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Article de méthode

Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)

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DOI :

10.3791/63953

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24 mai 2022

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

Dans cet article

Résumé

En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.

Résumé

Le protocole actuel décrit l’utilisation de particules lentivirales pour l’administration d’ARN courts en épingle à cheveux (shRNA) à la fois aux cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ainsi qu’aux cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées des CSEh à haute efficacité. Les particules lentivirales ont été générées en co-transfectant des cellules HEK293T à l’aide de vecteurs d’entrée (porteurs d’ARNh) ainsi que de plasmides d’emballage (pAX et pMD2.G) à l’aide du polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI). Les particules virales ont été concentrées par ultracentrifugation, ce qui a donné des titres moyens supérieurs à 5 x 107. Les CSEh et les CNP pourraient être infectés à des rendements élevés à l’aide de ces particules lentivirales, comme le montrent la sélection de la puromycine et l’expression stable dans les CSEh, ainsi que l’expression transitoire de GFP dans les CNP. De plus, l’analyse par transfert western a montré une réduction significative de l’expression des gènes ciblés par les shRNA. En outre, les cellules ont conservé leur pluripotence ainsi que leur potentiel de différenciation, comme en témoigne leur différenciation ultérieure en différentes lignées de SNC. Le protocole actuel traite de la livraison des shRNA; cependant, la même approche pourrait être utilisée pour l’expression ectopique des ADNc pour les études de surexpression.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste sont pluripotentes et peuvent être différenciées en différents types de cellules en fonction de facteurs externes dans des conditions in vitro 1,2. Afin d’exploiter pleinement le potentiel des CSEh, il est impératif de disposer de méthodes d’administration rapides et fiables des gènes pour ces cellules. Classiquement, les techniques utilisées peuvent être classées en deux types : les systèmes d’administration de gènes non viraux et viraux 3,4. Les systèmes d’administration de gènes non viraux les plus fréquemment utilisés sont la lipofection, l’électroporation et la nucléofection. Les systèmes d’administration non virale sont avantageux en raison de moins de mutations d’insertion et d’une diminution globale de l’immunogénicité 5,6. Cependant, ces méthodes entraînent une faible efficacité de transfection et une courte durée d’expression génique transitoire, ce qui est une limitation majeure pour les études de différenciation à long terme7. L’électroporation se traduit par une meilleure efficacité de transfection par rapport à la lipofection; cependant, il en résulte plus de 50% de mort cellulaire 8,9,10. En utilisant la nucléofection, la survie cellulaire et l’efficacité de la transfection peuvent être améliorées en combinant la lipofection et l’électroporation, mais l’approche nécessite des tampons spécifiques aux cellules et un équipement spécialisé et, par conséquent, devient assez coûteuse pour les applications à grande échelle11,12.

En revanche, les vecteurs viraux ont montré une amélioration de l’efficacité de la transfection, ainsi qu’une faible cytotoxicité globale, après la transduction. De plus, les gènes délivrés sont exprimés de manière stable et, par conséquent, rendent cette méthode idéale pour les études à long terme13. Parmi les vecteurs viraux les plus couramment utilisés pour l’administration de gènes dans les CSEh figurent les vecteurs lentiviraux (LVS), qui peuvent donner une efficacité de transduction de plus de 80% en utilisant des particules virales à titre élevé14,15. La lipofection et la précipitation de CaPO4 sont parmi les méthodes les plus couramment utilisées pour transfecter transitoirement les cellules HEK293T ou ses dérivés avec des vecteurs de transfert de gènes ainsi que des plasmides d’emballage pour produire des particules lentivirales16. Bien que la lipofection entraîne une bonne efficacité de transfection et une faible cytotoxicité, la technique est entravée par son coût, et la mise à l’échelle pour obtenir des particules lentivirales à titre élevé serait très coûteuse. La précipitation de CaPO4 entraîne des rendements de transfection relativement similaires à ceux obtenus à l’aide de la lipofection. Bien que rentables, les précipitations de CaPO4 entraînent une mort cellulaire importante après les transfections, ce qui rend difficile la normalisation et évite les variations d’un lot àl’autre 17. Dans ce scénario, le développement d’une méthode qui donne une efficacité de transfection élevée, une faible cytotoxicité et un rapport coût-efficacité est crucial pour la production de particules lentivirales à titre élevé à utiliser dans les CSEh.

