Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)

Résumé

En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.

Résumé

Le protocole actuel décrit l’utilisation de particules lentivirales pour l’administration d’ARN courts en épingle à cheveux (shRNA) à la fois aux cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ainsi qu’aux cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées des CSEh à haute efficacité. Les particules lentivirales ont été générées en co-transfectant des cellules HEK293T à l’aide de vecteurs d’entrée (porteurs d’ARNh) ainsi que de plasmides d’emballage (pAX et pMD2.G) à l’aide du polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI). Les particules virales ont été concentrées par ultracentrifugation, ce qui a donné des titres moyens supérieurs à 5 x 10⁷. Les CSEh et les CNP pourraient être infectés à des rendements élevés à l’aide de ces particules lentivirales, comme le montrent la sélection de la puromycine et l’expression stable dans les CSEh, ainsi que l’expression transitoire de GFP dans les CNP. De plus, l’analyse par transfert western a montré une réduction significative de l’expression des gènes ciblés par les shRNA. En outre, les cellules ont conservé leur pluripotence ainsi que leur potentiel de différenciation, comme en témoigne leur différenciation ultérieure en différentes lignées de SNC. Le protocole actuel traite de la livraison des shRNA; cependant, la même approche pourrait être utilisée pour l’expression ectopique des ADNc pour les études de surexpression.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste sont pluripotentes et peuvent être différenciées en différents types de cellules en fonction de facteurs externes dans des conditions in vitro ^1,2. Afin d’exploiter pleinement le potentiel des CSEh, il est impératif de disposer de méthodes d’administration rapides et fiables des gènes pour ces cellules. Classiquement, les techniques utilisées peuvent être classées en deux types : les systèmes d’administration de gènes non viraux et viraux ^3,4

Protocole

1. Transfection de cellules HEK293T à l’aide d’un réactif PEI ou Lipofectamine 3000

1. Culture de cellules HEK293T dans du DMEM + 10% FBS + 1x pénicilline/streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO_{2 et 21} % O₂ jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 90% avant l’ensemencement pour la transfection. Utilisez un nombre relativement faible de cellules de passage pour une production élevée de virus à titre élevé (idéalement inférieur à P30).
2. Ensemencez 4 x 10⁶ cellules dans 10 mL de milieu de croissance complet dans une plaque de culture tissulaire de 100 mm et cultiv....

Résultats

Après le transfert de gènes, une viabilité élevée des CSEh est inévitablement requise. Malgré les efforts et l’optimisation des protocoles pour réduire la mort cellulaire après l’électroporation des CSEh, plus de 50% de la mort cellulaire est encore observée après l’électroporation de ces cellules, ainsi qu’une faible efficacité de transfection²⁰. Le transfert de gènes à médiation lentivirale entraîne non seulement une grande efficacité du transfert de gènes, mais démontre également des niveaux él.......

Discussion

La capacité de modifier génétiquement les cellules souches à des fins d’étude ou cliniques est limitée à la fois par la technologie et la compréhension de base de la biologie des CSEh. Les techniques qui ont montré un potentiel important dans les CSE de souris, comme la lipofection et l’électroporation, ne sont pas très efficaces pour les CSEh, qui sont notoirement difficiles pour l’administration de gènes par les méthodes conventionnelles²⁰. Cette notion a conduit non seulement à l’optimisation d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38,5 mL, stérile + certifié libre Tubes ultra-transparents à couvercle mince	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF	Invitrogen	PHG0261
Albumine sérique bovine FRAC V	Invitrogen	15260037
Matrice de membrane basale Corning Matrigel, sans LDEV	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
Milieu DMEM	Invitrogen	11995073
DMEM Mélange de nutriments F12  ;	Invitrogen	11320033
DPBS sans : Ca et Mg	PAN Biotech	P04-36500
Sérum de bovie fœtal	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Anticorps mAb de lapin	CST	2118S
Réactif de dissociation cellulaire douce	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Acides aminés non essentiels (NEAA) 100X	GE healthcare	SH30238,01
L de glutamine, 100X  ;	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Anticorps polyclonal	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq : CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 milieu complet	Stem Cell Technologies	85850
Milieu neurobasal 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplément 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplément 50x	PAN Biotech	P07-07200
Pénicilline streptomycine SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 Vecteur TRC	Addgene	10878
pLL3.7 vecteur  ;	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Réactif d’infection à base de polybrène	Sigma	TR1003- G
Polyéthylénimine, ramifié	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen
inhibiteur de ROCK Y-27632 dichlorhydrate  ;	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsine .05 % EDTA  ;	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10

humain recombinant SolutionA1113802