les structures pré- et postsynaptiques et les cellules ciliées. Ensuite, les cochlées sont incubées avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence qui sont spécifiques contre leurs anticorps primaires respectifs. Les cochlées des gerbilles âgées sont ensuite traitées avec un quencher à autofluorescence pour réduire la fluorescence de fond généralement importante des tissus des animaux plus âgés.

Enfin, les cochlées sont disséquées en 6 à 11 segments. Toute la longueur cochléaire est reconstruite de manière à ce que des emplacements cochléaires spécifiques puissent être déterminés de manière fiable entre les individus. Les piles d’images confocales, acquises séquentiellement, aident à visualiser les cellules ciliées et les synapses aux endroits choisis. Les piles confocales sont déconvolvées et les synapses sont soit comptées manuellement à l’aide d’ImageJ, soit une quantification plus étendue des structures synaptiques est effectuée avec des procédures d’analyse d’images écrites sur mesure dans Matlab.

Introduction

La perte auditive liée à l’âge est l’une des maladies les plus répandues au monde qui touche plus d’un tiers de la population mondiale âgée de 65 ans et plus1. Les causes sous-jacentes sont encore débattues et activement étudiées, mais peuvent inclure la perte des synapses spécialisées reliant les cellules ciliées internes (IHC) aux fibres nerveuses auditives afférentes2. Ces synapses rubanées comprennent une structure présynaptique qui a des vésicules remplies du neurotransmetteur glutamate attaché à elle, ainsi que des récepteurs postsynaptiques α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique acide (AMPA) glutamate 3,4,5. Dans la gerbille, ~ 20 fibres nerveuses auditives afférentes entrent en contact avec un IHC 6,7,8. Les fibres de l’IHC faisant face au modiolus s’opposent aux grands rubans synaptiques, tandis que les fibres se connectant du côté pilier de l’IHC font face à de petits rubans synaptiques (c’est-à-dire chez les chats9, les gerbilles7, les cochons d’Inde10 et les souris 3,11,12,13,14). De plus, chez la gerbille, la taille des rubans présynaptiques et des patchs de glutamate postsynaptique est positivement corrélée 7,14. Les fibres qui s’opposent aux grands rubans du côté modiolaire de l’IHC sont de petit calibre et ont de faibles taux spontanés et des seuils élevés15. Il existe des preuves que les fibres à faible taux spontané sont plus vulnérables à l’exposition au bruit10 et aux médicaments ototoxiques16 que les fibres à faible seuil spontanées élevées, qui sont situées du côté pilier des IHC15.

La perte de synapses rubanées est le premier événement dégénératif de la perte auditive liée à l’âge du neural cochléaire, tandis que la perte de cellules ganglionnaires en spirale et de leurs fibres nerveuses auditives afférentes est à la traîne par rapport à17,18. Les corrélats électrophysiologiques comprennent les enregistrements des réponses auditives du tronc cérébral17 et des potentiels d’actioncomposés 8; cependant, ceux-ci ne reflètent pas les subtilités de la perte de synapses, car les fibres à faible taux spontané ne contribuent pas à ces mesures16. Les mesures électrophysiologiques les plus prometteuses sont l’indice neuronal dérivé du potentiel de masse19 et la réponse temporelle du péristimulus20. Cependant, ceux-ci ne sont fiables que si l’animal n’a pas d’autres pathologies cochléaires, au-delà de la perte de fibres nerveuses auditives, qui affectent l’activité des fibres nerveuses auditives restantes8. De plus, les seuils évalués comportementalement chez la gerbille n’étaient pas corrélés avec les nombres de synapses21. Par conséquent, une quantification fiable des synapses ruban survivantes et, par conséquent, du nombre de fibres nerveuses auditives fonctionnelles n’est possible que par un examen direct du tissu cochléaire.

La gerbille mongole (Meriones unguiculatus) est un modèle animal approprié pour étudier la perte auditive liée à l’âge. Il a une courte durée de vie, a une audition à basse fréquence similaire à celle des humains, est facile à entretenir et présente des similitudes avec les pathologies humaines liées à la perte auditive liée à l’âge 2,22,23,24. Les gerbilles sont considérées comme âgées lorsqu’elles atteignent l’âge de 36 mois, soit vers la fin de leur durée de vie moyennede 22 ans. Il est important de noter qu’une perte de synapses rubans liée à l’âge a été démontrée chez des gerbilles élevées et vieillies dans des environnements calmes 8,21.

