Mesure de la rigidité hépatique par microscopie à force atomique couplée à la microscopie à polarisation

Résumé

Nous présentons un protocole pour mesurer les modules élastiques des zones riches en collagène dans le foie normal et malade en utilisant la microscopie à force atomique. L’utilisation simultanée de la microscopie à polarisation fournit une grande précision spatiale pour localiser les zones riches en collagène dans les sections du foie.

Résumé

Le raidissement de la matrice a été reconnu comme l’un des principaux moteurs de la progression de la fibrose hépatique. Il a des effets profonds sur divers aspects du comportement cellulaire tels que la fonction, la différenciation et la motilité cellulaires. Cependant, comme ces processus ne sont pas homogènes dans l’ensemble de l’organe, il est devenu de plus en plus important de comprendre les changements dans les propriétés mécaniques des tissus au niveau cellulaire.

Pour pouvoir surveiller le raidissement des zones riches en collagène dans les lobes du foie, cet article présente un protocole de mesure des modules élastiques des tissus hépatiques avec une grande précision spatiale par microscopie à force atomique (AFM). L’AFM est une méthode sensible ayant le potentiel de caractériser les propriétés mécaniques locales, calculées comme le module de Young (également appelé module élastique). L’AFM couplée à la microscopie à polarisation peut être utilisée pour localiser spécifiquement les zones de développement de la fibrose en fonction de la biréfringence des fibres de collagène dans les tissus. En utilisant le protocole présenté, nous avons caractérisé la rigidité des zones riches en collagène des foies de souris fibrotiques et des zones correspondantes dans les foies des souris témoins.

Une augmentation importante de la rigidité des zones positives au collagène a été observée avec le développement de la fibrose. Le protocole présenté permet une méthode hautement reproductible de mesure de l’AFM, en raison de l’utilisation de tissu hépatique légèrement fixé, qui peut être utilisée pour approfondir la compréhension des changements initiés par la maladie dans les propriétés mécaniques des tissus locaux et de leur effet sur le devenir des cellules voisines.

Introduction

Le foie est un organe vital pour le maintien de l’homéostasie dans les organismes ^1,2. Les maladies chroniques du foie représentent ~2 millions de décès dans le monde chaque année³. Ils proviennent le plus souvent d’infections virales, de troubles auto-immuns, de syndromes métaboliques ou de maladies liées à l’abus d’alcool et s’accompagnent d’une fibrose hépatique progressive. Les lésions hépatiques provoquent une réponse inflammatoire, ce qui conduit à l’activation des cellules déposant la matrice extracellulaire (ECM) dans une réponse de cicatrisation. Cependant, en présence d’une insulte chronique, l’excès d’ECM forme du tissu cicatriciel non résolu dans le foie, entraînant le développement d’une fibrose hépatique, d’une cirrhose, d’un carcinome hépatique et, finalement, d’une insuffisance hépatique⁴.

La lésion des hépatocytes entraîne immédiatement une augmentation de la rigidité hépatique ^5,6. Cela affecte directement la fonction des hépatocytes, active les cellules stellaires hépatiques (CSH) et les fibroblastes portiques, et entraîne leur transdifférenciation en myofibroblastes déposant du collagène ^7,8. Le dépôt d’ECM fibreux augmente encore la rigidité hépatique, créant une boucle de rétroaction auto-amplifiante de raidissement du foie et d’activation cellulaire productrice de matrice.

La rigidité hépatique est donc devenue un paramètre important dans le pronostic de la maladie du foie. Le changement dans les propriétés biomécaniques des tissus peut être détecté plus tôt que la fibrose peut être diagnostiquée par analyse histologique. Par conséquent, diverses techniques de mesure de la rigidité hépatique ont été développées à la fois dans la recherche et les applications cliniques. En milieu clinique, l’élastographie impulsionnelle (TE)9,10,11,12,13 et l’élastographie par résonance magnétique (EMR)^{14,15,16,17,18} ont été utilisées pour diagnostiquer de manière non invasive les premiers stades des lésions hépatiques en examinant la rigidité hépatique macroscopique ¹⁹.

Dans TE, des ondes ultrasonores d’amplitude légère et de basse fréquence (50 Hz) se propagent à travers le foie, et leur vitesse est mesurée, qui est ensuite utilisée pour calculer le module d’élasticité^{tissulaire 13}. Cependant, cette technique n’est pas utile pour les patients souffrant d’ascite, d’obésité ou d’espaces intercostaux inférieurs en raison d’une mauvaise transmission des ondes ultrasonores à travers les tissus entourant le foie⁹.

L’EMR est basée sur la modalité d’imagerie par résonance magnétique et utilise des ondes de cisaillement mécaniques de 20 à 200 Hz pour cibler le foie. Une séquence spécifique d’imagerie par résonance magnétique est ensuite utilisée pour tracer les ondes à l’intérieur du tissu et calculer la rigidité tissulaire¹⁶. Les valeurs de rigidité rapportées avec les techniques TE et MRE sont bien corrélées avec le degré de fibrose hépatique obtenu à partir de biopsies d’échantillons de foie humain classés à l’aide des scores histologiques METAVIR²⁰ (tableau 1). TE et MRE ont également été adaptés pour la mesure de la rigidité hépatique dans des modèles de rongeurs à des fins de recherche^21,22,23. Cependant, comme les deux méthodes déduisent les valeurs de rigidité de la réponse du tissu aux ondes de cisaillement qui se propagent, les valeurs obtenues peuvent ne pas refléter la rigidité mécanique absolue du tissu.

Pour une caractérisation mécanique directe du foie des rongeurs, Barnes et coll. ont mis au point un essai modèle-gel-tissu (dosage MGT) impliquant l’incorporation de tissu hépatique dans du gel de polyacrylamide²⁴. Ce gel est comprimé par une force uniforme pulsée à partir de laquelle le module de Young peut être calculé. Le test MGT montre une bonne corrélation avec un test d’indentation adapté aux foies normaux et fibrotiques²⁴ (tableau 1).

