Les patients atteints de fibrose péritonéale sévère ont une morbidité et une mortalité élevées. Le mécanisme de la fibrose péritonéale n’est pas clair. Dans cette étude, nous décrivons un modèle murin expérimental simple de fibrose péritonéale induite par l’injection de liquide de dialyse péritonéale.
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Article de méthode
Un modèle murin cliniquement pertinent de fibrose péritonéale par dialysat et cathéters
Dans cet article
Résumé
Résumé
La fibrose péritonéale peut survenir chez les patients subissant une dialyse péritonéale (MP), et les patients atteints de fibrose péritonéale sévère ont une morbidité et une mortalité élevées. Une péritonite, un liquide de dialyse péritonéale à forte teneur en glucose et une longue période de MP précipitent l’apparition de la fibrose péritonéale. Une étude animale de la fibrose péritonéale est nécessaire en raison des limites des études humaines et in vitro . Cependant, la plupart des modèles animaux n’imitent pas les conditions cliniques. Pour étudier la fibrose péritonéale, nous avons développé un modèle murin cliniquement pertinent en implantant un cathéter péritonéal et en injectant 2,5 % de liquide DP à haute teneur en glucose et 20 mM de méthylglyoxal (MGO) dans la cavité péritonéale par jour pendant 21 jours. L’implantation du cathéter péritonéal évite les lésions péritonéales par les aiguilles et imite les patients atteints de la MP clinique. La coloration par immunofluorescence a montré que les myofibroblastes s’accumulaient dans le péritoine fibrotique. Le groupe expérimental avait un volume d’ultrafiltration et une fonction de transport de la membrane péritonéale plus faibles (test d’équilibre péritonéal). Dans cet article, nous vous fournissons un protocole détaillé du modèle.
Introduction
La dialyse péritonéale (DP) est un type de traitement de remplacement rénal reçu par environ 11 % des patients atteints d’insuffisance rénale terminale (IRT)1. Des études ont rapporté que la fibrose péritonéale se développe chez les patients recevant2. La sclérose péritonéale encapsulante (SPE), une forme sévère de fibrose péritonéale, entraîne une morbidité et une mortalité élevées3. Les facteurs de risque de fibrose péritonéale comprennent la péritonite, l’hyperglycémie liquide de dialyse péritonéale, une longue période de MP et des facteurs génétiques4. Le mécanisme de la fibrose péritonéale implique des changements complexes dans le microenvironnement péritonéal et une diaphonie entre différents types de cellules. Les expériences in vitro et les observations cliniques se limitent à fournir des informations mécanistes sur la fibrose péritonéale, et des modèles animaux sont nécessaires. Les animaux de laboratoire tels que les chiens, les lapins, les porcs, les rats et les souris sont généralement utilisés dans la recherche sur les maladies humaines5, dont les souris sont les plus couramment utilisées en raison des avantages de leur petite taille, de leur faible coût et de leur facilité d’expérimentation. De plus, des cellules spécifiques peuvent être étudiées dans des modèles de maladies de souris à l’aide de techniques de traçage de lignée.
L’établissement d’un modèle animal approprié serait utile pour comprendre la physiopathologie de la fibrose péritonéale. Idéalement, ce modèle devrait être peu coûteux, facile à reproduire et constituer la base du traitement clinique de la fibrose péritonéale.
Les modèles animaux actuellement disponibles de fibrose péritonéale sont établis avec l’injection intra-péritonéale de liquide DP à haute teneur en glucose par jour pendant 28 jours, de gluconate de chlorhexidine (CG) trois fois par semaine pendant 3 semaines ou une dose unique d’hypochlorite de sodium 6,7,8. Cependant, ces modèles ont des limites. L’injection de liquide MP à haute teneur en glucose, bien que très pertinente pour la pratique clinique, n’induit qu’une fibrose péritonéale légère et ne permet pas de récapituler les conditions cliniques de la fibrose péritonéale sévère, telles que l’EPS. CG ou hypochlorite peut induire une fibrose péritonéale sévère imitant l’EPS par lésion chimique9. Cependant, le CG et l’hypochlorite peuvent induire des lésions péritonéales et une fibrose par différents mécanismes du liquide MP à haute teneur en glucose.
Cette étude décrit le protocole de développement d’un modèle murin de fibrose péritonéale. Dans ce modèle, un cathéter DP est d’abord inséré, puis des injections quotidiennes de liquide à haute teneur en glucose et de méthylglyoxal (MGO) sont effectuées pendant 21 jours. Le MGO est un produit toxique de dégradation du glucose dans le liquide, et il favorise la formation de produits finaux de glycation avancés, qui induisent l’inflammation et l’angiogenèse10,11. L’ajout de MGO au liquide MP à haute teneur en glucose induit l’accumulation de myofibroblastes et favorise la fibrose péritonéale. Ce modèle imite donc les conditions cliniques.
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Protocole
Les expériences ont été approuvées et menées par le Collège national de médecine de l’Université de Taïwan et le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Collège de santé publique (IACUC). Toutes les souris ont été hébergées sous des soins standard.
