Dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez Schizosaccharomyces pombe

Résumé

Ce travail décrit un protocole pour un dépistage génétique suppresseur multicopie chez Schizosaccharomyces pombe. Ce criblage utilise une bibliothèque plasmidique pangénomique pour identifier le(s) clone(s) suppresseur(s) d’un phénotype de perte de fonction associé à une souche mutante de requête. De nouveaux suppresseurs génétiques du mutant nul ell1 ont été identifiés à l’aide de ce criblage.

Résumé

L’identification des interactions génétiques est un outil puissant pour déchiffrer les fonctions des gènes en fournissant des informations sur leurs relations fonctionnelles avec d’autres gènes et leur organisation en voies et processus biologiques. Bien que la majorité des criblages génétiques aient été initialement développés chez Saccharomyces cerevisiae, une plateforme complémentaire pour la réalisation de ces criblages génétiques a été fournie par Schizosaccharomyces pombe. L’une des approches couramment utilisées pour identifier les interactions génétiques consiste à surexprimer des clones d’une bibliothèque plasmidique à haut nombre de copies à l’échelle du génome dans un mutant de perte de fonction, suivie de la sélection de clones qui suppriment le phénotype mutant.

Cet article décrit un protocole pour effectuer ce dépistage génétique basé sur la « suppression multicopie » chez S. pombe. Ce criblage a permis d’identifier le(s) suppresseur(s) multicopie du phénotype génotoxique sensible au stress associé à l’absence du facteur d’élongation de la transcription Ell1 chez S. pombe. Le criblage a été initié par la transformation de la souche mutante nulle ell1 de requête avec une bibliothèque de plasmides d’ADNc S. pombe à nombre élevé de copies et en sélectionnant les suppresseurs sur des plaques EMM2 contenant du 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4-NQO), un composé génotoxique induisant le stress. Par la suite, le plasmide a été isolé à partir de deux colonies suppressives présélectionnées et digéré par des enzymes de restriction pour libérer l’ADN de l’insert. Les plasmides libérant un fragment d’ADN inséré ont été retransformés en souche de délétion ell1 pour confirmer la capacité de ces clones plasmidiques suppresseurs à restaurer la croissance du mutant de délétion ell1 en présence de 4-NQO et d’autres composés génotoxiques. Les plasmides montrant un sauvetage du phénotype de délétion ont été séquencés pour identifier le(s) gène(s) responsable(s) de la suppression du phénotype génotoxique sensible au stress associé à la délétion ell1.

Introduction

Les réseaux d’interactions génétiques fournissent des informations fonctionnelles sur les gènes et délimitent les voies et les processus biologiques dans lesquels ces gènes peuvent être impliqués in vivo. En outre, ils peuvent également fournir des informations sur la façon dont différents gènes interagissent les uns avec les autres, ce qui donne un phénotype spécifique ^1,2,3. Au fil des ans, divers criblages génétiques ont été conçus par les chercheurs pour répondre à des questions biologiques fondamentales et étudier les maladies humaines. Les cribles pour l’identification des interactions génétiques peuvent être effectués de plusieurs façons. Les interactions génétiques identifiées dans différents criblages génétiques peuvent représenter des relations mécanistes distinctes entre les gènes. De plus, des études ont révélé qu’un ensemble commun d’interactions génétiques est partagé par des gènes qui codent pour des protéines appartenant à la même voie ou complexe ^4,5. Ainsi, les réseaux d’interaction génétique peuvent être utilisés pour établir l’organisation fonctionnelle dans une cellule, dans laquelle les gènes partageant les profils les plus similaires appartiennent au même complexe ou voie, les gènes partageant des profils un peu moins similaires appartiennent au même processus biologique, et les gènes présentant des profils qui se chevauchent mais plus divers reflètent des membres appartenant au même compartiment cellulaire⁶.