Tableau 1 : Valeurs de rigidité hépatique au niveau de l’agrégation. TE et MRE comparés à des mesures mécaniques ex vivo directes des modules élastiques hépatiques utilisant des tests d’indentation et de MGT pour les foies provenant de différentes sources. La relation entre E et G est donnée par E = 2G (1 + v), où v est le rapport de Poisson de l’échantillon; F0 à F4 représentent le score de fibrose dans le système de notation METAVIR, F0 indiquant une fibrose faible ou nulle et F4 des foies cirrhotiques. Abréviations : TE = élastographie impulsionnelle; EMR = élastographie par résonance magnétique; MGT = modèle-gel-tissu; E = module d’élasticité (de Young); G = module de cisaillement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

L’un des principaux inconvénients des mesures génériques de rigidité hépatique est qu’elles ne fournissent pas de résolution au niveau cellulaire de l’hétérogénéité de la rigidité dans le foie. Au cours de la progression de la fibrose, les zones riches en collagène montrent une rigidité plus élevée par rapport au parenchyme environnant^25,26. Ce gradient de rigidité influence localement les cellules résidentes et joue un rôle important dans l’hétérogénéité des CSH²⁷. Ainsi, les changements dans les propriétés mécaniques locales au cours du développement de la maladie hépatique doivent être caractérisés au niveau microscopique pour mieux comprendre la progression de la fibrose.

L’AFM permet de mesurer les propriétés mécaniques des tissus avec une haute résolution et une sensibilité élevée à la force. AFM utilise la pointe d’un porte-à-faux pour indenter la surface d’un échantillon avec des forces aussi faibles que plusieurs piconewtons, induisant une déformation à un niveau microscopique ou nanoscopique basée sur la géométrie et la taille de la pointe utilisée. La réponse de force de l’échantillon à la déformation appliquée est ensuite mesurée comme la déviation dans le porte-à-faux²⁸. Les courbes force-déplacement sont collectées à partir de l’approche et de la rétraction du porte-à-faux, qui peut être équipé de modèles de mécanique de contact appropriés pour évaluer la rigidité locale de l’échantillon²⁹.

En plus de mesurer la rigidité d’une zone donnée, AFM peut également fournir des informations topographiques sur des caractéristiques spécifiques de l’échantillon, telles que la structure des fibres de collagène^30,31,32. De nombreuses études ont décrit l’application de l’AFM pour mesurer la rigidité de divers tissus sains et malades, tels que la peau 32,33, le poumon 34,35, le cerveau³⁶, le sein^37,38,39, le cartilage 40 ou le cœur^41,42,43,44 à partir d’échantillons de modèles de patients et de souris. En outre, AFM a également été utilisé in vitro pour déterminer la rigidité des cellules et des échafaudages de protéines extracellulaires^45,46,47.

La mesure des propriétés mécaniques des échantillons biologiques à l’aide de l’AFM n’est pas triviale en raison de leur douceur et de leur fragilité. Ainsi, diverses études ont normalisé différentes conditions et paramètres, ce qui donne des valeurs très fluctuantes des modules de Young (examiné par Mckee et ^al.48). Comme pour d’autres tissus mous, les valeurs de module de Young hépatique à différents degrés de fibrose hépatique présentent également des variations importantes (tableau 2). Les différences dans les valeurs de module de Young proviennent de différences dans le mode de fonctionnement de l’AFM, la pointe en porte-à-faux, la méthode de préparation de l’échantillon, l’épaisseur de l’échantillon, la profondeur et les forces d’indentation, l’environnement du tissu hépatique pendant la mesure et la méthode d’analyse (tableau 2).

Tableau 2 : Valeurs de rigidité hépatique au niveau cellulaire. Les valeurs de rigidité hépatique obtenues à l’aide de l’AFM décrivent les propriétés mécaniques du foie au niveau cellulaire. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; E = module d’élasticité (de Young); PFA = paraformaldéhyde; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Cet article décrit un protocole pour la mesure reproductible des modules de Young des zones fibrotiques riches en collagène dans le tissu hépatique par AFM avec une localisation précise fournie par l’utilisation de la microscopie à polarisation. Nous avons administré du tétrachlorure de carbone (CCl₄) pour induire le dépôt de collagène de manière centrilobulaire⁴⁹ dans un modèle murin, imitant de manière fiable des aspects cruciaux de la fibrose hépatique humaine⁵⁰. Les images microscopiques polarisées permettent de visualiser le collagène dans le foie en raison de la biréfringence des fibres de collagène⁵¹, ce qui permet un positionnement précis de la pointe en porte-à-faux sur la zone d’intérêt souhaitée dans le lobule hépatique⁵².

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à un protocole animal approuvé par le Comité de protection des animaux de l’Institut de génétique moléculaire et conformément à la directive européenne 2010/63/UE pour l’expérimentation animale. Un diagramme schématique global du protocole présenté est présenté à la figure 1.

Figure 1 : Schéma général de l’évaluation AFM du module de Young à partir de foies de souris. (A) Isolement du foie des souris témoins ou traitées, suivi d’une section et d’un stockage à −80 °C (conservation maximale, 2 semaines). (B) Fixation du cordon sphérique au porte-à-faux avec durcissement ultérieur de la colle pendant la nuit (à gauche). Calibrage en porte-à-faux suivi du montage de l’échantillon (à droite). (C) Alignement du polariseur et de l’analyseur pour visualiser les structures de collagène brillantes suivi d’une superposition de l’image dans la caméra avec le champ de mesure sous le porte-à-faux AFM. D) Acquisition de cartes de rigidité et analyse. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; OCT = composé à température de coupe optimale; CCl₄ = tétrachlorure de carbone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation de l’échantillon I

1. Extraire le foie de l’abdomen ouvert d’une souris euthanasiée par luxation cervicale sous anesthésie. Isoler le lobe latéral gauche et incorporer la moitié latérale du lobe dans un composé à température de coupe optimale (OCT) par congélation rapide sur de la glace sèche. Conserver le tissu incorporé dans les TCOM à −80 °C.
   NOTE: Des études antérieures ont montré que les valeurs de rigidité sont similaires entre les tissus congelés et frais^25,26.
2. Section de coupes de foie de 30 μm d’épaisseur sur des lames chargées positivement à l’aide d’un cryotome et conserver les lames à −80 °C jusqu’au jour de la mesure de l’AFM dans 2 semaines au maximum.