La polyéthylèneénamine (PEI) est un polymère cationique qui peut transfecter les cellules HEK293T à haute efficacité sans trop de cytotoxicité et a un coût négligeable par rapport aux méthodes basées sur la lipofection18. Dans cette situation, PEI peut être utilisé pour des applications à grande échelle de la production de LVS à titre élevé grâce à la concentration de particules lentivirales provenant de surnageants de culture à l’aide de diverses techniques. L’article présenté décrit l’utilisation de l’Î.-P.-É. pour transfecter les cellules HEK293T et la concentration de vecteurs lentiviraux à l’aide de l’ultracentrifugation à travers un coussin de saccharose. En utilisant cette méthode, nous obtenons régulièrement des titres bien au-dessus de 5 x 107 UI / mL avec de faibles variations de lot à lot. La méthode est simple, simple et rentable pour les applications à grande échelle pour l’administration de gènes aux CSEh et aux cellules dérivées des CSEh.

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Protocole

1. Transfection de cellules HEK293T à l’aide d’un réactif PEI ou Lipofectamine 3000

  1. Culture de cellules HEK293T dans du DMEM + 10% FBS + 1x pénicilline/streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21 % O2 jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 90% avant l’ensemencement pour la transfection. Utilisez un nombre relativement faible de cellules de passage pour une production élevée de virus à titre élevé (idéalement inférieur à P30).
  2. Ensemencez 4 x 106 cellules dans 10 mL de milieu de croissance complet dans une plaque de culture tissulaire de 100 mm et cultivez pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire humidifié avec une atmosphère de 5% CO2 et 21% O2.
  3. Pour chaque transfection, diluer l’ADN plasmidique (stocks de 1 mg/mL) dans 1 mL de milieu DMEM libre de sérum dans des tubes centrifuges de 1,5 mL en utilisant le rapport suivant de plasmides d’entrée et d’emballage:
    Vecteur d’entrée = 10 μg
    psPAX2.0 = 7,5 μg
    pMD2.G = 5 μg
  4. Vortex pendant 10 s et rotation du tube à 10 000 x g pendant 30 s à température ambiante pour recueillir.
  5. Ajouter 70 μL de (1 mg/mL de solution mère) PEI au tube, puis vortex et rotation brève comme décrit ci-dessus pour recueillir. Le volume d’Î.-P.-É. utilisé est basé sur un rapport de 1:3 de l’ADN total (μg) :P EI (μg).
  6. Pour la transfection à base de lipofectamine, diluer les vecteurs ci-dessus dans 500 μL de milieuX DMEM sans sérum contenant 45 μL de réactif P fourni dans le kit et incuber à température ambiante pendant 5 min.
  7. Diluer 70 μL de réactif L fourni dans le kit à l’aide de 500 μL de milieu DMEM sans sérum et incuber à température ambiante pendant 5 min.
  8. Combinez le contenu des deux tubes et incubez les tubes à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre une formation complexe.
  9. Ajouter goutte à goutte 1 mL d’ADN/PEI ou 1 mL de complexes ADN/lipofectamine à la plaque contenant des cellules et incuber pendant 6 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5 % de CO2 et 21 % d’O2.
  10. Après 6 h, passer à un milieu de croissance complet frais (10 mL) et renvoyer les cellules dans l’incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21% d’O2.