Les tests d’interaction génétique basés sur la suppression de la dose (« suppression à haute copie ou à plusieurs copies ») sont l’une des approches couramment utilisées. Ces criblages peuvent être effectués en transformant une souche mutante de requête avec une bibliothèque génomique ou d’ADNc à nombre élevé de copies, suivie de tests / techniques de sélection appropriés pour identifier la suppression ou l’amélioration des interactions génétiques ^7,8,9. Pour assurer une couverture complète à l’échelle du génome, ces criblages ont également été effectués en surexprimant un gène spécifique d’intérêt dans une collection de mutants de perte de fonction à l’échelle du génome ou en surexprimant une bibliothèque génomique ou d’ADNc codée par un plasmide à nombre élevé dans une requête mutante de perte de fonction 9,10,11,12,13,14,15 . La stratégie multicopie pourrait également fonctionner en utilisant une approche dominante/surexpression utilisant un promoteur régulatable.

Les principaux avantages de l’utilisation de criblages à base de suppresseurs sont que la suppression d’un phénotype préexistant dans une souche mutante par un autre gène établit une relation génétique entre ces deux produits géniques qui n’a peut-être pas été démontrée par d’autres approches. Deuxièmement, il a été observé que la présence d’une mutation préexistante sensibilise une voie particulière, ce qui permet d’identifier des composants supplémentaires de cette voie par l’isolement de suppresseurs, qui n’ont peut-être pas été identifiés par des sélections génétiques plus directes. De plus, cet écran peut être utilisé pour identifier les suppresseurs qui ont différents mécanismes de suppression¹⁶. Les interactions suppressives se produisent généralement entre des gènes qui sont fonctionnellement liés et peuvent être utilisées pour élucider les hiérarchies dans les voies. Le mécanisme sous-jacent exact de suppression peut différer en fonction de plusieurs facteurs, notamment le type de mutant de requête utilisé dans le criblage, les conditions expérimentales et le niveau d’expression des gènes. L’un des mécanismes courants de suppression du dosage implique des gènes codant pour des produits qui fonctionnent ensemble dans le même complexe ou en parallèle dans le même processus cellulaire / biologique. Les résultats de tels criblages dans des organismes modèles plus simples tels que la levure peuvent être étendus à des organismes eucaryotes supérieurs puisque la plupart des voies et processus biologiques fondamentaux sont conservés tout au long de l’évolution.

Ces criblages génétiques peuvent également être modifiés de plusieurs façons pour répondre à différentes questions biologiques. Par exemple, des gènes orthologues de différents organismes qui peuvent supprimer le phénotype de la souche mutante de requête peuvent être identifiés. Il a également été utilisé pour délimiter les mécanismes de résistance potentiels et déterminer les cibles protéiques de nouveaux composés antibactériens^17,18, antifongiques^19,20, antiparasitaires 21 et anticancéreux ²². Ce criblage a également été exploité pour identifier les suppresseurs de l’activité des médicaments pharmaceutiques dont le mécanisme d’action n’est pas connu. Ainsi, en principe, ces écrans suppresseurs multicopies peuvent être optimisés et utilisés dans une variété d’applications dans différents organismes. Bien que la plupart des dépistages génétiques utilisés par les chercheurs sur les levures aient été initialement développés chez S. cerevisiae, S. pombe est apparu comme un système modèle complémentaire pour la réalisation de divers criblages et dosages génétiques²³. De plus, l’organisation génomique et les processus biologiques chez S. pombe, tels que l’apparition d’introns dans un plus grand nombre de gènes, la complexité des origines de la réplication de l’ADN, la structure du centromère, l’organisation du cycle cellulaire et la présence de la machinerie ARNi, montrent une plus grande ressemblance entre S. pombe et les eucaryotes supérieurs^23,24, soulignant l’importance de la conception et de l’utilisation d’outils génétiques chez S. pombe.