Ici, un protocole pour immunomarquer, disséquer et analyser les cochlées de gerbilles d’âges différents, des jeunes adultes aux personnes âgées, est présenté. Des anticorps dirigés contre des composants de la presynapse (CtBP2), des patchs de récepteurs postsynaptiques du glutamate (GluA2) et des IHC (myoVIIa) sont utilisés. Un quencher d’autofluorescence est appliqué qui réduit le fond dans les cochlées vieillies et laisse le signal de fluorescence intact. En outre, une description est donnée de la façon de disséquer la cochlée pour examiner à la fois l’épithélium sensoriel et la stria vascularis. La longueur cochléaire est mesurée pour permettre la sélection d’emplacements cochléaires distincts qui correspondent aux meilleures fréquences spécifiques25. La quantification des nombres synaptiques est réalisée avec le logiciel gratuit ImageJ26. Une quantification supplémentaire des volumes et des emplacements des synapses au sein du HC individuel est effectuée à l’aide d’un logiciel personnalisé écrit en Matlab. Ce logiciel n’est pas mis à la disposition du public, car les auteurs n’ont pas les ressources nécessaires pour fournir une documentation et un support professionnels.

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Protocole

Tous les protocoles et procédures ont été approuvés par les autorités compétentes de Basse-Saxe (Allemagne), avec les numéros de permis AZ 33.19-42502-04-15/1828 et 33.19-42502-04-15/1990. Ce protocole s’applique aux gerbilles mongoles (M. unguiculatus) des deux sexes. Jeune adulte se réfère à l’âge de 3-12 mois, tandis que les gerbilles sont considérées comme âgées à 36 mois et plus. Sauf indication contraire, les tampons et les solutions peuvent être préparés et conservés au réfrigérateur jusqu’à plusieurs mois (4-8 °C). Avant utilisation, assurez-vous que les tampons et les solutions n’ont pas précipité.

1. Fixation et prélèvement d’organes

REMARQUE: Si seules les cochlées sont nécessaires, il est recommandé d’effectuer la procédure un peu plus simple de fixation par immersion. Cependant, si un cerveau bien préservé est également nécessaire, la perfusion transcardique est la seule option. Dans les deux cas, le fixateur est de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Celui-ci doit être fraîchement préparé mais peut être conservé congelé jusqu’à utilisation. Utilisez des aliquotes d’environ 300 mL pour une perfusion transcardique ou d’environ 50-100 mL par cochlée pour la fixation par immersion.

ATTENTION : Le PFA est une substance dangereuse; manipulez-le conformément aux procédures générales de sécurité du laboratoire.