2. Collecte LVS et ultracentrifugation

  1. Après 2 jours de transfection, prélever le milieu contenant le virus et superposer à nouveau les cellules avec 10 mL de milieu de croissance complet frais.
  2. Après 3 jours de transfection, collectez le milieu contenant le virus et combinez-le avec le milieu contenant le virus recueilli au point de temps de 2 jours.
  3. Centrifuger le surnageant viral à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les débris cellulaires.
  4. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à faible liaison aux protéines de 0,45 μm de taille de pore (PES ou SFCA) et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’ultracentrifugation. Le surnageant filtré contenant des particules lentivirales peut être conservé à 4 °C pendant 5 jours sans perte significative de titres viraux.
  5. Stériliser les tubes d’ultracentrifugation contenant les gobelets en les lavant avec de l’éthanol à 70 % pendant 10 min, sécher à l’air, fermer et conserver à 4 °C.
  6. Ajouter 36 mL de milieu filtré contenant des particules lentivirales dans un tube ultracentrifuge stérile.
  7. Remplir 5 mL d’une stripette stérile avec 4 mL de solution stérile de saccharose à 20 % (préparée dans du PBS) et la distribuer directement au fond du tube ultracentrifuge (UC) contenant du LVS. Il est important que la solution de saccharose ne soit pas mélangée au milieu et fasse un gradient au fond du tube.
  8. Équilibrez tous les tubes d’ultracentrifugation à l’aide d’un milieu DMEM sans sérum, placez-les dans les gobelets de maintien du tube d’ultracentrifugation froide et fermez les couvercles.
  9. Faire tourner les tubes à 125 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
  10. Après la rotation, jetez soigneusement le surnageant en inversant le contenu du tube dans un récipient contenant de l’eau de Javel sans perturber la pastille. Marquez la pastille si elle est visible.
  11. Placez le tube d’ultracentrifugation dans un tube stérile de 50 mL et ajoutez 200 μL de DPBS stérile exactement au sommet de la pastille. Conserver à 4 °C pendant la nuit sans être dérangé.
  12. Le lendemain, mélanger doucement en pipetant de haut en bas 40x.
  13. Tournez brièvement à 13 000 x g dans une centrifugeuse de table pour granuler les débris.
  14. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et aliquoter la préparation du virus sous forme d’aliquotes de 20 μL. Conserver à −80 °C.
  15. Réserver 5 μL de la préparation pour les mesures de titre viral.

3. Mesure de titre LVS pour vecteurs basés sur pLKO.1

  1. Déterminez le titre des particules lentivirales à l’aide d’une qPCR en suivant les recommandations du fabricant.
  2. Pour une courbe standard, préparez cinq dilutions en série 10 fois de l’ADN de contrôle standard (fourni dans le kit) en diluant 5 μL d’ADN en 45 μL de H2O sans nucléase à chaque étape. Utilisez des dilutions de 1:100 à 1:100 000 pour générer une courbe standard.
  3. Mettre en place des réactions sur la glace en double de la manière suivante:
    2x mélange maître qPCR 10 μL
    Mélange d’apprêt 2 μL
    Échantillon ou ADN standard 2 μL
    Sans nucléase H2O 6 μL
  4. Effectuez la qPCR en utilisant les conditions de cyclisme mentionnées dans le manuel du kit pour un total de 35 cycles.
  5. Tracez les valeurs de seuil de cycle (Ct) sur l’axe Y par rapport au titre de virus sur l’axe X.
  6. Générez une régression logarithmique à l’aide de quatre dilutions d’ADN de contrôle standard (1:100 à 1:100 000) pour déterminer le titre d’échantillon de virus inconnu à l’aide d’une équation de ligne de tendance.

4. Mesure du titre LVS pour les vecteurs pll3.7

  1. Ensemencer 1 x 105 cellules HEK293T dans chaque puits d’une plaque de puits P12 dans 1 mL de milieu de croissance complet 24 h avant les infections.
  2. Complétez le milieu avec 8 μg/mL de polybrene et ajoutez 1 mL dans chaque tube stérile de 1,5 mL.
  3. Diluer les particules virales en utilisant 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL et 0,1 μL de particules lentivirales concentrées dans chacun des 1 mL de milieux contenant du polybrene.
  4. Remplacer les milieux des cellules HEK293T par les milieux contenant les quantités indiquées de particules lentivirales ainsi que 8 μg/mL de polybrène et incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5 % de CO2 et 21 % d’O2.
  5. Le lendemain, passez à des milieux frais et poursuivez la culture pendant 72 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21% d’O2.
  6. Après 72 h, laver les cellules avec du PBS, trypsiniser à 37 °C selon le protocole du fabricant et remettre en suspension dans 1 mL de PBS.
  7. Effectuez le tri des cellules FACS à l’aide d’un trieur de cellules, en suivant les recommandations du fabricant. Réglez la porte sur 0% de cellules GFP positives en utilisant des cellules HEK293T non infectées et comptez 50 000 événements pour chaque échantillon afin de déterminer le pourcentage de cellules positives pour chaque dilution virale.
  8. Utilisez uniquement les volumes de particules lentivirales qui donnent des cellules %GFP positives de l’ordre de 2% à 20% pour calculer le titre des particules lentivirales.