Cet article décrit un protocole d’identification des interacteurs génétiques basé sur la « suppression de dosage » d’un phénotype mutant de perte de fonction chez S. pombe. La base de ce protocole est qu’il s’agit d’une méthode rapide et efficace pour cribler une banque d’ADNc surexprimant des gènes de type sauvage soit sur un plasmide multicopie et / ou à partir d’un promoteur fort. Ce protocole comporte quatre étapes principales : transformation de la bibliothèque en une souche mutante de requête, sélection de clones plasmidiques qui suppriment le phénotype souhaité de la souche mutante requête, récupération du ou des plasmides de ces clones suppresseurs et identification du gène responsable de la suppression du phénotype. Comme c’est le cas pour toute méthode basée sur la sélection et l’identification d’ADNc à partir d’une bibliothèque, le succès de l’écran dépend de l’utilisation d’une bibliothèque de haute qualité et de haute complexité car l’écran ne peut récupérer que les clones d’ADNc présents dans la bibliothèque.

En utilisant ce protocole, nous avons identifié avec succès deux nouveaux suppresseurs du phénotype génotoxique sensible au stress de la requête S. pombe ell1 null mutant. La famille ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) de facteurs d’élongation de la transcription supprime la pause transitoire de l’ARN polymérase II sur les modèles d’ADN dans les essais biochimiques in vitro et est conservée dans divers organismes, de la levure de fission à l’homme²⁵. Des travaux antérieurs ont fourni des preuves qu’un mutant nul de S. pombe ell1 présente une sensibilité au stress génotoxique en présence de 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4-NQO) et de méthanesulfonate de méthyle (MMS)²⁶. Par conséquent, nous avons transformé une bibliothèque d’ADNc multicopie codée par le plasmide de S. pombe en la requête S. pombe ell1 null mutant et identifié deux clones putatifs qui présentaient la capacité de supprimer la sensibilité au stress génotoxique du mutant nul S. pombe ell1 en présence de 4-NQO, un composé qui induit des lésions de l’ADN. Le séquençage ultérieur de l’insert présent dans les clones plasmidiques a permis d’identifier que les gènes codant pour rax2+ et osh6⁺ étaient responsables de la suppression de la sensibilité au stress génotoxique du mutant nul ell1 lorsqu’il était surexprimé dans le mutant nul ell1.

Protocole

1. Transformation de la bibliothèque d’ADNc en la souche mutante de S. pombe pour dépister les suppresseurs multicopies

NOTE: La méthode standard de l’acétate^{de lithium 27} a été suivie pour transformer la bibliothèque d’ADNc de S. pombe en la souche S. pombe ell1Δ avec quelques modifications:

1. Cultiver la souche S. pombe ell1 Δà 32 °C sur une plaque de milieu YE (tableau 1) additionnée de 225 μg/mL d’adénine, de leucine et d’uracile. Inoculer une boucle pleine d’inoculum de la souche ell1Δ de la plaque ci-dessus dans 15-20 mL de milieu YE complété par 225 μg/mL d’adénine, de leucine et d’uracile. Incuber pendant une nuit à 32 °C en secouant (200-250 tr/min).
2. Le lendemain, diluer la culture de nuit dans 100 mL de milieu YE frais avec les suppléments désirés à une DO 600 nm (densité optique à 600 nm) de 0,3 et l’incuber à 32 °C en agitant à 200-250 tr/min jusqu’à ce que la DO_{600 nm} atteigne la phase logarithmique moyenne.
3. Répartir la culture de 100 mL en deux tubes à centrifuger de 50 mL, puis la centrifuger à température ambiante pendant 10 min à 4 000 × g.
4. Jeter le surnageant et laver la pastille cellulaire avec 1 mL d’eau stérile, c’est-à-dire remettre les cellules en suspension dans 1 mL d’eau stérile et centrifuger à 4 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
5. Jeter le surnageant et laver chaque pastille de cellule avec 1 mL de 1x solution de LiAc-TE (100 mM d’acétate de lithium, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA, pH 7,5) comme décrit à l’étape 1.4.
6. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 250 μL de 1x LiAc-TE. Utilisez ces cellules compétentes de S. pombe (500 μL) pour la transformation avec l’ADN d’intérêt. Transférer 125 μL des cellules compétentes dans quatre tubes de microcentrifugation stériles différents pour les étapes de transformation ultérieures.
7. Faire bouillir l’ADN porteur des testicules de saumon ou du sperme de hareng pendant 1 min et le placer immédiatement sur la glace. Pour chaque transformation, ajouter 10 μL d’ADN porteur simple brin dénaturé à 10 mg/mL dans le tube de microcentrifugation contenant 125 μL des cellules compétentes, puis mélanger doucement à l’aide d’une pointe de micropipette. Par la suite, ajouter 50 μg de la banque d’ADNc de S. pombe au tube de microcentrifugation contenant un mélange d’ADN porteur de cellules compétent.
8. Incuber les tubes microcentrifugés à température ambiante pendant 10 min, puis ajouter 260 μL de solution de polyéthylèneglycol-acétate de lithium (40 % [p/v] PEG 4 000, acétate de lithium 100 mM, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) dans les tubes et mélanger doucement à l’aide d’un embout de micropipette.
9. Incuber les tubes de microcentrifugation contenant le mélange de transformation à 32 °C pendant 2 h sans agiter. Ajouter 43 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) préchauffé dans le tube de microcentrifugation et mélanger délicatement. Par la suite, exposer les tubes à un choc thermique à 42 °C pendant 5 min.
10. Enduire les cellules à 4 000 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant et retirez la solution résiduelle de PEG-LiAc-TE à l’aide d’un embout de micropipette.
11. Remettez les cellules en suspension dans 100 μL d’eau stérile et sur une plaque EMM2 (tableau 1) (150 mm) avec les suppléments requis et 0,2 μg/mL de 4-NQO.
12. Incuber les plaques à 32 °C pendant 5-6 jours pour permettre aux colonies d’apparaître sur les plaques. Strender les colonies obtenues sur la même plaque moyenne en présence de 0,2 μg/mL de 4-NQO et utiliser pour un criblage plus poussé.
13. Pour une expérience de transformation de bibliothèque, utiliser 500 μL de cellules compétentes (125 μL de cellules compétentes x 4 tubes de microcentrifugeuse) pour la transformation décrite aux étapes 1.8 à 1.14 ci-dessus.
14. Comme témoin, plaquer 1/10e^{du mélange} de transformation sur une plaque EMM2 (150 mm) avec les suppléments requis, mais sans 4-NQO, pour calculer le nombre total de clones de bibliothèque obtenus après transformation de la bibliothèque et filtrer l’isolement des clones suppresseurs.

2. Tester et valider le sauvetage/suppression du phénotype associé à la souche mutante de requête par le suppresseur putatif

NOTE: Des tests ponctuels de stress ont été effectués comme décrit ci-dessous pour tester et valider le sauvetage/suppression de la sensibilité au stress 4-NQO associée à la délétion ell1 par le(s) suppresseur(s) putatif(s).