2. Mise en place de l’instrument

1. Fixation d’un cordon de 5,7 μm à la pointe en porte-à-faux AFM (figure supplémentaire S1, étapes 1 à 5)
   REMARQUE : La fixation du cordon au porte-à-faux a également été décrite précédemment par Norman et ^coll.46.
   1. Étaler uniformément la suspension de billes de résine mélamine de 5,7 μm de diamètre sur la moitié de la surface d’une lame de verre et sécher à l’air libre pour évaporer le solvant (Figure supplémentaire S1, étape 1).
   2. Sur l’autre moitié de la lame, à l’aide d’une pointe de 10 μL, faire une fine ligne de résine époxy prémélangée avec un long temps de travail (Figure supplémentaire S1, étape 1).
   3. Chargez la sonde en porte-à-faux sur la tête AFM conformément aux instructions du fabricant.
   4. Montez la glissière et le couvercle avec la tête AFM équipée de la sonde cantilever.
      REMARQUE: Un porte-à-faux SD-qp-BioT-TL-10 a été utilisé dans l’étude.
   5. Amenez la colle de résine époxy prémélangée au centre de la lame et approchez la colle avec le porte-à-faux avec une faible force (réglez un point de consigne à 1 V pour suivre ce protocole; Figure supplémentaire S1, étape 2).
      REMARQUE: Avant de vous approcher de la surface de la glissière, assurez-vous que le laser est aligné au centre de la pointe du porte-à-faux, indiqué par une tension de somme élevée en suivant les étapes 6 à 8 de la section 2, partie 3, Étalonnage de la constante de ressort du porte-à-faux AFM.
   6. Une fois que la pointe de la sonde en porte-à-faux entre en contact avec la colle, déplacez-la juste au-dessus de la glissière pour enlever l’excès de colle.
   7. Maintenant, retirez la pointe en porte-à-faux de la glissière et déplacez la lame pour amener une seule perle au centre (Figure supplémentaire S1, étape 3). Approchez à nouveau le cordon avec la sonde cantilever AFM avec une force plus élevée (point de consigne 2 V) pour fixer le cordon au centre de la sonde en porte-à-faux et laissez-le pendant au moins 10 s (Figure supplémentaire S1, étape 4).
   8. Extrayez la sonde en porte-à-faux et conservez-la toute la nuit à température ambiante pour durcir la colle ou suivez les instructions pour la résine époxy (Figure supplémentaire S1, étape 5).
2. Configuration du polariseur et de l’analyseur
   1. Pour localiser les zones d’intérêt dans les sections du foie, installez le microscope avec le polariseur et l’analyseur. Aligner leurs azimuts vibratoires à un angle compris entre 0° et 90° l’un par rapport à l’autre en faisant pivoter l’un par rapport à l’autre manuellement ou de manière automatisée pour minimiser la lumière transmise et maximiser les rayons extraordinaires traversant l’objectif. Assurez-vous que les fibres de collagène apparaissent brillantes sur un fond sombre dans l’image polarisée (Figure 2), ce qui se reflète par un déplacement du pic de l’histogramme de l’image vers des pixels lumineux.

Figure 2 : Des images de microscopie représentatives montrent une visualisation prononcée des fibres de collagène en microscopie polarisée par rapport aux images en fond clair. Des coupes de foie de souris traitées avec CCl₄ pendant 3 semaines ont été soumises à (A) une microscopie à fond clair et (B) polarisée. Les fibres de collagène biréfringent sont clairement visibles en blanc dans les images polarisées par rapport aux images en fond clair. La boîte rouge représente la zone riche en collagène utilisée pour la mesure AFM. Les encarts affichent des vues agrandies de la zone dans la zone rouge. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; CCl₄ = tétrachlorure de carbone; CV = veine centrale; PV = veine porte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

REMARQUE: Pour ce protocole, la tête AFM peut être installée sur n’importe quel microscope inversé approprié avec la possibilité d’insérer un polariseur et un analyseur. Le système doit être placé dans une unité d’isolation pour réduire le bruit de fond.

3. Calibrage de la constante de ressort du porte-à-faux AFM
   1. Chargez la sonde en porte-à-faux (préparée conformément aux étapes 1 à 8 de la section 2, partie 1, Fixation d’un cordon de 5,7 μm à l’extrémité du porte-à-faux AFM) sur la tête AFM conformément aux instructions du fabricant.
   2. Nettoyez le porte-à-faux avec de l’éthanol à 70% pour éviter la contamination du porte-à-faux pendant la mesure. Laver abondamment à l’eau distillée pour éliminer l’éthanol résiduel de la pointe.
   3. Activez le mode contact et sélectionnez le mappage de force comme méthode de mesure.
   4. Ouvrez toutes les fenêtres correspondantes (Z Stepper Motors, Motorized Stage Control, Data Viewer, Force Scan Map Oscilloscope, Laser Alignment et Camera window) dans les onglets du logiciel en cliquant sur les boutons correspondants.
   5. Montez une lame de verre propre contenant 1,2 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une zone d’environ 2 cm x 4 cm délimitée à l’aide d’un marqueur hydrophobe. Montez la tête AFM sur la platine du microscope et assurez-vous que le porte-à-faux est complètement immergé dans le PBS.
   6. Concentrez l’objectif sur la pointe en porte-à-faux. Réduisez l’intensité de la lumière transmise sur le microscope pour obtenir une meilleure vue de la position du laser sur le moniteur.
   7. Ciblez le laser à l’extrémité translucide du porte-à-faux (sous lequel le cordon sphérique est fixé) et alignez le miroir à l’aide des boutons de la tête AFM pour maximiser l’intensité totale du faisceau laser sur le détecteur (représentée par la somme dans la fenêtre Alignement laser ).
   8. Alignez le détecteur de photodiodes à l’aide des boutons présents sur la tête AFM pour positionner le laser en son centre.
   9. Laissez le porte-à-faux se stabiliser pendant 15 minutes avant de procéder à l’étalonnage.
   10. Ouvrez le gestionnaire d’étalonnage et insérez le type de porte-à-faux, les dimensions en porte-à-faux et les conditions environnementales. Calibrez la constante de ressort et la sensibilité (également connue sous le nom de sensibilité inverse du levier optique, InvOLS) en cliquant sur Calibrer. Confirmer la précision de la constante de ressort obtenue après étalonnage avec la déclaration du fabricant. Calibrer le porte-à-faux en mode sans contact (l’étalonnage est effectué par le logiciel à l’aide du théorème thermique dérivé par Sader et al.58).
       NOTE: La constante de ressort du porte-à-faux représente la rigidité du porte-à-faux et est donnée par la force de résistance du porte-à-faux lorsqu’il se déforme selon la longueur de déformation en termes de N/m. La sensibilité du porte-à-faux représente la valeur de la réponse de la photodiode (en volts) en réponse à la déviation du porte-à-faux (en nanomètres) et est généralement présentée en termes de nm/V⁵⁹. En mode sans contact, le spectre de bruit thermique est enregistré et équipé automatiquement de la fonction hydrodynamique⁶⁰ par le logiciel de contrôle AFM après étalonnage. Le raccord fournit les paramètres d’étalonnage, à savoir la constante de ressort et l’InvOLS. La constante de ressort du porte-à-faux SD-qp-BioT-TL-10 utilisé dans cette étude était de 0,09 N/m, comme déclaré par le fabricant.