5. Infection des CSEh et sélection stable

  1. Lavez les cellules avec 2 mL de PBS en croissance dans chaque puits d’une plaque multipuits de culture cellulaire à 6 puits.
  2. Détacher les cellules de la plaque de culture cellulaire à l’aide de 1 mL de réactif de dissociation cellulaire 1x par incubation à 37 °C pendant 5 min.
  3. Prélever les cellules dans un milieu DMEM/F12 et centrifuger à 1 500 x g pendant 5 min à température ambiante pour recueillir la pastille de cellule.
  4. Aspirer, remettre les cellules en suspension dans 1 mL et compter à l’aide d’un hémocytomètre.
  5. Fabriquer une suspension cellulaire avec 2 x 105 cellules/mL de milieu de croissance complet contenant mTeSR1 complété par un facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF) de 10 ng/mL, de pénicilline/streptomycine (P/S) et un inhibiteur de ROCHE (RI) de 10 μM.
  6. Ensemencez 1 x 105 cellules sur 50x plaques de puits P24 enduites de matrice de membrane basale complète diluée dans 500 μL de milieu de croissance complet et cultivez les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21% d’O2.
  7. Le lendemain, infecter les CSEh à une multiplicité d’infection (MOI) de 10 avec 8 μg/mL de polybrene et incuber à 37 °C pendant 8 h.
  8. Après 8 h, remplacer le milieu contenant le virus par un milieu de croissance frais (-RI) et poursuivre la culture jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90 %.
  9. Commencez la sélection de la puromycine (0,8 μg / mL) lorsque les cellules atteignent 90% de confluence, ce qui est généralement 48-72 h après l’infection.
  10. Une fois la sélection terminée (généralement 4-6 jours), divisez les cellules stables (1:4) et élargissez les cellules pour la cryoconservation et une analyse plus approfondie.

6. Transduction des cellules progénitrices neurales (PNJ) dérivées de H9

REMARQUE: Les NPC ont été dérivés de cellules H9 à l’aide d’un protocole d’inhibition à double Smad, comme décrit précédemment19.

  1. En bref, traiter les cellules H9 avec un réactif de dissociation cellulaire à 37 °C pendant 5 min pour générer des cellules individuelles et les remettre en suspension dans un milieu de croissance complet contenant mTeSR1 complété par un facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) de 10 ng/mL, de la pénicilline/streptomycine (P/S) et un inhibiteur de ROCK (RI) de 10 μM. Semer sur des boîtes de culture cellulaire à 6 puits diluées enrobées de Matrigel à une densité de 60 000 cellules/cm2 (jour 0).
  2. Initier la différenciation lorsque les cellules atteignent une confluence de 95 % à 100 % en passant à un milieu KSR à 100 % contenant du LDN193189 (200 nM) et du SB431542 (10 μM) (jour 1).
  3. Le jour 2, changez à nouveau le support avec 100% KSR complété par LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) et XAV939 (5 μM).
  4. Au jour 4 de la différenciation, passez à un mélange de milieu KSR (75%) et de milieu N2 (25%) avec LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) et XAV939 (5 μM).
  5. Du jour 6 au jour 12, passez progressivement le média à 100% N2 complété par LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) et XAV939 (5 μM) en augmentant le média N2 de 25% chaque jour et en changeant le support tous les 2 jours.
  6. Journée de la culture 12 PNJ dans les médias N2:B27 complétés par 20 ng / mL bFGF.
  7. Ensemencez 2 x 105 cellules dans chaque puits d’une plaque P6 enduite de matrice de membrane basale complète diluée de 1:50 dans 2 mL de milieux de culture de PNJ et incubez pour permettre aux cellules de se fixer.
  8. Le lendemain, infecter les cellules avec des particules lentivirales à un MOI 6 en présence de polybrene de 8 μg/mL.
  9. Après 8 h, remplacez le milieu contenant le virus par un milieu de croissance NPC frais.
  10. Le lendemain, répétez les infections et changez le média à 8 h.
  11. Gardez les cellules en culture pendant 72 h avant de les récolter pour une analyse plus approfondie.