1. Expérimentation animale
- Utiliser des souris C57BL/6 de type sauvage (WT) mâles et femelles âgées de plus de 11 semaines.
- Préparez le matériel chirurgical, y compris un port en silicone 4-français de souris, des gants, des champs opératoires, des cathéters, des sutures et des aiguilles.
- Implantez le port de la souris comme suit :
- Anesthésier les souris avec de la kétamine/xylazine (100/10 mg/kg de poids corporel) par injection sous-cutanée.
- Vérifiez la fréquence respiratoire et la profondeur de l’anesthésie des souris pendant la chirurgie pour vous assurer des conditions d’anesthésie.
REMARQUE : Si la fréquence respiratoire des souris devient rapide et courte, ajoutez 20 % de la dose précédente.
- Vérifiez la fréquence respiratoire et la profondeur de l’anesthésie des souris pendant la chirurgie pour vous assurer des conditions d’anesthésie.
- Placez les souris en position couchée pendant l’anesthésie. Rasez et nettoyez une zone de 2 cm x 3 cm sur le dos gauche pour la chirurgie et désinfectez la peau avec de la povidone iodée.
- Faites une incision de 1,5 cm dans la peau du dos gauche.
- Disséquez soigneusement entre la peau et le muscle du dos gauche pour créer un espace de 1 cm x 2 cm pour implanter le port de la souris.
- Perforez un petit trou sur le muscle du dos gauche.
- Insérez la partie distale totale 4-française du port de la souris dans la cavité péritonéale
- Suture (nylon 4-0) : la racine du port de la souris vers le muscle du dos.
- Placez la tête de l’orifice de la souris entre la peau et les muscles du dos.
- Fermez la peau à l’aide de clips réflexes (7 mm).
REMARQUE : Les clips réflexes sont meilleurs que les sutures car les souris mordent souvent la plaie. - Démarrez l’expérience après 7 jours d’implantation du port de la souris. Divisez au hasard les souris en groupes expérimentaux et témoins.
- Désinfectez la peau au site d’accès avec de la povidone iodée avant d’injecter du liquide.
- Injecter dans le groupe de liquide DP (PDF) 2,5 % de liquide DP et 20 mM de MGO dans un total de 2 ml par jour par voie intrapéritonéale pendant 21 jours. Injectez dans le groupe témoin une solution saline normale (NS).
- Anesthésier les souris avec de la kétamine/xylazine (100/10 mg/kg de poids corporel) par injection sous-cutanée.
2. Test de la fonction péritonéale (test d’équilibre péritonéal)
- Préparez un liquide à 2,5 % (2 ml) et mesurez la concentration de glucose du liquide DP, définie comme la concentration initiale de glucose (D0).
- Injectez le liquide dans le port de la souris.
- Après 30 min, sacrifiez les souris par surdosage d’isoflurane (100 %).
- Prélevez le liquide intra-abdominal à l’aide d’une seringue, puis mesurez le volume de liquide, défini comme le volume d’ultrafiltration.
- Mesurez la concentration de glucose du liquide intra-abdominal, définie comme la concentration finale de glucose (D).
- Calculer l’équilibre péritonéal ou la fonction péritonéale12.
REMARQUE : Test d’équilibre péritonéal12 = Concentration finale de glucose dans le liquide (D)/ Concentration initiale de glucose dans le liquide (D0). La concentration de glucose est détectée par la méthode de l’hexokinase à l’aide d’un analyseur biochimique13.
3. Préparation des tissus et analyse histologique
- Prélever les tissus péritonéaux : la paroi abdominale supérieure droite (1 cm x 1 cm) et le foie. Fixer le tissu péritonéal avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 2 h, puis toute la nuit dans une solution de saccharose à 18 %7.
- Préparez des coupes congelées de 4 m d’épaisseur de tissu péritonéal et effectuez l’analyse histologique comme publié précédemment7.
- Effectuer une coloration par immunofluorescence.
- Utilisez des anticorps primaires contre les protéines suivantes pour l’immunomarquage : actine musculaire α-lisse (SMA ; 2 h, 1:200) pour détecter les myofibroblastes, cytokératine (2 h, 1:200) pour la détection des cellules mésothéliales et 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (5 min, 1:1000) pour détecter les noyaux cellulaires.
- Exprimer les données obtenues dans un format approprié.
REMARQUE : Dans cette étude, les données ont été exprimées en moyenne ± MEB. Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique approprié (Table des matériaux), et la signification statistique a été évaluée par ANOVA à un facteur ou test t.
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Résultats
L’histologie du tissu péritonéal a été examinée, ce qui a montré que la fibrose péritonéale a été induite avec succès dans le groupe liquide MP plus MGO (PDF). La coloration par immunofluorescence du péritoine viscéral de la surface du foie a montré une accumulation de myofibroblastes plus importante dans le péritoine lésé du groupe PDF que dans le groupe témoin (Figure 1). Comme le montre la figure 2A, le groupe PDF avait un volume d’ultrafiltration inférieur à...
