Imagerie simultanée et détection par cytométrie en flux de plusieurs marqueurs de sénescence fluorescents dans les cellules cancéreuses sénescentes induites par le traitement

Summary

Nous présentons ici une méthode basée sur la cytométrie en flux pour la visualisation et la quantification de plusieurs marqueurs associés à la sénescence dans des cellules individuelles.

Abstract

Les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire des dommages irréparables à l’ADN dans les cellules cancéreuses, conduisant à l’apoptose ou à la sénescence prématurée. Contrairement à la mort cellulaire apoptotique, la sénescence est une machinerie fondamentalement différente qui restreint la propagation des cellules cancéreuses. Des décennies d’études scientifiques ont révélé les effets pathologiques complexes des cellules cancéreuses sénescentes dans les tumeurs et les microenvironnements qui modulent les cellules cancéreuses et les cellules stromales. De nouvelles preuves suggèrent que la sénescence est un facteur pronostique puissant pendant le traitement du cancer, et donc une détection rapide et précise des cellules sénescentes dans les échantillons de cancer est essentielle. Cet article présente une méthode pour visualiser et détecter la sénescence induite par le traitement (TIS) dans les cellules cancéreuses. Les lignées cellulaires diffuses de lymphome à grandes cellules B (LDGCB) ont été traitées avec du mafosfamide (MAF) ou de la daunorubicine (DN) et examinées pour le marqueur de sénescence, la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal), le marqueur de synthèse de l’ADN 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et le marqueur de dommages à l’ADN gamma-H2AX (γH2AX). L’imagerie par cytomètre en flux peut aider à générer des images unicellulaires à haute résolution en peu de temps pour visualiser et quantifier simultanément les trois marqueurs dans les cellules cancéreuses.

Introduction

Une variété de stimuli peut déclencher la sénescence cellulaire, amenant les cellules à entrer dans un état d’arrêt stable du cycle cellulaire. Ces stimuli comprennent des changements de signalisation intrinsèques ou des stress extrinsèques. Les signaux intrinsèques comprennent le raccourcissement progressif des télomères, les changements dans la structure des télomères, la modification épigénétique, les troubles de la protéostase, le dysfonctionnement mitochondrial et l’activation des oncogènes. Les stress extrinsèques comprennent les signaux de dommages inflammatoires et/ ou tissulaires, les traitements radiologiques ou chimiques et la privation nutritionnelle

Protocol

1. Lignées cellulaires du LDGCB avec traitement au mafosfamide ou à la daunorubicine pour induire la sénescence cellulaire

REMARQUE: Le protocole fonctionne également pour les cellules cancéreuses adhérentes. Selon la taille de la cellule, ensemencez 1 à 2 × 10⁵ cellules dans un puits d’une plaque de 6 puits et incubez la plaque dans un incubateur à 5% de CO₂, 37 ° C pendant la nuit avant le traitement. Les étapes du protocole sont les mêmes que pour les cellules de suspension, mais à deux exceptions près. Tout d’abord, les cellules doivent être trypsinisées sur la plaque après l’étape 3.4. Deuxièmement,....

Results

Une matrice de compensation a été générée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images en chargeant les données enregistrées d’échantillons de contrôle unicolores. Comme le montre la figure supplémentaire S1, un débordement de lumière non négligeable (valeur du coefficient ≥ 0,1) de l’EdU au_C12FDG a été détecté avec une valeur de coefficient de diaphonie de 0,248, tandis que la diaphonie entre les autres canaux n’était pas significative. Quatre lignées cellulaires différentes de LDGCB ont été tra.......

Discussion

Cette méthode a examiné la capacité d’entrée de sénescence de quatre lignées cellulaires différentes de LDGCB lors d’un traitement de chimiothérapie, avec une imagerie en champ lumineux et une quantification basée sur la cytométrie en flux. Au niveau unicellulaire, nous avons détecté avec succès d’importantes populations sénescentes C₁₂FDG^+EdU-Ki67+ dans les cellules KARPAS422 et WSU-DLCL2 traitées, et dans une moindre mesure dans les cellules OCI-LY1, tandis que la lignée cell.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorps Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139)	Biolegend	613407
Anticorps monoclonal anti-Ki-67 de souris (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescéin Di-&beta ;-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Nettoyant (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70 % Isopropanol)	Millipore	1.3704
Logiciel d’analyse d’images (Amnis  ; IDÉES  ; 6.3)	Instrument	Luminex CN-SW69-12
et logiciel d’imagerie (Amnis  ; ImageStreamX  ; Système de cytométrie en flux d’imagerie Mk II et logiciel INSPIRE)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldéhyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phényléthyl-&bêta ;-D-thiogalactosid)  ;	Sigma aldrich	P4902
saponine	Sigma aldrich	47036
Gaine	Millipore	BSS-1006-B
Kit SpeedBead pour stérilisateur ImageStream	Luminex	400041
(0,4-0,7 % d’hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575