3. Préparation de l’échantillon II

1. Décongeler les sections congelées (conservées à −80 °C, comme décrit à la section 1, Préparation de l’échantillon I) à température ambiante pendant 2 min.
2. Fixer les sections avec du paraformaldéhyde (PFA) glacé à 4% dans 1x PBS pendant 10 min à 4 °C suivi d’un lavage approfondi (5x) avec 1x PBS. Essuyez le PBS résiduel autour de la section avec un mouchoir et marquez une limite d’environ 2 cm x 4 cm autour de la section du foie avec un stylo marqueur hydrophobe. Couvrir l’échantillon avec 1x PBS (s’assurer que la zone délimitée contient ~1,2 mL de 1x PBS). Utilisez l’échantillon pour les mesures AFM.
   REMARQUE : Étant donné que le PFA est un produit chimique dangereux, il doit être manipulé avec précaution pour éviter tout contact avec la peau ou les yeux. Pour éviter ses fumées toxiques, toutes les procédures impliquant du PFA doivent être effectuées dans une hotte chimique certifiée ou dans un autre endroit ventilé approuvé.

4. Mesure

1. Activez l’enregistrement automatique en accédant à l’onglet Configuration et en cochant l’enregistrement automatique. Spécifiez le nom du fichier et le répertoire pour enregistrer les fichiers de mesure en accédant à l’onglet Configuration , puis en cliquant sur Enregistrement des paramètres.
2. Charger l’échantillon (préparé conformément à la section 3, Préparation de l’échantillon II). Approchez la surface du tissu avec le porte-à-faux AFM en allumant le laser et en cliquant sur la touche d’approche . Une fois que la pointe est en contact avec la surface du tissu, rétractez la pointe en porte-à-faux de sorte que la pointe reste au centre de l’objectif (en cliquant sur la touche Rétractable, qui rétracte le porte-à-faux à l’extrémité supérieure de la plage piézoélectrique). Réalignez le détecteur si la position du laser est éloignée de son centre dans la fenêtre Alignement laser .
3. Éteignez le laser et superposez le champ optique du microscope avec les cartes de mesure AFM en cliquant sur l’onglet Accessoires , puis en sélectionnant Calibrage optique par superposition directe. Dans la fenêtre suivante, cliquez sur Suivant pour prendre une série d’images du porte-à-faux scannant une zone spécifique. Cliquez à nouveau sur Suivant pour passer à la fenêtre suivante.
4. Dans la première image, cliquez manuellement sur le centre de la pointe du porte-à-faux pour représenter la position de la pointe dans le logiciel. Le cercle représentant la position de la pointe peut être manipulé en taille en indiquant son rayon pour augmenter la précision. Cliquez sur Calibrer pour détecter automatiquement la position de la pointe en porte-à-faux dans toutes les images. Confirmez l’exactitude de la détection des pointes en parcourant les images.
5. Cliquez sur Suivant , puis sur Terminer pour terminer la superposition optique et enregistrer la série d’images capturées lors de l’étalonnage optique.
6. Rétractez davantage le porte-à-faux pour éviter sa collision avec des surfaces plus élevées sur la glissière. Déplacez la scène pour positionner une zone riche en collagène à l’intérieur de la boîte verte visible dans l’onglet Visionneuse de données à l’aide de l’image polarisée. Sélectionnez la zone riche en collagène en créant un rectangle autour d’elle en appuyant longuement sur le bouton gauche de la souris à l’intérieur de la boîte verte spécifiée. Définissez les dimensions, l’orientation et la résolution de la zone sélectionnée sous l’onglet Grille sur le côté gauche. Cliquez sur Confirmer la nouvelle région de numérisation pour définir la zone sélectionnée comme zone de mesure.
7. Conservez les paramètres IGain et PGain de la boucle de rétroaction aux valeurs par défaut, si aucune instabilité majeure n’est présentée sous forme d’hypersensibilité du système. Pour suivre ce protocole, définissez IGain à 50 Hz et PGain à 0,001.
8. Réglez le point de consigne à 1 nN.
   REMARQUE : Le point de consigne est la force de l’interaction pointe-surface pendant l’état stationnaire. Pour la plupart des échantillons mous (cellules, gels et tissus), des valeurs de consigne comprises entre 0,5 et 2,0 nN sont appropriées.
9. Sélectionnez la valeur de consigne relative en fonction des propriétés mécaniques du matériau étudié et de la rigidité du porte-à-faux. Pour ce protocole, définissez la valeur sur 5 nN.
   REMARQUE : Le point de consigne relatif représente la force maximale d’interaction, lorsque le pic de la courbe force-distance est atteint et que le mouvement de la pointe revient à la ligne de base. Pour les matériaux mous (1-50 kPa), ce paramètre est défini en unités de nanonewtons (nN). De plus, pour un porte-à-faux souple (avec une constante de ressort de 0,05 N/m à 0,35 N/m), la force maximale pouvant être appliquée est d’environ 50 nN. Ajustez les valeurs de consigne et de consigne relatives en conséquence.
   1. Assurez-vous que la valeur de consigne donnée ne conduit pas à une profondeur d’indentation supérieure au rayon du pénétrateur sphérique, sinon la surface d’indentation ne peut pas être correctement définie dans le calcul du module de Young. Calculer la valeur moyenne de la profondeur d’indentation après la première exécution des indentations; voir la Section 5, Analyse des données, pour savoir comment traiter les données enregistrées. Ajustez la valeur de consigne si nécessaire.
10. Définissez Ajuster la ligne de base sur 5.
    REMARQUE : Ici, la ligne de base fait référence au degré de polynôme utilisé pour ajuster les courbes d’approche et de retrait. Le réglage de la ligne de base sur 5 ajuste les courbes à haute résolution et garantit ainsi la capture du bruit de fond pendant les mesures.
11. Sélectionnez la longueur du mouvement en porte-à-faux sur l’axe Z (longueur Z) en fonction de la topographie de surface de l’échantillon. Pour suivre ce protocole, réglez la longueur Z à 15 μm.
    REMARQUE: Une valeur élevée (par exemple 15 μm) réduit la sensibilité de mesure, mais est généralement requise pour les échantillons avec une surface très irrégulière comme le tissu hépatique fibrotique.
12. Réglez le mouvement Z sur Durée constante.
    REMARQUE: Le mouvement Z peut également être réglé sur Vitesse constante pour afficher les données relatives au mouvement Z ( Extend Speed et Extend Time) dans un mode différent.
13. Définissez le temps d’extension sur 1 s. Définissez le délai de prolongation et le délai de rétractation sur 0.
    REMARQUE : Utilisez des vitesses d’extension de >5,0 μm/s pour les matériaux très mous⁶¹, car des vitesses d’indentation plus faibles entraîneront une réponse plus visqueuse et moins élastique des surfaces molles. Le délai d’extension et le délai de rétraction sont des paramètres qui peuvent être utilisés pour étudier l’interaction spécifique entre la pointe du porte-à-faux et le substrat (par exemple, les interactions d’une protéine immobilisée à la surface du porte-à-faux avec des protéines immobilisées sur la surface de la lame).
14. Définissez la fréquence d’échantillonnage sur 5000 Hz.
    REMARQUE : La fréquence d’échantillonnage fait référence à la fréquence des points qui sont enregistrés sur une courbe d’approche-retrait complète. Réglez-le sur une valeur élevée (par exemple 5000 Hz) pour éviter de manquer certaines régions des courbes en raison de leur transition extrêmement rapide.
15. Marquez la boucle fermée Z avec une coche pour activer un système de boucle de rétroaction, qui assure une distance constante entre la surface de l’échantillon et la pointe en porte-à-faux.
16. Désengagez l’étage motorisé en désélectionnant Engager et cliquez sur Approche pour approcher l’échantillon avec le porte-à-faux. Cliquez sur Démarrer la numérisation pour commencer à collecter les courbes force-distance dans la zone définie à l’étape 6; Section 4, Mesure.