  1. Fixation par perfusion transcardique
    1. Rincez la configuration de perfusion jusqu’à ce que le tube soit exempt de bulles d’air. Remplissez le tube de perfusion avec du PBS contenant de l’héparine (0,2 mL dans 100 mL de PBS) pour éviter la coagulation du sang. Arrêtez le flux une fois que le tube est rempli de PBS et que la bouteille de stockage de liquide vient de se vider; versez-y 200 mL de PFA décongelé.
      REMARQUE: La configuration est maintenant prête pour l’animal. Le PBS restant dans le tube est suffisant pour rincer le sang et sera automatiquement suivi par le fixateur une fois le flux repris.
    2. S’assurer qu’un système de collecte des déchets est en place pour l’écoulement des PFA. Utilisez une canule fraîche (19 G) et ayez de gros ciseaux, une pince (avec une pointe aplatie), des hémostats, un scalpel ou une canule pointue et un tapis en caoutchouc avec des épingles à portée de main.
    3. Euthanasier la gerbille avec un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL par animal, poids corporel : 50-120 g). Remettez l’animal dans sa cage. Lorsque l’arrêt respiratoire s’installe de telle sorte que la respiration devient irrégulière avec des intervalles de 30 s ou plus, placez la gerbille sur son dos sur le tapis en caoutchouc et fixez les deux pattes avant et une patte arrière avec des épingles (laissez une patte arrière libre de bouger pour un meilleur jugement du succès de la perfusion; voir note après l’étape 1.1.7).
    4. Pour ouvrir la cavité thoracique, soulevez la peau au-dessus du sternum avec une pince et coupez la peau à environ 0,5 cm sous le sternum avec des ciseaux jusqu’à ce que le processus xiphoideus de couleur blanche soit visible. Tenez le sternum au niveau du processus xiphoideus avec une pince et coupez le long du diaphragme pour avoir une bonne vue dans la cavité thoracique. Coupez les côtes latéralement des deux côtés jusqu’à ce qu’il y ait un bon accès au cœur. Assurez-vous que l’angle des ciseaux est parallèle et plat par rapport au corps de la gerbille pour éviter d’endommager les organes et, ainsi, assurer un système circulatoire fermé.
    5. Serrez un hémostat sur le sternum, soulevez la cage thoracique et placez l’hémostat sur l’épaule de la gerbille sans reposer l’hémostat sur aucune partie du corps pour éviter de bloquer le flux sanguin.
    6. Ouvrez légèrement le flux de fluide jusqu’à ce qu’une goutte de PBS s’écoule de la canule (19 G) environ toutes les 2 s. Tenez le cœur avec une pince et tournez-le un peu vers la gauche de sorte que le ventricule gauche puisse être clairement vu. Insérez la canule dans le ventricule gauche à un angle qui évite de pénétrer dans le septum. Tenez l’aiguille en place à la main ou avec un autre hémostat.
      REMARQUE: Les ventricules gauche et droit peuvent être différenciés par leurs différentes teintes de couleur; le ventricule gauche semble de couleur plus claire que le reste du tissu cardiaque.
    7. Augmentez lentement la pression de l’écoulement du fluide et ouvrez l’oreillette droite avec de fins ciseaux, un scalpel ou une autre canule. Ouvrez davantage le débit de fluide jusqu’à ce qu’environ 2-3 gouttes / s soient observées à la chambre d’égouttement, ou réglez un débit de 4 mL / min pour la pompe. Une fois que la fixation du cœur s’installe, assurez-vous que la canule de perfusion reste en place sans être maintenue plus loin.
      REMARQUE: Les signes d’une perfusion réussie sont des contractions musculaires lentes, un raidissement du cou et des extrémités, une pâleur du foie et des poumons roses. Le signe d’une perfusion infructueuse est un blanchiment des poumons, ce qui indique que la circulation pulmonaire est perfusée en raison de la ponction du septum.
    8. En cas d’échec de la perfusion, essayez de déplacer la canule plus haut, dans l’aorte, et serrez-la en place avec un hémostat.
    9. Décapiter la gerbille. Retirez les bulles et coupez et détachez son os comme décrit à l’étape 1.2.2.
      REMARQUE: Si le tissu n’est pas suffisamment fixé, l’épithélium sensoriel se délogera de l’organe de Corti pendant la dissection.
    10. Si la perfusion ne montre aucun signe de fixation dans les 5-10 minutes, abandonnez-la et suivez immédiatement la procédure ci-dessous pour la fixation par immersion. Pour cela, traiter la cochlée comme à l’étape 1.2.2 et postfixer le tissu dans environ 50-80 mL de PFA à 4% dans des récipients à bouchon à vis pendant 1-2 jours sur un agitateur 2D à 8 ° C.
      REMARQUE: Comme il peut être difficile d’évaluer la qualité de la fixation pendant la perfusion, il est recommandé de postfixer régulièrement les cochlées comme décrit.
  2. Fixation par immersion tissulaire
    1. Euthanasier les gerbilles avec un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL par animal, poids corporel : 50-120 g). Lorsque la gerbille a cessé de respirer, décapiter l’animal.
    2. Retirez les bulles et coupez et détachez son os avec des ciseaux et des pinces, respectivement, pour atteindre les cochlées. Retirez le maellus, l’incus et les canaux semi-circulaires. Faites de petits trous à l’apex et dans le virage basal en grattant soigneusement l’os cochléaire avec une pince. Transférer immédiatement les bulles dans un excès de fixateur froid (au moins 50 mL) et fixer le tissu dans le froid (4-8 °C) sous agitation douce (agitateur 2D [100 tr/min]) pendant 2 jours.
      REMARQUE: Après avoir fixé le tissu, les cochlées peuvent être traitées immédiatement ou stockées dans du PBS avec de l’azoture de sodium à 0,05%. ATTENTION : L’azoture de sodium est toxique. Notez que la durée de stockage peut influencer négativement la qualité de la coloration. Des essais limités ont suggéré que l’immunocoloration semblait plus faible après 2 ans de stockage du tissu dans l’azoture de sodium.