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Résultats

Après le transfert de gènes, une viabilité élevée des CSEh est inévitablement requise. Malgré les efforts et l’optimisation des protocoles pour réduire la mort cellulaire après l’électroporation des CSEh, plus de 50% de la mort cellulaire est encore observée après l’électroporation de ces cellules, ainsi qu’une faible efficacité de transfection20. Le transfert de gènes à médiation lentivirale entraîne non seulement une grande efficacité du transfert de gènes, mais démontre également des niveaux él...

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Discussion

La capacité de modifier génétiquement les cellules souches à des fins d’étude ou cliniques est limitée à la fois par la technologie et la compréhension de base de la biologie des CSEh. Les techniques qui ont montré un potentiel important dans les CSE de souris, comme la lipofection et l’électroporation, ne sont pas très efficaces pour les CSEh, qui sont notoirement difficiles pour l’administration de gènes par les méthodes conventionnelles20. Cette notion a conduit non seulement à l’optimisation d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de l’Université des Émirats arabes unis (UAEU), la subvention n ° 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) et # 12R010 (subvention UAEU-AUA). Nous remercions le professeur Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) de nous avoir aidés à éditer le manuscrit pour le style et la grammaire.

Toutes les données sont disponibles sur demande.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MercaptoethanolInvitrogen31350010
38,5 mL, stérile + certifié libre Tubes ultra-transparents à couvercle minceBeckman CoulterC14292
AccutaseStem Cell Technologies7920
bFGFInvitrogenPHG0261
Albumine sérique bovine FRAC VInvitrogen15260037
Matrice de membrane basale Corning Matrigel, sans LDEVCorning354234
CyclopamineStem Cell Technologies72074
Milieu DMEMInvitrogen11995073
DMEM Mélange de nutriments F12  ;Invitrogen11320033
DPBS sans : Ca et MgPAN BiotechP04-36500
Sérum de bovie fœtalInvitrogen10270106
GAPDH (14C10) Anticorps mAb de lapinCST2118S
Réactif de dissociation cellulaire douceStem Cell Technologies7174
HyClone Acides aminés non essentiels (NEAA) 100XGE healthcareSH30238,01
L de glutamine, 100X  ;Invitrogen2924190090
L2HGDH Anticorps polyclonalProteintech15707-1-AP
L2HGDH shRNAMacrogenSeq : CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kitThermo FisherL3000001
mTesR1 milieu completStem Cell Technologies85850
Milieu neurobasal 1X CTSInvitrogenA1371201
Neuropan 2 Supplément 100xPAN BiotechP07-11050
Neuropan 27 Supplément 50xPAN BiotechP07-07200
Pénicilline streptomycine SOLInvitrogen15140122
pLKO.1 Vecteur TRCAddgene10878
pLL3.7 vecteur  ;Addgene11795
pMD2.GAddgene12259
Réactif d’infection à base de polybrèneSigmaTR1003- G
Polyéthylénimine, ramifiéSigma408727
psPAX2.0Addgene12260
PurmorphamineTocris4551/10
PuromycinInvitrogen
inhibiteur de ROCK Y-27632
dichlorhydrate  ;		Tocris1254
SB 431542Tocris1614/10
Trypsine .05 % EDTA  ;Invitrogen25300062
XAV 939Tocris3748/10
humain recombinant SolutionA1113802

Références

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