En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.
Article de méthode
Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les champignons filamenteux sont des habitants prospères du sol et jouent un rôle majeur dans les écosystèmes du sol, tels que la décomposition de la matière organique et inorganique, ainsi que la régulation des niveaux de nutriments. Ils y trouvent également de nombreuses occasions d’interagir avec une variété d’autres microbes tels que des bactéries ou d’autres champignons. L’étude des interactions fongiques au niveau cellulaire, cependant, peut être difficile en raison de la nature du sol ressemblant à une boîte noire. De nouveaux outils microfluidiques sont en cours de développement pour l’étude des interactions fongiques; deux plateformes conçues pour étudier les interactions bactérien-fongique et fongique-fongique sont mises en évidence. Au sein de ces microcanaux, les interactions fongiques-microbiennes peuvent être surveillées dans des environnements physico-chimiques contrôlés à une résolution temporelle et spatiale plus élevée qu’auparavant. L’application de ces outils a donné lieu à de nombreuses nouvelles connaissances biologiques, telles que l’observation de l’attachement polaire bactérien aux hyphes ou la révélation d’antagonismes fongiques-fongiques non caractérisés. Une caractéristique clé de ces méthodologies concerne la facilité d’utilisation de cet outil par des non-experts, produisant des technologies hautement traduisibles pour une utilisation dans les laboratoires de microbiologie.
Introduction
Le sol est un environnement exceptionnellement diversifié contenant une abondance de micro-organismes qui jouent un rôle déterminant dans les cyclesdu carbone et du phosphore 1,2. Les champignons filamenteux sont une composante majeure de nombreux écosystèmes en tant que décomposeurs de matière organique et inorganique et peuvent améliorer la nutrition des plantes grâce à la formation de relations symbiotiques 3,4. Dans le sol, les champignons interagissent dynamiquement avec une multitude de microbes tels que d’autres champignons5
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
REMARQUE : Un résumé des procédures décrites dans ce protocole est illustré visuellement à la figure 2.
Figure 2 : Représentation schématique de la méthodologie présentée, composée de cinq grandes sections détaillées dans le présent protocole. Les conceptions d’appareils sont créées à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) et d’un moule maître fabriqué à l’aide de la photolithogr....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Des résultats représentatifs sont présentés à partir des dispositifs exemplaires BFI40 et FFI41. Les mesures du taux de croissance de l’hyphalie peuvent facilement être obtenues à l’aide de ces dispositifs en combinaison avec des techniques de microscopie de base. La figure 3A-B illustre les interactions bactériens-fongiques entre C. cinerea hyphae et B. subtilis NCIB 3610. La présence de .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Cet article présente un protocole pour l’étude des interactions fongiques-microbiennes à l’aide de la microfluidique des canaux. Les auteurs visent à démontrer la polyvalence de ces dispositifs et à encourager l’adaptation en fonction des intérêts du chercheur. En utilisant les dispositifs BFI et FFI exemplaires, les interactions fongiques-microbiennes peuvent être étudiées plus en détail qu’auparavant. En supprimant la complexité et l’hétérogénéité du fond du sol, en modérant la croissance des hyphes de telle sorte qu’i.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Nous reconnaissons le soutien financier du département de bio-ingénierie de l’Imperial College de Londres et du Leverhulme Trust (référence de subvention de recherche: RPG-2020-352).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Utilisé pour solidifier le milieu de culture pour la culture bactérienne et fongique dans des boîtes de Pétri |
| Feuille d’aluminium | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Centrifugeuse Systec | ||
| (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotriméthysilane | Merck Life Sciences | 386529 | ATTENTION : Le chlorotriméthylsilane est une substance dangereuse. Portez l’EPI approprié et manipulez-le avec soin. Évitez tout contact avec la peau et les yeux et évitez l’inhalation. Tenir à l’écart des sources d’inflammation et utiliser dans un endroit bien ventilé. |
| Perceuse de liège | SLS | COR1000 | |
| Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | ATTENTION : la solution de révélateur mr-Dev 600 est inflammable | |
| Erlenmeyer flacons | VWR | 214-1108 | par exemple 200 mL ; choisissez la taille en fonction de vos besoins exacts |
| Éthanol (70 % v/v) ; | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Dilué à partir de 99,8 % (qualité réactif analytique) |
| Fiji | ImageJ | Progiciel exemplaire pour le traitement de l’imagerie | |
| Air comprimé | Disponible en standard dans la plupart des laboratoires. Alternativement, un compresseur sans huile avec régulateur d’air peut être utilisé. | ||
| Pince à épiler à gaufrettes à tête plate | SLS | INS5026 | |
| Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | en verre courbée et pointue |
| World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm | |
| Boîte de Pétri à fond en verre | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Boîtes de cristallisation en verre | VWR | 216-1865 | D’occasion pour le lavage des dalles PDMS |
| Plats de cristallisation en verre | VWR | 216-1866 | Utilisé dans le développement de moules maîtres |
| Bouteilles en verre | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | par exemple 250 ml ; choisissez la taille en fonction de vos besoins précis |
| Seringue en verre (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Utilisé pour la distribution de chlorotriméthylsilane |
| Plaque chauffante (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Boucle d’inoculation | VWR | COPA175CS01 | |
| Alcool isopropylique | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Hotte à flux laminaire | Air Science (PCR) | Hotte à flux laminaire exemplaire utilisée pour la fabrication de dispositifs | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Bouillon nutritif exemplaire pour la culture |
| bactérienne pendant la nuitMoteur de lumière à diode électroluminescente (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Source lumineuse exemplaire pouvant être utilisée pour l’imagerie des interactions fongiques-microbiennes (fluorescence) | |
| MA6 Aligneur de masque ultraviolet | Suss Microtec | ||
| Extrait de malt | VWR | 84618 | Utilisé pour fabriquer un milieu de culture fongique exemplaire (gélose à l’extrait de malt) |
| Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Exemple d’un graveur de masque qui peut être utilisé pour imprimer un photo-masque pour la photolithographie |
| Moule maître, support | , imprimé en 3D, support sur mesure fabriqué en interne | ||
| , armoire de sécurité microbiologique. (BioMat2) | d’air confiné | Exemplaire MSC utilisé pour la culture microbienne et l’inoculation de dispositifs | |
| Eau | Disponible en standard dans les laboratoires de biologie. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Logiciel d’imagerie de recherche avancée | Nikon | Exemplar progiciel pour l’acquisition d’images | |
| NIS-Elements Free Viewer | Exemplar pour la visualisation des images acquises | ||
| Four (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Utilisé pour le durcissement du poly(diméthylsiloxane)(PDMS) |
| Four (CLO-2AH-S) | KOYO | Utilisé pour la préparation de plaquettes de silicium | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | film transparent |
| Boîtes de Pétri, carrées stériles | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | de 120,5 mm |
| , stériles | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm ; |
| Masque de photolithographie | Micro Lithography Services Ltd. Royaume-Uni | ||
| Nettoyeur de plasma (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Gobelet en plastique | Semadeni | 8323 | |
| Spatule en plastique | Semadeni | 3340 | |
| Balance de précision portable (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Utilisé pour le pesage PDMS, supports composants, etc. |
| Coupeuse de précision | Syneo | Diamètre de l’arête de coupe : 3,18 mm | |
| Coupeuse de précision | Syneo | HS1871730P1183S | Diamètre de l’arête de coupe : 4,75 mm |
| Profilomètre | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Lames de rasoir | Hä ; berle Labortechnik | 9156110 | |
| réfrigérateur | Haden | 4-6 ° ; C | |
| Caméra CCD Retiga R1 | Qimaging | Caméra exemplaire qui peut être utilisée pour l’imagerie des interactions fongiques-microbiennes | |
| Ruban magique Scotch | Magic Tape Office Depot | 3969954 | Ruban invisible de 19 mm ; ruban transparent |
| Incubateur à secousses (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Plaquette de silicium | Inseto | 100 mm | |
| Verre sodocalcique plaque | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Utilisé pour tenir le masque de photolithographie dans l’aligneur | |
| Chlorure | de sodium Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater ; | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 photoresist | MicroChem | ATTENTION : Le SU-8 photoresist est dangereux, soyez prudent lors de la manipulation et évitez l’inhalation et le contact avec la peau. Inflammable, potentiellement cancérigène et toxique pour l’environnement. | |
| Kit élastomère Sylgard 184 | VWR | 634165S | Utilisé pour la préparation de dispositifs poly(diméthylsiloxane)(PDMS) |
| Incubateur à température contrôlée | Okolab | Incubateur exemplaire pouvant être utilisé pour l’imagerie des interactions fongiques-microbiennes | |
| Microscope à épifluorescence inversée Ti2-E | MEA54000 | Microscope exemplaire pouvant être utilisé pour l’imagerie des interactions fongiques-microbiennes | |
| Nettoyeur à ultrasons S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Dessiccateur sous vide | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | dégazage de la silianisation et du PDMS doit être effectué dans des dessiccateurs séparés |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objectif | Nikon | MRH20105 | Objectif exemplaire pouvant être utilisé pour l’imagerie des interactions fongiques-microbiennes |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objectif | Nikon | MRH48230 | Objectif exemplaire pouvant être utilisé pour l’imagerie des interactions fongiques-microbiennes |
Références
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial fun....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demander une autorisation