2. Préparation tissulaire et immunomarquage

  1. Dissoudre la poudre d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS pour produire une solution de 0,5 M à pH 8. Pour cela, placez un bécher sur un agitateur magnétique, remplissez-le d’environ la moitié de la quantité totale de PBS et ajoutez la quantité appropriée de poudre d’EDTA, ce qui donne une suspension acide. Ajoutez soigneusement une solution concentrée d’hydroxyde de sodium (NaOH) tout en surveillant le pH avec un pH-mètre. Remplissez de PBS jusqu’au volume final souhaité et filtrez la solution pour éviter toute contamination microbienne.
    REMARQUE: La poudre d’EDTA ne se dissout complètement qu’une fois que la suspension a atteint une valeur de pH neutre.
  2. Pour la décalcification, transférer la cochlée à 80 mL de 0,5 M EDTA dans le PBS. Incuber le tissu dans le froid (4-8 °C) sous une agitation douce sur le shaker 2D (100 tr/min) pendant 2 jours.
    REMARQUE: Après l’étape de décalcification, le tissu peut être stocké dans PBS pendant plusieurs jours jusqu’à 3 semaines avant de poursuivre les étapes de traitement restantes. Pour les anticorps qui marquent la stria vascularis, il est conseillé de couper les cochlées en deux le long de l’axe modiolar à ce stade (c’est-à-dire avant l’immunocoloration) pour assurer un accès uniforme des anticorps à leurs cibles respectives. Ceci est dépendant des anticorps et ne s’applique pas aux anticorps utilisés ici pour marquer les structures synaptiques et les IHC. Utilisez un morceau de lame de rasoir cassable et un porte-lame (comme décrit à l’étape 4.2) pour la coupe.
  3. Effectuez les étapes suivantes (jusqu’à l’étape 3.2) dans des tubes de réaction à joint sûr de 2 mL. Si le morceau de tissu est trop grand pour tenir à l’intérieur du tube, coupez l’excès de tissu avec des ciseaux. Pour améliorer la pénétration des anticorps, perméabilisez d’abord le tissu dans 1 mL de triton à 1% (Triton X-100) dans le PBS sur le shaker 2D (100 tr/min) à température ambiante pendant 1 h. Lavez le tissu 3x avec 1 mL de triton à 0,2% (Triton X-100) en PBS sur le shaker 2D (100 tr/min) à température ambiante pendant 5 min chacun.
  4. Pour bloquer les antigènes non spécifiques, incuber la cochlée dans 1 mL de solution bloquante (albumine sérique bovine à 3 % [BSA], 0,2 % de triton, dans du PBS) sur le shaker 2D (100 tr/min) à température ambiante pendant 1 h.
    REMARQUE: La solution de blocage peut être préparée à l’avance, mais ne doit pas dater de plus de ~ 10 jours.
  5. Diluer les anticorps primaires suivants fraîchement dans la même aliquote de solution bloquante : anti-myoVIIa (myosine VIIa) pour marquer les IHC (IgG polyclonal rabbit), dilué 1:400 ; anti-CtBP2 (protéine de liaison C-terminale 2) pour marquer les rubans présynaptiques (souris monoclonale IgG1), dilués à 1:400; et anti-GluA2 pour marquer les patchs récepteurs postsynaptiques (souris monoclonale IgG2a), dilués à 1:200. Assurez-vous que les cochlées sont entièrement recouvertes de la solution d’anticorps (généralement 0,4 mL) et incubez-les à 37 °C pendant 24 h.
  6. Ensuite, lavez le tissu 5x avec 0,2% de triton en PBS sur le shaker 2D (100 tr / min) à température ambiante pendant 5 minutes chacun. Choisissez des anticorps secondaires correspondant aux espèces hôtes de leurs homologues primaires et les diluez à nouveau fraîchement dans 3% de BSA, 0,2% de triton, dans PBS: chèvre anti-souris (IgG1)-Alexa fluorophore (AF) 488, dilué 1:1 000; chèvre anti-souris (IgG2a)-AF568, dilué 1:500; et âne anti-lapin-AF647 (IgG), dilué 1:1 000. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment de la fluorescence. Incuber la cochlée dans 0,4 mL de solution d’anticorps secondaires à 37 °C pendant 24 h.
    NOTE: Des essais limités ont indiqué que l’incubation du tissu cochléaire à 37 ° C pendant 24 h avec des anticorps primaires et secondaires a entraîné une immunocoloration plus brillante que la procédure d’incubation plus courante avec des températures plus basses et des durées plus courtes.
  7. Lavez les cochlées 2x avec 1 mL de triton à 0,2% dans PBS pendant 5 min chacune et 3x avec PBS pendant 5 min chacune sur le shaker 2D (100 tr/min) à température ambiante.
    REMARQUE: Après ces étapes de lavage, les cochlées peuvent rester dans pbS dans le réfrigérateur à ~ 4 ° C pendant plusieurs jours.

3. Traitement avec quencher à autofluorescence (facultatif)

REMARQUE: Les cochlées des gerbilles d’âge moyen et âgées présentent une autofluorescence de fond étendue. Dans les tissus des jeunes adultes, un traitement avec un quencher d’autofluorescence n’est pas nécessaire. Il est, en principe, possible d’appliquer le quencher d’autofluorescence avant la procédure d’immunocoloration, ce qui évite alors toute réduction accidentelle de la fluorescence d’anticorps souhaitée. Cependant, selon la fiche technique du fabricant, l’utilisation de détergents (tels que Triton X-100 dans le protocole actuel) n’est plus possible car ils éliminent le quencher du tissu.