1. Ajouter 100-200 μL d’eau stérile dans chacun des différents puits d’une plaque de microtitrage stérile de 96 puits.
2. Prélever une petite quantité d’inoculum dans chacune des différentes colonies obtenues après transformation de la bibliothèque d’ADNc sur la plaque contenant du 4-NQO à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’un embout de micropipette de 20 à 200 μL. Ajouter l’inoculum de chacune des différentes colonies dans des puits indépendants séparés de la plaque de microtitrage contenant 100-200 μL d’eau stérile. Mélanger.
3. Repérez 3 μL de la suspension cellulaire de chaque puits sur des plaques de gélose EMM2 contenant de l’adénine (225 μg/mL) et de l’uracile (225 μg/mL) mais dépourvues de leucine (le marqueur auxotrophe sélectionnable présent sur le vecteur plasmidique utilisé pour la construction de la bibliothèque utilisée dans ce travail). Ajouter les concentrations appropriées de 4-NQO aux plaques, au besoin.
4. Incuber les plaques à 32 °C pendant 3-4 jours pour permettre aux cellules de se développer. Identifier les colonies qui montrent une croissance en présence de différentes concentrations de 4-NQO comme suppresseurs putatifs.
5. Pour valider davantage les suppresseurs, cultiver les suppresseurs sélectionnés avec les souches témoins appropriées pendant une nuit à 32 °C avec agitation (200-250 tr/min) dans un milieu EMM2 contenant 225 μg/mL chacun d’adénine et d’uracile mais dépourvus de leucine.
6. Le lendemain, diluer les cellules à une DO 600 nm de 0,3 dans un milieu EMM2 frais et les faire croître à 32 °C en agitant jusqu’à la phase logarithmique (environ_{600 nm} OD de 0,6-0,8).
7. Repérer les dilutions en série appropriées (1:10 ou 1:5) des cultures sur des plaques EMM2 avec les suppléments requis contenant 0,4 μM de 4-NQO ou 0,01 % de MMS. Pour le contrôle, repérez les souches sur une plaque EMM2 avec les suppléments nécessaires, mais dépourvue de tout agent endommageant l’ADN.
8. Incuber les plaques à 32 °C pendant 3 à 5 jours pour surveiller la croissance.
   NOTE: Des tests appropriés basés sur le phénotype associé à la souche mutante de requête doivent être utilisés pour tester le sauvetage ou la suppression du phénotype. Par exemple, si les suppresseurs d’un phénotype sensible au froid d’une souche mutante de requête doivent être identifiés, le test pour tester et valider les clones suppresseurs impliquerait la croissance de transformants à basse température.
9. Repérez les souches mutantes transformées avec un gène d’intérêt complet (Spell1 dans ce cas) ou un vecteur vide en tant que témoins positifs et négatifs, respectivement, avec les transformants de la bibliothèque.

3. Isolement du plasmide à partir des clones suppresseurs de S. pombe

NOTE: L’isolement plasmidique de S. pombe a été effectué en suivant le protocole décrit dans Fission yeast: a laboratory manual²⁸ avec quelques modifications.

1. Inoculer une seule colonie de levure dans un milieu EMM2 contenant 225 μg/mL d’adénine et d’uracile et faire croître les cellules pendant une nuit à 32 °C avec agitation à 200-250 rpm. Le lendemain, prélever 5 cellules O.D. (c.-à-d. 10 mL de culture O.D. 0,5) par centrifugation pendant 2 min à 4 000 × g à température ambiante.
2. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 0,2 mL de tampon de lyse (2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) et 1 mM Na₂EDTA).
3. Ajouter 0,2 mL de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) et 0,3 g de billes de verre lavées à l’acide dans le tube de microcentrifugeuse. Faire tourbillonner le tube de la microcentrifugeuse pendant 2 min à 4 °C et incuber sur la glace pendant 1 min. Répétez cette étape 6x.
4. Centrifuger le tube à 10 000 × g pendant 15 min à température ambiante. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube microcentrifuge frais et ajouter 200 μL d’alcool phénol:chloroforme:isoamylique (25:24:1).
5. Centrifuger le tube à 10 000 × g pendant 10 min. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube frais et ajouter deux volumes d’éthanol à 100 % (~400 μL) et 1/10 de volume d’acétate de sodium (3 M, pH 5,8) (~20 μL) dans le tube. Incuber le tube de microcentrifugation à -70 °C pendant 1 h.
6. Précipiter l’ADN par centrifugation à 10 000 × g pendant 15 min à 4 °C et éliminer le surnageant. Lavez la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70 % (~500 μL) et maintenez-la à température ambiante pour la sécher à l’air.
7. Remettez l’ADN en suspension dans 20 μL d’eau stérile. Utilisez 2-5 μL d’ADN plasmidique pour la transformation des cellules E. coli compétentes.
   REMARQUE: Le plasmide peut également être isolé à partir de cellules de levure à l’aide de l’un des kits d’isolation plasmidique de levure disponibles dans le commerce.