5. Analyse des données

1. Analysez les données acquises à l’aide du logiciel open-source « AtomicJ » (qui peut être téléchargé à partir de https://sourceforge.net/projects/jrobust/).
   REMARQUE: Il prend en charge les fichiers collectés à partir des microscopes à force atomique Agilent Technologies, JPK Instruments ou Bruker.
2. Chargez les courbes de force dans le programme en cliquant sur l’icône des courbes de force de processus et des cartes dans AtomicJ (Figure supplémentaire S2A, x). Dans l’assistant de traitement, ajoutez les cartes à analyser en cliquant sur le bouton Ajouter (Figure supplémentaire S2A, y). Cliquez sur Suivant après le chargement des cartes (Figure supplémentaire S2A, z).
3. Spécifiez les paramètres de traitement dans la fenêtre suivante en fonction des étapes décrites ci-dessous (correspondant aux étapes de la figure supplémentaire S2B, étapes 1 à 11) :
   1. Estimer le point de contact entre l’échantillon et le porte-à-faux manuellement par calcul ou automatiquement à l’aide d’un ensemble de paramètres de courbe d’ajustement. Pour suivre ce protocole, utilisez l’estimation automatique du point de contact.
   2. Déterminer le point de contact entre le porte-à-faux et l’échantillon par la méthode classique de la grille focalisée.
   3. Sélectionnez la méthode d’estimation pour obtenir la meilleure détermination du point de contact en fonction de la qualité des courbes de force mesurées, qui doit être déterminée empiriquement lors de l’optimisation de l’analyse des données. Pour suivre ce protocole, utilisez la méthode indépendante du modèle.
   4. Ajustez la courbe d’indentation de force à l’aide d’un modèle classique (utilisez Classical L2 pour ajuster le modèle pour suivre ce protocole).
      REMARQUE: L’ajustement du modèle et l’estimateur de contact sont des paramètres qui régissent la façon dont les courbes sont ajustées par le logiciel et comment le point de contact est établi dans la courbe ajustée, respectivement. Pour ces mesures, l’option classique a été utilisée, qui utilise la régression des moindres carrés. Cela traite chaque point de faible force sur la courbe comme un point de contact d’essai et ajuste un polynôme à la région avant le point de contact de l’essai. Il adapte ensuite le modèle de contact approprié aux données d’indentation de force collectées. Le point qui donne la plus petite somme de carrés est supposé comme point de contact. D’autres méthodes peuvent être utilisées en fonction de la qualité des courbes de force obtenues^62,63.
   5. Définissez l’ajustement du modèle sur la courbe de retrait .
   6. Fixer le ratio de Poisson à 0,45, tel que recommandé pour les tissus mous tels que le foie²⁴.
   7. Réglez l’ajustement de la courbe en utilisant un degré de base de 3 et un degré de contact de 1. Modifiez le degré d’ajustement du polynôme en fonction de l’échelle des écarts des courbes par rapport au modèle.
   8. Sélectionnez le modèle utilisé pour ajuster les courbes de retrait. Utilisez le modèle de Sneddon , qui calcule le module de Young en fonction de l’équation (1) et de l’équation (2) :
      (1)
      δ = (2)
      où F est la force, E est le module de Young, v est le rapport de Poisson de l’échantillon, δ est la profondeur d’indentation, a est le rayon de contact et R est le rayon de sphère^62,63.
   9. Remplissez le rayon de la pointe sphérique en micromètres (2,9 μm dans ce protocole).
   10. Chargez la constante Spring et InvOLS à partir des fichiers de données en activant la lecture (cochez les cases).
   11. Cliquez sur Terminer.
       NOTE: Les données analysées sont présentées sous forme de cartes de déviation verticale, hauteur, adhérence, force de contact, déformation, force d’adhérence, valeurs R² , pente, module de Young, indentation de transition, force de transition et position de contact calculées pour chaque courbe de force (figure supplémentaire S3, en haut à gauche). Deux fenêtres supplémentaires affichent des courbes de force et des valeurs brutes (figure supplémentaire S3, panneaux supérieur droit et inférieur, respectivement).
4. Exclure les courbes de force où le porte-à-faux s’est approché de la surface de la section hépatique de manière incorrecte. Pour les identifier, recherchez des courbes avec un bruit élevé, des formes aberrantes et/ou une approche incomplète, comme démontré à la figure 3 et discuté en détail ailleurs⁴⁶.