  1. Coupez les cochlées en deux sous un stéréomicroscope, comme décrit à l’étape 4.2.
  2. Mélanger le quencher d’autofluorescence avec de l’éthanol à 70% pour obtenir une solution à 5% et incuber la cochlée dans cette solution sur le shaker 2D à température ambiante pendant 1 min. Lavez les cochlées 3x avec 1 mL de PBS sur le shaker 2D à température ambiante pendant 5 min chacune.
    ATTENTION : Le quencher à autofluorescence est dangereux et nocif. Portez des gants lorsque vous manipulez cette substance.

4. Dissection finale de l’amende

  1. Disséquez la cochlée sous un stéréomicroscope. Remplissez une boîte de Petri en polystyrole et son couvercle avec du PBS et gardez à portée de main deux pinces fines, des ciseaux à ressort Vannas, un porte-lame et une lame de rasoir cassable. Cassez les morceaux de la lame de rasoir pour obtenir une surface de coupe d’environ 2-4 mm en fonction de l’étape de dissection. Préparez une lame de microscope en plaçant trois gouttes de support de montage à la suite.
    REMARQUE: La surface de coupe de la lame de rasoir s’estompe rapidement. La lame doit être échangée après dissection et montage d’environ une pièce sur deux de la cochlée.
  2. Si ce n’est pas déjà fait à l’étape 3.1, coupez d’abord la cochlée en deux le long du modiolus sous un stéréomicroscope. Pour cela, positionnez un morceau d’une lame de rasoir plus long que la longueur enroulée de la cochlée dans un support de lame. Placez la cochlée dans la boîte de Pétri et coupez l’excès de tissu avec le morceau de lame de rasoir. Maintenez la cochlée en place avec une pince fine et coupez-la en deux le long du modiolus.
  3. Commencez par une moitié, mais laissez également l’autre moitié dans la boîte de Pétri. Fixez soigneusement la moitié cochléaire avec une pince de telle sorte que le bord de coupe soit tourné vers le haut. Utilisez de fins ciseaux à ressort pour couper l’os de la cochlée au-dessus de l’hélicotréma, recouvrant l’apex.
  4. Pour commencer la séparation des pièces cochléaires, isolez le tour du milieu en coupant avec des ciseaux à travers le modiolus et le nerf auditif, au-dessus (scala vestibuli) et en dessous (scala tympani).
  5. Couper à travers l’os cochléaire recouvrant la stria vascularis dans le canal cochléaire. Faites deux coupures des deux côtés de l’os cochléaire au-dessus de l’organe de Corti et le long de la stria vascularis et utilisez la lame de rasoir pour éventuellement séparer les morceaux cochléaires.
    REMARQUE: La stria vascularis est facilement visible sous la forme d’une bande sombre. Couper le long de la stria vascularis laisse l’organe de Corti intact.
  6. Facultatif: Pour recueillir la stria vascularis, coupez soigneusement entre l’organe de Corti et la stria vascularis pour séparer les deux. Laissez la stria vascularis reliée au ligament spiralé (attaché à l’os recouvrant la surface externe de la cochlée) et retirez l’os décalcifié à l’aide d’une pince. Placez la pièce avec le côté stria vers le haut sur la lame du microscope dans une goutte de support de montage.
    REMARQUE: Si la pièce collectée est incurvée trop fortement, il peut être nécessaire de la diviser en morceaux plus petits pour qu’elle soit suffisamment plate pour être montée sur la glissière.
  7. Transférez les pièces cochléaires dans le couvercle rempli de PBS de la boîte de Petri en polystyrole, en veillant à ce que les supports entiers cochléaires soient aussi plats que possible sur la glissière. Enlevez l’excès de tissu, comme les parties du ligament spiralé du côté abneural et les parties du limbe spiralé du côté neuronal. Retirez soigneusement la membrane tectoriale avec une pince super fine.
  8. Placez les pièces cochléaires sur la glissière dans une goutte de support de montage. Placez les supports entiers cochléaires avec l’organe de Corti tourné vers le haut sur la glissière pour éviter d’obscurcir les IHC dans le chemin optique pour l’imagerie. Recherchez l’invagination du limbe spiralé à proximité des IHC, qui est visible en déplaçant la pièce cochléaire dans le plan sagittal pour identifier le côté à faire face vers le haut.
    REMARQUE: Pour reconstruire numériquement la cochlée complète à partir de ses pièces individuelles lors d’un traitement ultérieur, il est fortement recommandé de documenter les croquis des pièces et de noter les points de repère. De plus, les pièces doivent idéalement être disposées dans le bon ordre sur la diapositive.
  9. Répétez les étapes 4.3 à 4.8 jusqu’à ce que la cochlée entière soit transférée sur la lame du microscope. Si nécessaire, ajoutez plus de support de montage, remettez la glissière et scellez la glissière en place avec du vernis à ongles noir peint sur les bords. Laissez sécher dans l’obscurité à température ambiante, puis conservez la lame dans l’obscurité à 4 °C.
    REMARQUE: Même si des parties de l’épithélium sensoriel lui-même sont accidentellement perdues, il est important de monter néanmoins ce qui reste de la pièce cochléaire pour une estimation correcte de la longueur.