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Discussion
Le péritoine a un péritoine viscéral et pariétal, recouvrant les organes abdominaux et les parois abdominales. Il est composé d’une monocouche de cellules mésothéliales, d’une couche sous-mésothéliale, de séreuses, de fibroblastes, de lymphocytes et de protéines sécrétées14. La fibrose péritonéale est la perte et la dénudation des cellules mésothéliales, l’épaississement sous-mésothélial, et l’accumulation de nombreuses cellules inflammatoires
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l’hôpital universitaire national de Taïwan (NTUH) 111-UN0026.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| anti-large spectre Cytokératine | anticorps abcam | ab9377 | |
| Beckman Coulter | Beckman Coulter | AU5800 | Analyseur biochimique |
| DAPI, 4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole | anticorps Sigma-Aldrich | 98718-90-3 | |
| Drape | tout | ||
| FITC chèvre anti-lapin | Jackson ImmunoResearch Secondaire Anticorps | 111-095-144 | |
| Gants | n’importe quel | ||
| GraphPad Prizm | Logiciel GraphPad | Logiciel GraphPad 9.0 | |
| Kellys | n’importe quel | ||
| Méthylglyoxal (MGO) | Sigma-Aldrich | ||
| Mini-UTE Souris | d’accès au | MMP-4S 061108B | Souris 4-Français Port |
| en siliconeAnticorps monoclonal anti-actine, &alpha ;-muscle lisse-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Aiguilles | n’importe quel | ||
| Clips Reflex 7 mm | n’importe quel | ||
| Suture 4-0 Nylon | n’importe quel |
Références
- Jain, A. K., Blake, P., Cordy, P., Garg, A. X. Global trends in rates of peritoneal dialysis. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 533-544 (2012).
- Zhou, Q., Bajo, M. A., Del Peso, G., Yu, X., Selgas, R. Preventing peritoneal membrane fibrosis in peritoneal dialysis patients. Kidney International. 90 (3), 515-524 (2016).
- Brown, M. C., Simpson, K., Kerssens, J. J., Mactier, R. A. Scottish Renal Registry. Encapsulating peritoneal sclerosis in the new millennium: A national cohort study. ClinicalJournal of the American Society of Nephrology. 4 (7), 1222-1229 (2009).
- Aroeira, L. S., et al. Epithelial to mesenchymal transition and peritoneal membrane failure in peritoneal dialysis patients: Pathologic significance and potential therapeutic interventions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2004-2013 (2007).
- Yang, B., et al. Experimental models in peritoneal dialysis (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (3), 240(2021).
- Pawlaczyk, K., et al. Animal models of peritoneal dialysis: Thirty Years of our own experience. BioMed Research International. 2015, 261813(2015).
- Chen, Y. T., et al. Lineage tracing reveals distinctive fates for mesothelial cells and submesothelial fibroblasts during peritoneal injury. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (12), 2847-2858 (2014).
- Yokoi, H., et al. Pleiotrophin triggers inflammation and increased peritoneal permeability leading to peritoneal fibrosis. Kidney International. 81 (2), 160-169 (2012).
- Hoff, C. M. Experimental animal models of encapsulating peritoneal sclerosis. Peritoneal Dialysis International. 25, Suppl 4 57-66 (2005).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (2), 437-447 (2009).
- Nagai, T., et al. Linagliptin ameliorates methylglyoxal-induced peritoneal fibrosis in mice. PLoS One. 11 (8), 0160993(2016).
- Kakuta, T., et al. Pyridoxamine improves functional, structural, and biochemical alterations of peritoneal membranes in uremic peritoneal dialysis rats. Kidney International. 68 (3), 1326-1336 (2005).
- Barthelmai, W., Czok, R. Enzymatic determinations of glucose in the blood, cerebrospinal fluid and urine. Klinische Wochenschrift. 40, 585-589 (1962).
- Williams, J. D., et al. Morphologic changes in the peritoneal membrane of patients with renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (2), 470-479 (2002).
- Hurst, S. M., et al. Il-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. Immunity. 14 (6), 705-714 (2001).
- Pawlaczyk, K., et al. Vascular endothelial growth factor in dialysate in relation to intensity of peritoneal inflammation. The International Journal of Artificial Organs. 31 (6), 535-544 (2008).
- Loureiro, J., et al. Blocking TGF-beta1 protects the peritoneal membrane from dialysate-induced damage. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (9), 1682-1695 (2011).
- Margetts, P. J., et al. Transforming growth factor beta-induced peritoneal fibrosis is mouse strain dependent. Nephrology, Dialysis Transplantation. 28 (8), 2015-2027 (2013).
- Huang, J. W., et al. Tamoxifen downregulates connective tissue growth factor to ameliorate peritoneal fibrosis. Blood Purification. 31 (4), 252-258 (2011).
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Réimpressions et autorisations