4. Identification du gène codé par le clone suppresseur

1. Transformer les plasmides de levure isolés en souche E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] en utilisant le protocole standard²⁹ et étaler les cellules sur des plaques LB (Luria Broth) avec les antibiotiques nécessaires.
2. Isoler le(s) plasmide(s) des transformateurs E. coli en utilisant le protocole de lyse alcaline^{standard 29} et suivre les combinaisons appropriées d’enzymes de restriction pour vérifier la libération du fragment d’ADN inséré par digestion de restriction.
   REMARQUE: Le plasmide suppresseur 84 a été digéré avec l’enzyme de restriction Bam HI, et le plasmide suppresseur 104 a été digéré avec les enzymes de restriction PstI / BamHI.
3. Retransformer les plasmides présentant une libération d’insert après digestion de restriction dans la souche ell1 Δ pour vérifier leur capacité à sauver le phénotype génotoxique sensible au stress de la souche ell1Δ.
4. Sélectionner les clones plasmidiques montrant la suppression de la sensibilité au stress génotoxique et séquencer le fragment d’ADN inséré présent dans ces clones plasmidiques à l’aide d’amorces directes et inverses spécifiques au vecteur.
   NOTE: Dans cette étude, l’amorce avant universelle spécifique au promoteur adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') a été utilisée³⁰.
5. Pour identifier le gène responsable de la suppression, aligner la séquence obtenue à l’aide de l’explosion nucléotidique NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) ou de l’outil d’alignement de séquence Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Sélectionnez la séquence montrant l’alignement maximal et identifiez-la comme le gène du plasmide suppresseur de multicopie.

Résultats

Criblage de suppresseurs multicopies de sensibilité au stress génotoxique associé à la délétion ell1 chez S. pombe
Nous avons effectué le dépistage génétique en utilisant le protocole décrit ci-dessus pour identifier les suppresseurs multicopies du phénotype de perte de fonction de la souche mutante de délétion ell1. La sensibilité liée à la croissance de la souche de délétion ell1 observée en présence de l’agent g...

Discussion

Les levures ont été largement utilisées pour étudier les processus biologiques de base et les voies qui sont conservées au cours de l’évolution dans les organismes eucaryotes. La disponibilité d’outils génétiques et génomiques ainsi que leur aptitude à diverses procédures biochimiques, génétiques et moléculaires font des levures un excellent organisme modèle pour la recherche génétique^34,35,36. Au fil des ans, divers criblages g...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4-NQO	Sigma	N8141
Acide acétique, glacial	Sigma	1371301000
Sulfate d’adénine	Himedia	GRM033
Agar	Himedia	GRM026
Agarose	Lonza	50004L
Chlorure d’ammonium	Himedia	MB054
BamHI	Fermentas	ER0051
Biotine	Himedia	RM095
Acide borique	Himedia	MB007
Chlorure de calcium  ;	Sigma	C4901
Chloroforme :Alcool isoamylique 24:1	Sigma	C0549
Acide citrique	Himedia	RM1023
Hydrogène phospahte disodique anhydre	Himedia	GRM3960
ADN simple brin de testicules de saumon	Sigma	D7656
EDTA disodique	Sigma	324503
Chlorure ferrique hexahydraté	Himedia	RM6353
Glucose	Amresco	188
Ionositol	Himedia	GRM102
Isopropanol	Qualigen	Q26897
Leucine	Himedia	GRM054
Lithium Acetatae	Sigma	517992
Chlorure de magnésium hexahydraté	Himedia	MB040
Acide molybdique	Himedia	RM690
Acide nicotinique	Himedia	CMS177
PEG, MW 4000	Sigma	81240
Acide pentothinique	Himedia	TC159
Phénol	Himedia	MB082
Kit d’extraction de plasmide	Qiagen	27104
Chlorure	de potassium Sigma	P9541
Hydrogène de potassium Pthallate	Merc	DDD7D670815
Iodure de potassium	Himedia	RM1086
RNAse	Fermentas	EN0531
SDS	Himedia	GRM205
Hydroxyde de sodium	Himedia	GRM1183
Sulfate de sodium	Himedia	RM1037
Base sans tris	Himedia	MB209
Uracil	Himedia	GRM264
Poudre d’extrait de levure	Himedia	RM668
Sulfate de zinc Heptahydrate	Merc	DJ9D692580