5. Mesure de la longueur cochléaire

  1. Mesurez la longueur de la cochlée à partir d’images en champ clair de ses pièces à l’aide d’un système de microscope à épifluorescence et d’un logiciel associé. Enregistrez les images à faible grossissement (objectif 4x) de chaque pièce cochléaire et utilisez l’outil de mesure du lasso du logiciel de microscope pour tracer une ligne le long de la rangée d’IHC dans chacune des images. Calculez la longueur totale en ajoutant les longueurs de toutes les pièces.
    REMARQUE: Lorsque des parties de l’épithélium sensoriel sont manquantes dans une pièce cochléaire, interpolez la ligne.
  2. Pour définir les emplacements cochléaires à analyser dans une cochlée individuelle, calculez leurs distances correspondantes par rapport à l’apex à l’aide de l’équation donnée par Müller25. Marquez ces emplacements, par exemple, sur une impression des pièces cochléaires.

6. Acquisition d’images avec un microscope confocal

  1. Utilisez un microscope confocal avec un objectif 40x à immersion dans l’huile (ouverture numérique 1.3) et l’huile appropriée pour l’imagerie haute résolution.
    REMARQUE: Si le microscope confocal a un chemin de lumière inversé, la lame doit être positionnée à l’envers. Dans ce cas, donnez à l’échantillon environ 30 minutes pour couler et reposez-vous de manière stable sur le couvercle avant de commencer le balayage final. Alternativement, utilisez un milieu de montage qui est fluide pendant toute la durée de la dissection, mais qui se solidifie plus tard et conserve simultanément la fluorescence.
  2. Activez les lasers appropriés : deux lasers à semi-conducteurs à pompage optique avec des longueurs d’onde de λ = 488 nm et λ = 522 nm, et un laser à diode avec une longueur d’onde de λ = 638 nm sont utilisés dans ce protocole. Choisissez la plage d’émission des étiquettes de fluorescence (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Lorsqu’un détecteur hybride compte les photons libérés, placez la ligne laser à au moins 10 nm de la courbe d’émission.
    REMARQUE: Il est important d’effectuer des vérifications préliminaires avec des tissus à étiquette unique pour s’assurer que les largeurs de bande du détecteur choisies séparent proprement les canaux de couleur (c’est-à-dire qu’elles ne conduisent pas à la diaphonie des canaux). Les ondes radio interfèrent avec le détecteur hybride, ce qui entraîne un nombre maximal de photons, et provoque ainsi des rayures artéfactuelles dans la pile. Par conséquent, évitez d’utiliser un téléphone portable près du microscope.
  3. Zoomez sur le tissu jusqu’à ce que l’image s’étende sur 10 IHC. Choisissez la résolution de l’image en fonction de l’échantillonnage Nyquist, qui est généralement d’environ 40-60 nm / pixel. Réglez la taille du pas dans la direction z sur 0,3 μm et la vitesse d’imagerie sur 400-700 Hz.
    REMARQUE: Ces deux paramètres (taille du pas et vitesse d’imagerie) sont des compromis entre l’utilisation de paramètres d’imagerie optimaux et le gain de temps de numérisation.
  4. Effectuez un échantillonnage bidirectionnel pour raccourcir le temps d’imagerie. Accumuler le cadre pour le canal 488 nm et 638 nm 3x et pour le canal 522 nm 6x; de plus, faites la moyenne des lignes 3x pour chaque canal. Choisissez le début et la fin de la pile dans la dimension z.
  5. Réglez le gain sur 100 lors de l’utilisation du détecteur hybride (mode de comptage) pour éviter une diminution du rapport signal/bruit. Réglez la puissance laser de sorte qu’aucun pixel ne soit saturé dans la région d’intérêt, mais que les structures couvrent principalement toute la plage de 8 bits. Commencez avec une faible puissance laser de 0,5% et augmentez-la jusqu’à ce que les structures soient visibles.
    REMARQUE: Une bonne coloration nécessite généralement une puissance laser comprise entre 0,1% et 5%.
  6. Utilisez un logiciel de déconvolution pour le traitement post-hoc des piles d’images afin d’éliminer le halo flou autour de petites structures fluorescentes à l’aide d’une fonction théorique d’étalement ponctuel. Utilisez les mêmes paramètres pour chaque pile d’une expérience. Enregistrez les images déconcentrées au format .tif ou .ics.
    REMARQUE: Le label myoVIIa (IHC) ne bénéficie pas de la déconvolution et peut être omis pour gagner du temps. Le logiciel utilise les métadonnées des fichiers image; cependant, plusieurs paramètres tels que le trajet de la lumière, le milieu d’incorporation ou le milieu d’immersion doivent être spécifiés.