Figure 3 : Exemples de courbes de déplacement de force représentatives. (A,B) Courbes de force interprétables représentatives pour les plus rigides (A; E = 10,5 kPa) et plus doux (B; E = 1,78 kPa) qui se prêtent à l’analyse. (C-F) Graphiques représentatifs non interprétables qui doivent être exclus de l’analyse en raison d’une approche incorrecte ou (F) d’un bruit plus élevé. Comme indiqué dans la légende fournie en (A), les courbes rouges montrent l’approche du porte-à-faux, et les courbes vertes montrent la rétraction du porte-à-faux. Des lignes noires montrent l’ajustement de la courbe de retrait du porte-à-faux. La pente des lignes noires correspond au module de Young. Les points rouge et bleu correspondent respectivement au point de contact et au point de transition. Le point de contact est le dernier point de contact entre le porte-à-faux et le substrat pendant la rétraction, tandis que le point de transition décrit la transition du porte-à-faux de l’approche à la rétraction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Des coupes hépatiques légèrement fixées de 30 μm d’épaisseur obtenues chez des souris témoins et des souris présentant une fibrose légère ou avancée (induite par injection de CCl₄ pendant 3 semaines ou 6 semaines, respectivement⁴⁹) ont été sondées avec AFM comme décrit dans ce protocole. Des fibres de collagène proches des veines centrales ont été sélectionnées pour la mesure des cartes de rigidité. Les zones proches des veines centrales, qui correspondent aux zones où se forment habituellement les fibres de collagène chez les animaux traités au CCl₄, ont été analysées dans les foies témoins (Figure 4A). La distribution des modules de Young était reproductible sur différents foies témoins et zones riches en collagène au sein d’une seule section hépatique (Figure 4B : tracé du violon gauche).

Chez les animaux traités au CCl 4, les cartes de rigidité correspondant aux zones péricentrales des dépôts de collagène ont montré des valeurs significativement plus élevées des modules de Young par rapport aux zones équivalentes chez les souris témoins (Figure 4B : 1,9 kPa contre 2,6 kPa médiane Valeurs du module de Young pour le contrôle vs souris traitée CCl 4 à 3 semaines ; p = 0,07 ; 1,9 kPa vs 5,1 kPa médiane Valeurs du module de Young pour le contrôle vs 6 semaines CCl₄ -souris traitée; p = 0,02). De plus, il y avait une augmentation significative des valeurs des modules de Young avec un traitement CCl 4 plus long (Figure 4B; 2,6 kPa contre 5,1 kPa valeurs médianes du module de Young pour une souris traitée à 3 semaines par rapport à une souris CCl₄ à 6 semaines; p = 0,04). Cela montre un raidissement progressif des dépôts de collagène avec la progression de la fibrose et que les mesures AFM reflètent la fibrogenèse.

Pour évaluer l’effet du stockage prolongé de coupes hépatiques intégrées dans les OCT sur les propriétés mécaniques des fibres de collagène, nous avons mesuré la rigidité des fibres de collagène dans des sections de souris traitées au CCl₄, qui ont été stockées à -80 °C pendant 2 semaines ou 3 mois sur la lame après la coupe (Figure 5). Les mesures de l’AFM ont montré des valeurs significativement plus faibles des modules de Young dans les zones riches en collagène pour les sections stockées pendant 3 mois par rapport à celles obtenues à partir de sections mesurées dans les 2 semaines suivant la sectionnement de l’échantillon (Figure 5; 4,7 kPa contre 3,6 kPa valeurs médianes du module de Young pendant 2 semaines contre 3 mois de stockage; p < 0,001). Ainsi, il est important de mesurer les propriétés mécaniques du tissu hépatique peu de temps après la préparation des sections à partir des lobes hépatiques intégrés dans les OCT.

