Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire

Résumé

Le présent protocole décrit la préparation et l’utilisation de tranches pulmonaires coupées avec précision par des souris pour évaluer la contractilité des voies respiratoires et des muscles lisses artériels intrapulmonaires dans un milieu presque in vivo .

Résumé

Les cellules musculaires lisses (SMC) médient la contraction des voies respiratoires et de l’artère intrapulmonaire pour modifier la résistance au flux d’air et la circulation pulmonaire, respectivement, jouant ainsi un rôle essentiel dans l’homéostasie du système pulmonaire. La dérégulation de la contractilité SMC contribue à plusieurs maladies pulmonaires, y compris l’asthme et l’hypertension pulmonaire. Cependant, en raison de l’accès limité aux tissus et d’un manque de systèmes de culture pour maintenir les phénotypes SMC in vivo , les mécanismes moléculaires sous-jacents à la contractilité DÉRÉGULée du SMC dans ces maladies restent pleinement identifiés. La tranche de poumon découpée avec précision (PCLS) offre un modèle ex vivo qui contourne ces difficultés techniques. En tant que section de tissu pulmonaire mince et vivant, le PCLS retient le SMC dans un environnement naturel et permet un suivi in situ de la contraction du SMC et de la signalisation intracellulaire Ca²⁺ qui régule la contractilité du SMC. Ici, un protocole détaillé de préparation PCLS de souris est fourni, qui préserve les voies respiratoires intactes et les artères intrapulmonaires. Ce protocole implique deux étapes essentielles avant de soumettre le lobe pulmonaire au tranchage: gonfler les voies respiratoires avec de l’agarose à faible point de fusion à travers la trachée et remplir les vaisseaux pulmonaires de gélatine à travers le ventricule droit. Le PCLS préparé à l’aide de ce protocole peut être utilisé pour des essais biologiques afin d’évaluer la régulation contractile médiée par ca²⁺ de la SMC dans les voies respiratoires et les compartiments artériels intrapulmonaires. Lorsqu’il est appliqué à des modèles murins de maladies respiratoires, ce protocole permet l’étude fonctionnelle de la SMC, fournissant ainsi un aperçu du mécanisme sous-jacent de la dérégulation de la contractilité SMC dans les maladies.

Introduction

La cellule musculaire lisse (SMC) est un type de cellule structurelle majeur dans le poumon, résidant principalement dans la paroi médiale des voies respiratoires et des vaisseaux pulmonaires. Les SMC se contractent pour modifier le calibre luminal, régulant ainsi le flux d’air et de sang ^1,2. Par conséquent, la régulation contractile des SMC est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la ventilation de l’air et de la circulation pulmonaire. En revanche, la contractilité aberrante du SMC provoque des maladies vasculaires obstructives ou pulmonaires comme l’asthme et l’hypertension artérielle pulmonaire. Ce....

Protocole

Tous les soins aux animaux étaient conformes aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee du Massachusetts General Hospital. Des souris mâles de type sauvage C57/B6, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation expérimentale

1. Préparez la solution de travail.
   1. Préparez 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS, avec Ca²⁺ et Mg²⁺, et pH équilibré avec 20 mM HEPES, voir Tableau des matériaux). Utilisez la solution HBSS pour préparer et traiter le PCLS. Gardez la solution HBSS froide sur la glace lors de la préparation d....

Résultats

Préparation pcLS de souris préservant les voies respiratoires et les artères intrapulmonaires intactes
Un PCLS de 150 μm d’épaisseur a été observé au microscope à contraste de phase inversé. Dans les poumons de souris, les voies respiratoires conductrices sont accompagnées d’artères intrapulmonaires, allant du hile au poumon périphérique. Un faisceau sinusoïdal-artère pulmonaire représentatif dans un PCLS de souris est illustré à la figure 2B. Les voies respiratoires peuv.......

Discussion

La préparation du PCLS implique plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, il est essentiel de gonfler le lobe pulmonaire de manière homogène pour éviter la variation de la rigidité tissulaire due à une distribution inégale de l’agarose. Comme l’agarose liquide se gélifie rapidement dans de minces cathéters ou des voies respiratoires à une température inférieure à 37 ° C, le défaut de remplissage résultant dans le champ pulmonaire distal pourrait augmenter la disparité de la rigidité du tissu pulmonaire et provoquer une d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 1 mL	BD	309626
Tubes à centrifuger stériles de 15 mL	Seringue Celltreat	229411
de 3 mL	Tubes
50 mL	Celltreat	229422
Acétyl-bêta-méthacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotique-anitmycotique	Thermo Fisher	15240-062
Appareil photo CCD	Nikon	Nikon Ds-Ri2 Lunettes
de protection	Fisher Scientific	12-548-5CP ; 12-548-5PP
Flacons cryogéniques	Fisher Scientific	430488
Microscope			Détails dans la référence 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothéline 1	Millipore Sigma	E7764
Ciseaux à dissection fine	Fisher Scientific	NC9702861
Récipient de congélation	Sigma-Aldrich	C1562
Gélatine de peau de porc	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)	Thermo Fisher
Pince hémostatique	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Graisse silicone sous vide élevé	Fisher Scientific	146355d
Alcool isopropylique	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Rondelles métalliques	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Rondelles plates #10
Pince à micro-dissection	Sigma-Aldrich	F4142
Aiguille pour les veines du cuir chevelu (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Maille de nylon	Approvisionnement en composants	U-CMN-300
Vert Oregon 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Contraste de phase microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Lames de rasoir	Personna		Personna Double Edge Lames de rasoir en emballage blanc 100 fils
Sulfobromophtalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue	Krazy Glue
Ultrapure faible agarose au point de fusion	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Bloc de refroidissement Vibratome	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Tube d’échantillon Vibratome	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Cathéter IV en forme de Y	BD	383336	BD Saf-T-Intima cathéter IV fermé