7. Quantification des synapses

  1. Ouvrez une copie des piles déconvolved dans le logiciel librement accessible ImageJ avec le plugin Biovoxxel supplémentaire, qui est également disponible sur leur site Web.
  2. Ajustez les couleurs des couches individuelles en divisant les couches (Image | | de couleur Split Channels) et la fusion (Image | | de couleur Merge Channels) à nouveau, en attribuant différentes couleurs. Convertir l’image en pile RVB (Image | | de couleur Empiler sur RVB) et ajuster la luminosité et le contraste (Image | Ajuster | | luminosité/contraste soit Auto ou curseur concernant le Maximum), si nécessaire, afin que les structures pré-et postsynaptiques et l’étiquette IHC soient agréablement distinctes de l’arrière-plan.
  3. Choisissez cinq IHC et étiquetez-les avec l’outil texte (IHC1-IHC5) en cliquant sur l’emplacement souhaité dans la pile. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement (Analyser | Outils | Gestionnaire du retour sur investissement); activez la case à cocher Étiquettes pour étiqueter les points avec un nombre. Zoomez sur l’IHC d’intérêt.
  4. Utilisez l’outil point/multipoint en mode multipoint (cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’outil pour choisir entre le mode point ou multipoint). Cliquez sur une synapse de ruban fonctionnelle (c’est-à-dire un ruban présynaptique en juxtaposition étroite à un patch de glutamate postsynaptique) tout en faisant défiler la dimension z.
    REMARQUE: En fonction de leur degré de chevauchement et de la couleur choisie pour chaque couche, les pixels partagés apparaissent en couleur mixte. Habituellement, la distinction entre les synapses fonctionnelles individuelles est simple car elles sont suffisamment éloignées les unes des autres.
  5. Lorsque toutes les structures d’intérêt sont cochées, cliquez sur Ajouter dans l’interface utilisateur graphique du gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur le nom arbitraire et choisissez Renommer.
    REMARQUE: Les étiquettes de point restent toujours à travers tous les plans de la pile lorsque la case à cocher Afficher tout est cochée dans le menu des options de l’outil de point (double-cliquez sur l’icône de l’outil de point ), ce qui permet d’éviter de compter la même synapse de ruban plusieurs fois.
  6. Lorsque vous choisissez le prochain IHC à compter, évitez d’ajouter par inadvertance des comptes en ajustant l’image pour afficher complètement le prochain IHC avec l’outil manuel. Passez d’un outil multipoint à un outil ponctuel pour éviter d’ajouter plus de ponctuation aux données précédemment stockées. Cliquez sur une structure d’intérêt dans le prochain IHC et revenez à l’outil multipoint. Répétez les étapes 7.4 à 7.5 jusqu’à ce que tous les CIH d’intérêt soient évalués.
  7. Pour enregistrer des données, cliquez sur un jeu de données dans le gestionnaire de retour sur investissement, puis sur mesure. Attendez qu’une nouvelle fenêtre apparaisse, répertoriant les points de données mesurés. Enregistrez cette liste en tant que fichier de feuille de calcul (fichier | Enregistrer sous). Enregistrez l’image en activant Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Aplatir pour ajouter définitivement les étiquettes de points à la pile. Lorsque vous fermez la pile d’images, acceptez d’enregistrer les modifications.

8. Analyse du volume et de la position de la synapse sur la cellule ciliée

REMARQUE : Les auteurs ont utilisé une procédure programmée sur mesure basée sur Matlab. Comme il n’est pas accessible au public, il n’est décrit ici qu’en termes généraux (voir aussi7). Veuillez contacter l’auteur correspondant si vous souhaitez l’utiliser. La procédure s’attend à une pile d’images triple étiquetée (IHC, pré- et postsynaptique) au format TIFF en entrée, guide l’utilisateur à travers les différentes étapes de l’analyse via une interface graphique et fournit une sortie complète des résultats au format feuille de calcul.

  1. Normaliser la position des structures synaptiques à un système de coordonnées 3D défini par l’étendue individuelle de l’IHC sur l’axe pilier-modiolaire et l’axe apical-basal cochléaire et l’axe supérieur (plaque cuticulaire) de l’IHC vers le bas (pôle synaptique).
    NOTE: Les volumes d’éléments synaptiques (pré- et postsynaptiques, et le volume combiné des synapses fonctionnelles) sont fournis en μm3 et normalisés à la valeur médiane respective3.

