Cultiver et manipuler génétiquement des nématodes entomopathogènes

Résumé

Les nématodes entomopathogènes vivent en symbiose avec les bactéries et, ensemble, ils infectent avec succès les insectes en sapant leur système immunitaire inné. Pour promouvoir la recherche sur la base génétique de l’infection par les nématodes, des méthodes de maintien et de manipulation génétique des nématodes entomopathogènes sont décrites.

Résumé

Les nématodes entomopathogènes des genres Heterorhabditis et Steinernema sont des parasites obligatoires des insectes qui vivent dans le sol. La principale caractéristique de leur cycle de vie est l’association mutualiste avec les bactéries Photorhabdus et Xenorhabdus, respectivement. Les parasites nématodes sont capables de localiser et d’entrer dans des hôtes d’insectes appropriés, de subvertir la réponse immunitaire des insectes et de se multiplier efficacement pour produire la prochaine génération qui chassera activement de nouvelles proies d’insectes à infecter. En raison des propriétés de leur cycle de vie, les nématodes entomopathogènes sont des agents de lutte biologique populaires, qui sont utilisés en combinaison avec des insecticides pour lutter contre les insectes nuisibles agricoles destructeurs. Simultanément, ces nématodes parasites représentent un outil de recherche pour analyser la pathogénicité des nématodes et les réponses anti-nématodes de l’hôte. Cette recherche est facilitée par le développement récent de techniques génétiques et d’approches transcriptomiques pour comprendre le rôle des molécules sécrétées par les nématodes au cours de l’infection. Ici, un protocole détaillé sur le maintien des nématodes entomopathogènes et l’utilisation d’une procédure d’élimination des gènes est fourni. Ces méthodologies favorisent davantage la caractérisation fonctionnelle des facteurs d’infection par les nématodes entomopathogènes.

Introduction

La recherche sur les nématodes entomopathogènes (EPN) s’est intensifiée au cours des dernières années en raison principalement de l’utilité de ces parasites dans les stratégies de lutte intégrée contre les ravageurs et de leur implication dans la recherche biomédicale fondamentale ^1,2. Des études récentes ont établi l’EPN comme organisme modèle dans lequel examiner les composants génétiques des nématodes qui sont activés au cours des différentes étapes du processus d’infection. Ces informations fournissent des indices critiques sur la nature et le nombre de molécules sécrétées par les parasites pour modifier l....

Protocole

1. Production de juvéniles infectieux de nématodes symbiotiques

1. Couvrir une boîte de Pétri (10 cm) avec un morceau de papier filtre et ajouter environ 10 à 15 larves de Galleria mellonella (Figure 1A).
2. À l’aide d’une pipette, distribuer 2 mL d’eau contenant environ 25 à 50 UI par suspension de 10 μL sur les vers de cire. Conservez la boîte de Petri dans une armoire à température ambiante.
3. Selon l’humidité du papier filtre, ajoutez 1 à 2 mL d’eau tous les 2 jours. Les vers de cire infectés par des IJ meurent normalement dans les 48 heures.
4. Préparez les pièges à eau de White ....

Résultats

Pour évaluer le statut des nématodes H. bacteriophora qui ont subi l’axenisation, la présence ou l’absence de colonies bactériennes de P. luminescens dans les IJ a été déterminée. Pour ce faire, une pastille d’environ 500 UI qui avait déjà été stérilisée en surface et homogénéisée dans le PBS a été collectée. Le traitement témoin positif consistait en une pastille d’environ 500 IJ provenant de la culture de nématodes contenant des bactéries symbiotiques P. luminescens . Les pastilles de nématod.......

Discussion

Comprendre la base moléculaire de l’infection par les nématodes entomopathogènes et de l’immunité anti-nématodes des insectes nécessite la séparation des parasites des bactéries associées mutuellement 13,15,16. Les nématodes entomopathogènes H. bacteriophora et S. carpocapsae vivent respectivement avec les bactéries à Gram négatif P. luminescens et X. nematophila,^{respectiveme.......}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicilline	Fisher Scientific	611770250
Flacon de culture cellulaire T25	Fisher Scientific	156367
Flacon de culture cellulaire T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Huile de maïs	VWR	470200-112
Sirop de maïs	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Tube de culture 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Tube Falcon 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Microinjecteur Femtojet	Eppendorf	5252000021
Papier filtre	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco-Glass
Coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Huile halocarbure 700	Sigma	H8898
Boucle d’inoculation	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Capillaires en verre borosilicaté	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB Poudre de broyeur d’agar 500 g
LB Bouillon	Fisher Scientific	BP1426-500	LB Poudre de broyeur de bouillon 500 g
Leica DM IRB Microscope de recherche inversé	Microscope	Central-MacConkey
medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo	Fisher Scientific	AM1908
Tube de microcentrifugation	VWR	76332-064	1,5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotomètre	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Seringue à aiguille	VWR	BD305155	22G
Bouillon nutritif	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Boîte de Pétri cloisonnée	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Tampon PBS comprimés amorces PCR de qualité biotech 200
comprimés	Azenta-Pestle
	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Boîte
Pétri jetable	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Boîte de Pétri 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Peptone Protéose #3	Thermo Fisher Scientific
Levure extrait	Millipore-Sigma	Y1625