Visualiser les caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire dans le muscle gastrocnémien médian du rat

Résumé

Le protocole montre une méthode pour examiner la corrélation spatiale entre les terminaux pré-synaptiques, les récepteurs post-synaptiques et les cellules de Schwann péri-synaptiques dans le muscle gastrocnémien médian du rat en utilisant l’immunohistochimie fluorescente avec différents biomarqueurs, à savoir le neurofilament 200, le transporteur vésiculeux d’acétylcholine, l’alpha-bungarotoxine et S100.

Résumé

La jonction neuromusculaire (NMJ) est une structure complexe servant à la communication du signal du motoneurone au muscle squelettique et se compose de trois composants histologiques essentiels: les terminaux axonals moteurs pré-synaptiques, les récepteurs nicotiniques post-synaptiques de l’acétylcholine (AchR) et les cellules de Schwann péri-synaptiques (PSC). Afin de démontrer les caractéristiques morphologiques de la NMJ, le muscle gastrocnémien médian du rat a été sélectionné comme tissu cible et examiné en utilisant de multiples colorations fluorescentes avec divers types de biomarqueurs, y compris le neurofilament 200 (NF200) et le transporteur vésiculaire de l’acétylcholine (VAChT) pour les fibres nerveuses motrices et leurs terminaux pré-synaptiques, l’alpha-bungarotoxine (α-BTX) pour les AchR nicotiniques post-synaptiques, et S100 pour les PSC. Dans cette étude, la coloration a été effectuée en deux groupes: dans le premier groupe, les échantillons ont été colorés avec NF200, VAChT et α-BTX, et dans le deuxième groupe, les échantillons ont été colorés avec NF200, α-BTX et S100. Il a été démontré que les deux protocoles peuvent démontrer efficacement la structure détaillée du NMJ. À l’aide du microscope confocal, les caractéristiques morphologiques des terminaux pré-synaptiques, des récepteurs post-synaptiques et de la CSP ont été observées, et leurs images Z-stacks ont été reconstruites selon un modèle tridimensionnel pour analyser davantage la corrélation spatiale entre les différents marquages. Du point de vue de la méthodologie, ces protocoles fournissent une référence précieuse pour étudier les caractéristiques morphologiques de la NMJ dans des conditions physiologiques, ce qui peut également convenir pour évaluer l’altération pathologique de la NMJ, telle que les lésions nerveuses périphériques et la régénération.

Introduction

En tant que trois composants structurels essentiels de la jonction neuromusculaire (NMJ)^1,2,3,4, les aspects morphologiques des terminaisons axonales motrices pré-synaptiques, la membrane post-synaptique contenant des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AchR) et les cellules de Schwann péri-synaptiques (PSC) ont été largement étudiés. Des coupes minces et des échantillons entiers des muscles squelettiques ont été examinés avec différentes techniques histologiques, telles que la microscopie électronique ^5,....

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (approbation n ° 2021-04-15-1). Toutes les procédures ont été menées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Trois rats mâles adultes (Sprague-Dawley, poids 230 ± 15 g) ont été utilisés. Les rats ont été logés dans un cycle lumière/obscurité de 12 h avec une température et une humidité contrôlées et un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les instruments et le matériel pour cette étude sont présentés à

Résultats

Après plusieurs colorations fluorescentes, le marquage correspondant a été démontré de manière ordonnée sur les sections de 80 μm d’épaisseur du muscle gastrocnémien médian du rat avec des fibres nerveuses NF200 positives, des terminaux pré-synaptiques VAChT positifs, des AchR post-synaptiques α-BTX-positifs, des CSP S100 positifs, des fibres musculaires positives à la phalloïdine et des noyaux cellulaires marqués DAPI (Figure 3 et Figure 4).

Discussion

Nous avons décrit les détails techniques nécessaires pour effectuer avec succès une coloration multiple des tranches musculaires et l’utilisation de l’immunohistochimie fluorescente pour révéler les caractéristiques morphologiques de la NMJ sur les sections épaisses du muscle gastrocnémien médian du rat. En utilisant cette approche, les détails fins et la corrélation spatiale des PSC et des éléments pré- et post-synaptiques peuvent être analysés et appréciés sous microscopie confocale, puis reconstruits dans un modèle tr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4',6-diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole	ThermoFisher	D3571
Microscope confocal à balayage laser	Olympus	FV1200
Âne anti-poulet AF488	Jackson	149973 (703-545-155)
Âne anti-chèvre AF546	ThermoFisher	A11056
Âne anti-lapin AF488	ThermoFisher	A21206
Âne anti-lapin AF546	ThermoFisher	A10040
Section congelée Medium	ThermoFisher	Neg-50	Incolore
Microscope verre de couverture	Citotest	10212450C
Microtome	Yamato	REM-710
Neurofilament 200	Sigma-Aldrich	N4142	Lapin
Neurofilament 200	Abcam	ab4680	Poulet
Sérum d’âne normal	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
Saline normale	Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd	H37022750	250 ml
Paraformaldéhyde	Macklin	P804536	500g
Phalloïdine AF350	ThermoFisher	A22281
Pompe péristaltique de précision	Plus longue	BT100-2J
S100-&beta ;	Abcam	ab52642	Rabbit
Phosphate de sodium dodécahydrate basique	Macklin	S818118	500g
Phosphate de sodium monobasique dihydraté	Macklin	S817463	500g
Saccharose	Macklin	S818046	500g
Superfrost plus lames de microscope	ThermoFisher	4951PLUS-001E
Triton X-100	Solarbio Sciences de la vie	9002-93-1	100 ml
Transporteur vésiculaire d’acétylcholine	Milipore	ANB100	Chèvre
&alpha ;-bungarotoxine AF647 conjuguée	ThermoFisher	B35450