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Résultats

Les cochlées ont été soit récoltées après perfusion cardiovasculaire avec fixateur de l’animal entier, soit rapidement disséquées après euthanasie de l’animal et fixées par immersion. Avec cette dernière méthode, les IHC sont restés en place pendant la dissection, alors que, en cas de perfusion infructueuse et donc de tissu insuffisamment fixé, l’épithélium sensoriel était souvent détruit. Notez que les auteurs ont rencontré des cas où la fixation des cochlées après perfusion transcardique était insuffisante alors que la...

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Discussion

Avec la méthode décrite dans ce protocole, il est possible d’immunomarquer les IHC et les structures synaptiques dans les cochlées des gerbilles jeunes adultes et âgées, d’identifier les synapses fonctionnelles présumées par colocalisation d’éléments pré- et postsynaptiques, de les attribuer à des IHC individuels et de quantifier leur nombre, leur volume et leur emplacement. Les anticorps utilisés dans cette approche ont également marqué les cellules ciliées externes (OHC; myoVIIa) et leurs rubans présynaptiques. En outr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs remercient Lichun Zhang d’avoir aidé à établir la méthode et l’unité de service de microscopie à fluorescence de l’Université Carl von Ossietzky d’Oldenburg pour l’utilisation des installations d’imagerie. Cette recherche a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne -EXC 2177/1.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine Fraction V sans biotineCarl Roth0163.2
anti-CtBP2 (souris monoclonale IgG1)BD Biosciences, Eysins612044
anti-GluA2 (souris monoclonale IgG2a)MilliporeMAB39
anti-souris (IgG1)-AF 488Molecular Probes Inc.A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal de lapin)Proteus Biosciences25e6790
Porte-lame & Disjoncteur - Mâchoires plates Outils descience fine10052-11
Ciseaux artériels Bonn - Pointe de bouleOutils de science fine14086-09
Epaisseur de lamelle 1.5H, 24 x 60 mmCarl RothLH26.1
Lame chirurgicale jetableHenry Schein0473
âne anti-lapin (IgG)-AF647Life Technologies-Sondes moléculairesA-31573
Dumont #5 - Pince fineOutils de science fine11254-20
Pince Dumont #5SFOutils de science fine11252-00
Éthanol, absolu 99,8 %Fisher Scientific12468750
Acide éthylènediaminetétraacétiqueCarl Roth8040.2
ExcelMicrosoft Corporation
Plume Lame Double EdgePLANO112-9
G19 CanuleHenry Schein9003633
chèvre anti-souris (IgG2a)-AF568InvitrogenA-21134
HeparineRatiopharmN68542.04
Huygens EssentialsScientific Volume Imaging
ImageJFiji
Immersol, Huile d’immersion 518FCarl Zeiss10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)Braun4062957E
ISM596DIsmatecPompe péristaltique
KL 1600 LEDSchott150.600Source lumineuse pour stéréomicroscope
Leica Suite d’applications XLeica Microsystem CMS GmbH
Système Leica TCS SP8Leica Microsystem CMS GmbH
MatlabThe Mathworks Inc.
Mayo Ciseaux Carbure de tungston ToghCutFine Science Tools14512-17
Mini-100 Orbital-GenieScientific IndustriesSI-M100pour une utilisation en environnement froid
Narcoren (pentobarbital)Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-EiNikon
NIS ElementsNikon Europe B.V.
ParaformaldéhydeCarl Roth0335.3
Boîte de Pétri sans éventsAvantor VWR390-1375
Saline tamponnée au phosphate :
Phosphate disodiqueAppliChemA1046
Phosphate monopotassiqueCarl Roth3904.1
Chlorure de potassiumCarl Roth6781.1
Chlorure de sodiumSigma Aldrich31434-M
Récipients à bouchon à visSarstedt75.562.300
Azoture de sodiumCarl RothK305.1
Student Adson ForcepsFine Science Tools91106-12
Student Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools91308-12
Lames de microscope à adhérence SuperfrostEprediaJ1800AMNZ
Triton  ; XCarl Roth3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence QuencherBiotium23007
Vannas Ciseaux à ressort, 3mmFine Science Tools15000-00
Vectashield Antifade Montage MediumVector LaboratoriesH-1000
Vibrax VXR basicIKA0002819000
VX 7 Accessoire de parabole pour Vibrax VXR basicIKA953300
Wild TYP 355110 (Stéréomicroscope)Wild Heerbruggn’est plus disponible

Références

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  3. Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
  4. Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
  5. Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
  6. Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
  7. Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
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