Figure 4 : Les mesures de l’AFM révèlent un raidissement progressif des zones riches en collagène en corrélation avec un traitement prolongé par CCl₄. (A) Des coupes de foie de souris témoins et de souris traitées avec CCl₄ pendant 3 semaines ou 6 semaines ont été utilisées pour mesurer les propriétés mécaniques des zones riches en collagène. Les zones en boîte des sections hépatiques montrées dans les images de microscopie polarisée (à gauche) sont des zones de balayage riches en collagène (ou des régions correspondantes dans le foie témoin) sélectionnées pour les mesures AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Les cartes de module de Young avec des échelles de couleurs correspondant à ces zones encadrées sont affichées à droite, y compris les histogrammes des valeurs de module de Young à partir de ces cartes; Les nuages de points en médaillon indiquent des valeurs >10 kPa pour chaque condition. Le raidissement du foie est visualisé comme un déplacement progressif vers la droite de la distribution de l’histogramme et une fréquence plus élevée de points dans le nuage de points en médaillon. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Les diagrammes de violon montrent la distribution des modules élastiques de trois zones mesurées pour chaque condition (à gauche) et les valeurs résumées des modules élastiques des trois cartes (à droite). Les tracés de violon montrent la médiane (ligne rouge), le 25e percentile et le 75e percentile (lignes noires); Les points représentent les valeurs moyennes des cartes individuelles des zones 1 à 3. Les valeurs p présentées ont été calculées à l’aide d’un test t de Student effectué sur des moyennes. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; CCl₄ = tétrachlorure de carbone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Le stockage prolongé des sections de foie entraîne une diminution de la rigidité des zones riches en collagène. Des coupes de foie (préparées à partir de souris traitées avec CCl₄ pendant 2 semaines) stockées à -80 °C pendant 2 semaines ou 3 mois ont été utilisées pour mesurer le module de Young. Images de microscopie polarisée (à gauche) avec des cases indiquant les zones riches en collagène utilisées pour la mesure AFM (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Cartes de module de Young correspondantes avec des échelles de couleurs (à droite). Les histogrammes montrent les valeurs de module de Young recueillies dans 4 à 6 zones de chaque échantillon; Les graphiques de dispersion en médaillon montrent des valeurs >10 kPa pour chaque condition. Barre d’échelle = 20 μm. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; CCl₄ = tétrachlorure de carbone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Procédé de modification du porte-à-faux avec une microbille de résine mélamine. (A) Le schéma dessiné illustre la fixation d’une perle sphérique à l’extrémité du porte-à-faux. Pour une description par étapes, voir Section 2, Partie 1, Fixation d’un cordon de 5,7 μm à la pointe en porte-à-faux AFM. (B) Image microscopique d’une bille sphérique de 5,7 μm fixée à la pointe du porte-à-faux montrée de haut (gauche) et latérale (droite). Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; RT = température ambiante. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Analyse des données dans AtomicJ. (A) La séquence des étapes à suivre pour l’ouverture des cartes de rigidité dans AtomicJ. Un simple clic gauche sur les courbes de force de processus et les cartes (x) ouvre l’assistant de traitement. Les fichiers peuvent être chargés dans l’assistant de traitement en cliquant sur ajouter (y) et en sélectionnant les fichiers requis. Cliquez sur suivant (z) pour passer à l’étape suivante. (B) Paramètres pour l’ajustement de la courbe, modèle de mécanique de contact approprié et réglages AFM utilisés pendant la mesure. Les étapes 1 à 11 renvoient aux sous-points correspondants détaillés à l’étape 3 du protocole, section 5, Analyse des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Aperçu des données analysées dans AtomicJ. L’aperçu des données analysées affiche des cartes de rigidité (fenêtre supérieure gauche), des courbes de force (fenêtre supérieure droite) et des données brutes (fenêtre inférieure). Abréviation : AFM = microscopie à force atomique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole présenté fournit une méthode reproductible étape par étape pour la mesure AFM du tissu hépatique normal et fibrotique de souris. La microscopie à polarisation couplée offre une grande précision spatiale et permet de visualiser les fibres de collagène grâce à leur biréfringence. En outre, une description détaillée de l’analyse des courbes de force obtenues est fournie. La mesure de la rigidité AFM peut être effectuée au niveau cellulaire, ce qui permet de surveiller les changements locaux dans les propriétés mécaniques du tissu hépatique dus au développement d’une maladie fibrotique. La fibrose hépatique n’est pas un processus homogène affectant l’ensemble de l’organe. Au contraire, les zones de septa fibrotiques riches en collagène sont entrecoupées de zones de dépôts de collagène faibles ou nuls. Ainsi, les changements de rigidité sont spécifiques au microenvironnement local et n’affectent que les cellules localement en contact avec les zones endommagées par une blessure. Cette micro-échelle d’hétérogénéité de rigidité est également apparente dans les détails des cartes de module d’AFM Young, où les points de rigidité élevée bordent les zones de rigidité presque normale. Cette variation montre que même la zone du tissu cicatriciel de collagène n’est pas mécaniquement homogène et nécessite une mesure AFM pour être caractérisée au niveau cellulaire (Figure 4).

Le protocole présenté permet de mesurer la rigidité hépatique par AFM indépendamment de la collecte hépatique, car les lobes hépatiques entiers intégrés dans l’OCT peuvent être stockés pendant une période prolongée à -80 ° C. Cependant, une fois le tissu sectionné, nous recommandons de mesurer les échantillons dans un délai de ~2 semaines, car nous avons observé un ramollissement progressif des sections de tissu stockées pendant de plus longues périodes (Figure 5).

L’AFM équipé de la microscopie à polarisation permet de localiser avec précision la zone d’intérêt dans la structure du lobule hépatique. Cependant, il présente également certaines limites qui doivent être prises en compte lors de l’interprétation des résultats. Les valeurs de rigidité obtenues ici ont été mesurées à température ambiante. Nous supposons que les effets de la température sur les propriétés mécaniques des tissus mous seront faibles; Cependant, cela pourrait être l’une des raisons des différences entre les valeurs in vivo rapportées des propriétés mécaniques des tissus hépatiques et les valeurs de cette étude.

De plus, ce protocole permet l’analyse AFM du tissu hépatique jusqu’à 3 heures, ce qui nécessite une légère fixation du tissu. La légère fixation des sections de tissus, ainsi que le cycle gel-décongélation, affecteront très probablement les valeurs absolues du module de Young. Ainsi, les valeurs rapportées des modules de Young pourraient différer des valeurs in vivo . D’autres études sont nécessaires pour optimiser le protocole de mesure des valeurs absolues du module de Young à partir de coupes hépatiques, ce qui peut être réalisé par une méthode différente de fixation du tissu hépatique⁶⁴.

