Nous présentons un protocole pour la culture ex vivo de tissu myocardique ventriculaire humain. Il permet une analyse détaillée de la force de contraction et de la cinétique, ainsi que l’application de la pré- et post-charge pour imiter de plus près l’environnement physiologique in vivo .
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Article de méthode
Préparation de tissu myocardique humain pour la culture à long terme
Dans cet article
Résumé
Résumé
La culture de cardiomyocytes a connu un grand nombre de développements, allant de la culture de cellules bidimensionnelles (2D) aux organoïdes dérivés de l’iPSC. En 2019, une façon ex vivo de cultiver des tranches de myocarde obtenues à partir d’échantillons de cœur humain a été démontrée, tout en approchant in vivo de l’état de contraction myocardique. Ces échantillons proviennent principalement de transplantations cardiaques ou de placements de dispositifs d’assistance ventriculaire gauche. À l’aide d’un vibratome et d’un système de culture spécialement développé, des tranches de 300 μm d’épaisseur sont placées entre un fil fixe et un fil à ressort, permettant une culture stable et reproductible pendant plusieurs semaines. Pendant la culture, les tranches sont continuellement stimulées selon des paramètres individuels. Les contractions peuvent être affichées et enregistrées en temps réel, et les agents pharmacologiques peuvent être facilement appliqués. Des protocoles de stimulation définis par l’utilisateur peuvent être programmés et exécutés pour évaluer les paramètres de contraction vitaux tels que la potentialisation post-pause, le seuil de stimulation, la relation force-fréquence et la période réfractaire. De plus, le système permet un réglage variable de la précharge et de la post-charge pour une culture plus physiologique.
Ici, nous présentons un guide étape par étape sur la façon de générer une culture réussie à long terme de tranches myocardiques ventriculaires gauches humaines, en utilisant une solution de culture biomimétique commerciale.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, la culture in vitro de cellules myocardiques a fait de grands progrès, allant des techniques 2D et tridimensionnelles (3D) à l’utilisation d’organoïdes et de cellules souches pluripotentes induites différenciées en myocytes cardiaques 1,2,3. Les cultures cellulaires ex vivo et primaires se sont révélées d’une grande valeur, en particulier pour les études génétiques et le développement de médicaments 4,5,6. L’utilisation de tissus hu....
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Protocole
La collecte de tissus pour les expériences décrites ici a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de Munich et de l’Université de la Ruhr à Bochum. Les études ont été menées conformément aux directives de la Déclaration d’Helsinki. Les patients ont donné leur consentement éclairé écrit avant le prélèvement de tissus.
1. Acquisition tissulaire
- Obtenir des tissus humains de patients subissant une transplantation cardiaque ou une chirurgie cardiaque.
- Avant de vous procurer le tissu, préparer 2 L de solution cardioplégique (ci-après appelée tampon tranchant (tableau 1
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Résultats
La contraction des tranches myocardiques a été affichée sur l’écran de l’ordinateur après insertion de la chambre de culture dans son connecteur correspondant (Figure 3). La contraction des tranches myocardiques humaines a commencé immédiatement après la stimulation. Les tranches sont hypercontractées pendant 5-10 min. Cela était visible comme une augmentation des forces diastoliques, causée par une contracture tonique de fractions tissulaires endommagées. Ce processus a été rétabli à des de.......
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Discussion
Dans le passé, la recherche cardiovasculaire a fait de grands progrès dans la culture des cardiomyocytes. Cependant, la culture 3D de cardiomyocytes à géométrie intacte n’est pas encore bien établie. Comparé aux protocoles précédents appliqués pour la culture ex vivo de tissu myocardique, le protocole que nous avons décrit ici ressemble plus étroitement à l’environnement in vivo du tissu. De plus, l’application de la pré- et post-charge permet un environnement plus biomimétique. Nous sommes en mesure d’.......
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Déclarations de divulgation
JH, PS, DM et KL n’ont rien à divulguer. AD et TS sont actionnaires d’InVitroSys GmbH, qui fournit le système de culture Myodish.
Remerciements
La recherche a été financée par les subventions DZHK 81Z0600207 (JH, PS et DM) et 81X2600253 (AD et TS).
Les auteurs tiennent à remercier Claudia Fahney, Mei-Ping Wu et Matthias Semisch pour leur soutien dans la préparation des installations, ainsi que pour le maintien régulier de la culture tissulaire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chemicals | |||
| Agarose Point de fusion bas | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100 % | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Moyen 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifédipine | Sigma | N7634-1G | |
| Pénicilline / streptomycine x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| &beta ;-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Équipement de laboratoire | |||
| Flow | Cabinet Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix pompe à eau et refroidissement + BBraun Thermomix BM | BBraun | Combinaison interne de solution de refroidissement et de chauffage. | |
| Incubateur | Liant | CB240 | |
| Système de culture MyoDish | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Système de culture Myodish |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Bain d’eau 37 degrés | Haake | SWB25 | |
| Bain d’eau 80 degrés | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Matériaux | |||
| Bécher en plastique à usage unique de 100 ml | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Unité de filtration, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Aiguilles 0,9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Triangles en plastique Razor | |||
| Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Rasoir Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel jetable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Seringue 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Plat de culture tissulaire 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Plat de culture tissulaire 3,5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | Référence 352070 |
Références
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781(2020).
- Lu, K., et al.
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Réimpressions et autorisations