Néanmoins, nous avons observé une rigidité croissante des zones riches en collagène dans le foie de souris traitées avec CCl₄ pendant 3 semaines par rapport à 6 semaines. De tels changements correspondent à la progression de la fibrose lors d’une lésion prolongée (Figure 4) et montrent que les différences relatives peuvent être sondées entre les différents traitements en utilisant le protocole présenté. Ceci est en accord avec les observations de Calò et al., qui ont montré que les sections hépatiques légèrement fixées montrent des différences similaires dans les valeurs de rigidité entre les zones riches en collagène et les zones manquantes de collagène que dans les tissus frais²⁵.

Nous avons utilisé le porte-à-faux SD-qp-BioT-TL-10 (constante de ressort théorique ~0,09 N/m) modifié avec une pointe sphérique de 5,7 μm de diamètre pour minimiser la perturbation mécanique du tissu hépatique pendant les mesures. Un cordon de 5,7 μm a permis une indentation suffisante de l’échantillon pour sonder sa rigidité tout en préservant son intégrité. Un cordon avec un diamètre plus petit peut être utilisé, après plusieurs optimisations, pour obtenir une résolution plus élevée dans les cartes de rigidité, mais peut conduire à une surestimation supplémentaire des valeurs de module de Young (pour plus de détails, voir Crichton et ^al.65). En utilisant l’ensemble cantilever-billes spécifié, nous avons pu caractériser la rigidité de l’échantillon dans une large gamme, de dizaines d’unités de Pa à ~100 kPa.

Le modèle de Sneddon a été utilisé pour dériver le module de Young à partir de courbes de force, car il permet d’analyser des indentations profondes avec des sondes colloïdales⁶². Le modèle de Sneddon, contrairement au modèle de Hertz, ne souffre pas de la contrainte que le rayon de contact doit être beaucoup plus petit que le rayon de la sphère. Il suppose en outre que l’épaisseur de l’échantillon est plusieurs fois supérieure à la profondeur d’indentation^30,66. Dans la présente étude, l’indentation était de ~2 μm avec une taille de bille de 5,7 μm et une épaisseur d’échantillon de 30 μm dans les zones riches en collagène; ainsi, le modèle de Sneddon était approprié. D’autres modèles⁶³ considérant la force d’adhérence entre la pointe et le substrat peuvent être utilisés pour différents types de tissus.

L’analyse dans AtomicJ met en œuvre des corrections pour l’épaisseur finie des échantillons afin de minimiser la contribution d’un substrat tout en dérivant le module de Young^62,67. Dans l’analyse des courbes de force obtenues, nous avons utilisé un seul rapport de Poisson de 0,45, qui a été précédemment recommandé pour les organes des tissus mous²⁴. Cette approximation n’a pas d’effet significatif sur les valeurs calculées du module de Young, car le changement de la valeur du rapport de Poisson de 0,4 à 0,5 n’entraîne qu’une diminution de 0,893x des valeurs de module de Young calculées selon l’équation de Sneddon. Compte tenu des différences multiples dans le module de Young entre les différentes durées des traitements CCl₄, les erreurs produites par l’approximation du rapport de Poisson ne sont que marginales.

Nous avons utilisé des courbes de retrait pour calculer les valeurs de rigidité, car nous nous sommes intéressés à la réponse élastique du tissu à la charge fournie par le porte-à-faux plutôt qu’à la réponse plastique à l’indentation⁶⁸. En raison de la réponse viscoélastique des tissus mous, l’ajustement des courbes de retrait pourrait surestimer le module de Young, ce qui doit être gardé à l’esprit. En outre, nous avons observé que l’analyse des données avec des courbes d’approche donne des tendances similaires dans les valeurs de rigidité entre les zones fibrotiques et témoins, bien que les valeurs absolues soient proportionnellement plus faibles (données non présentées).

Tout en optimisant le protocole, nous avons identifié plusieurs étapes critiques pour la reproductibilité des mesures. Tout d’abord, il est important de s’assurer que la perle est approximativement au centre de la pointe translucide lors de la fixation au porte-à-faux. Cela évite un éventuel déséquilibre mécanique lors de l’indentation. Deuxièmement, lors de la fixation du foie avec PFA, il est nécessaire de suivre strictement les délais de décongélation et de fixation. Changer le moment de cette étape pourrait gravement affecter les propriétés mécaniques des sections de tissu. Troisièmement, le porte-à-faux doit être étalonné à plusieurs reprises avec une surveillance continue et la saisie de valeurs de température simultanées pour éviter que des artefacts ne se produisent dans les valeurs de rigidité en raison des fluctuations de température. Enfin, une seule section de foie ne doit pas être mesurée pendant plus de 3 heures à compter de la préparation, car le PBS superposé peut s’évaporer sur de plus longues périodes. Les lecteurs peuvent se référer au tableau de dépannage (tableau 3) pour résoudre les problèmes rencontrés lors de la mesure AFM, également discuté en détail dans Norman et ^al.46.

Tableau 3 : Guide de dépannage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Le protocole présenté permet un sondage AFM reproductible du tissu hépatique. Il a le potentiel de révéler des informations sur le développement et la régression éventuelle de la maladie hépatique fibrotique à un niveau microscopique et peut contribuer au développement de thérapies ciblant les régions cicatricielles fibrotiques formées au cours de la progression de la maladie hépatique chronique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tête AFM	Bruker	JPK nanowizard 3
Caméras	Andor	Zyla 5.5 USB (sCMOS, refroidi à l’eau)
	The Imagingsource  ;	S/N :12310015
Cantilever	SD-qp-BioT-TL-10, Nanocapteurs	S/N :73750F05
Cryotome	Leica  ;	CM1950
Colle résine époxy (longue durée de travail)	Bison époxy universel
Perles de mélamine ; diamètre, 5,7 um	Microparticules, GmbH	MF-R-5.7
Microscope	Olympus	; IX81
Hydrophobe  ; marqueur de diapositives	SuperHT	PAP PEN
Software	JPK nanowizard  ; v6.1.151
	AtomicJ v2.3.1
Superfrost slides	Réf	. thermoscientifique n° J1800AMNZ
System	Ubuntu 14.04.5 LTS Contrôle d’isolation
des vibrations unité	Stablestable	de table AVI-200-S