Article de méthode

Isolement et analyse de vésicules extracellulaires traçables et fonctionnalisées à partir du plasma et des tissus solides

DOI :

10.3791/63990

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17 octobre 2022

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1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole décrit une méthode pour extraire les vésicules extracellulaires du sang périphérique et des tissus solides avec profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons de protéines.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (VE) circulantes et résidentes dans les tissus représentent des cibles prometteuses en tant que nouveaux biomarqueurs théranostiques, et elles apparaissent comme des acteurs importants dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme et la progression d’un large éventail de maladies. Alors que les recherches actuelles se concentrent sur la caractérisation des exosomes endogènes d’origine endosomale, les microvésicules qui s’échappent de la membrane plasmique ont attiré de plus en plus d’attention dans les domaines de la santé et de la maladie, qui se caractérisent par une abondance de molécules de surface récapitulant la signature membranaire des cellules mères. Ici, une procédure reproductible est présentée basée sur la centrifugation différentielle pour extraire et caractériser les VE du plasma et des tissus solides, tels que l’os. Le protocole décrit en outre le profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons protéiques des véhicules électriques, qui sont donc traçables pour leurs dérivations et identifiés avec des composants liés à la fonction potentielle. Cette méthode sera utile pour l’analyse corrélative, fonctionnelle et mécaniste des VE dans les études biologiques, physiologiques et pathologiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des vésicules extracellulaires (VE) ont été proposées pour définir les structures extracellulaires enfermées dans la bicouche lipidiquelibérée par les cellules 1, qui jouent un rôle important dans divers événements physiologiques et pathologiques2. Les VE libérés par les cellules saines peuvent être divisés en deux catégories principales, à savoir les exosomes (ou petits VE) formés par une voie de trafic endocytaire intracellulaire3 et les microvésicules (ou gros VE) développées par le bourgeonnement vers l’extérieur de la membrane plasmique de la cellule4. Alors que de nombreuses études portent sur la fonction des VE prélevés in vitrosur des cellules cultivées 5, les VE issus de la circulation ou des tissus sont plus complexes et hétérogènes, ce qui a l’avantage de refléter l’état réel de l’organisme in vivo6. En outre, presque tous les types de tissus peuvent produire des VE in vivo , et ces VE peuvent agir comme messagers dans le tissu ou être transférés par divers fluides corporels, en particulier le sang périphérique, pour faciliter la communication systémique7. Les VE dans la circulation et les tissus sont également des cibles pour le diagnostic et le traitement des maladies8.

Alors que les exosomes ont été intensivement étudiés ces dernières années, les microvésicules ont également des fonctions biologiques importantes, qui peuvent être facilement extraites sans ultracentrifugation, favorisant ainsi la recherche fondamentale et clinique9. Notamment, un problème critique concernant les VE isolés de la circulation et des tissus est qu’ils sont dérivés de différents types de cellules10. Étant donné que les microvésicules sont soufflées à partir de la membrane plasmique et caractérisées par une abondance de molécules de surface cellulaire9, il est possible d’utiliser des marqueurs membranaires cellulaires parents pour identifier l’origine cellulaire de ces VE. Plus précisément, la technique de cytométrie en flux (FC) peut être appliquée pour détecter les marqueurs membranaires. De plus, les chercheurs peuvent isoler les véhicules électriques et effectuer d’autres analyses en fonction des cargaisons fonctionnelles.

Le présent protocole prévoit une procédure rigoureuse pour extraire et caractériser les VE à partir d’échantillons in vivo. Les VE sont isolés par centrifugation différentielle, et la caractérisation des VE comprend l’identification morphologique par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et la microscopie électronique à transmission (MET), l’analyse d’origine par FC et l’analyse de la cargaison de protéines par transfert Western. Le plasma sanguin et l’os maxillaire des souris sont utilisés comme représentants. Les chercheurs peuvent se référer à ce protocole pour les VE provenant d’autres sources et apporter les modifications correspondantes.

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Protocole

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Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la quatrième Université médicale militaire et aux directives ARRIVE. Pour la présente étude, des souris C57Bl/6 âgées de 8 semaines (aucune préférence pour les femelles ou les mâles) ont été utilisées. Les étapes de l’isolement des VE plasmatiques et tissulaires sont illustrées à la figure 1. Le plasma est pris comme représentant pour décrire la procédure d’isolation EV des fluides corporels. L’os maxillaire est pris comme représentant pour expliquer la procédure d’isolement EV des tissus solides.

1. Préparation des échantillons de plasma et d’os maxillaire

  1. Préparez les échantillons de plasma en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Déterminez le poids corporel de la souris à l’aide d’une balance de laboratoire standard.
    2. Ajouter 20 μL, 2 mg/mL d’héparine dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et utiliser le mélangeur (voir le tableau des matières) pour laisser l’héparine se fixer à la paroi du tube.
      REMARQUE: Les tubes anticoagulants peuvent également être utilisés directement pour recueillir le sang.
    3. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital sodique (voir le tableau des matières). Saisissez le cou de la souris avec le pouce et l’index, puis fixez la queue et la patte arrière gauche avec le petit doigt et injectez le pentobarbital sodique avec une seringue d’injection de 1 ml après avoir exposé le ventre.
    4. Confirmer que la souris est correctement anesthésiée en fonction de l’absence de réflexe cornéen et de réaction des membres lorsque le coussinet plantaire est pincé.
    5. Rasez les cheveux sur le visage et les cils des yeux avec des ciseaux incurvés.
    6. Saisissez la peau du cou de la souris et appuyez la peau autour des yeux à l’arrière du cou pour que le globe oculaire dépasse. Utilisez une pince à épiler ophtalmique pour serrer rapidement le globe oculaire et recueillir l’écoulement du sang à l’aide des tubes centrifugeux de 1,5 mL préparés à l’étape 1.1.2. Sacrifiez la souris en disloquant la vertèbre cervicale.
      ATTENTION : Faites attention aux poils et aux cils, car ils peuvent provoquer une hémolyse.
    7. Retournez doucement le tube plusieurs fois pour éviter la coagulation du sang.
      ATTENTION : Retournez le tube dès que possible.
    8. Centrifuger l’échantillon de sang pendant 15 min à 1 200 x g à 4 °C.
    9. Transférer soigneusement le surnageant dans des tubes centrifugeux neufs et propres de 1,5 mL et utiliser immédiatement l’échantillon de plasma ou le conserver à 4 °C pendant quelques heures.
    10. Diluer le surnageant avec un volume égal de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et bien mélanger.
      REMARQUE: Le protocole fourni ci-dessus pour recueillir le plasma est fatal. Le sang peut également être recueilli par ponction veineusesous-clavière 11 sans sacrifier la souris.
  2. Préparez les échantillons d’os maxillaire en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Isolez l’os maxillaire avec une pince à épiler et des ciseaux ophtalmiques et lavez-les avec du PBS pour vous débarrasser des tissus mous avec une pince à épiler.
    2. Mettez l’os maxillaire dans des tubes centrifugés de 1,5 ml et coupez l’os en petits morceaux (la taille doit être inférieure à 1 mm de diamètre) avec des ciseaux. Ajouter une certaine quantité de Liberase (5 μg/mL, voir le tableau des matières) pour couvrir le tissu (habituellement 1 mL pour les échantillons d’os d’une souris âgée de 8 semaines), puis incuber pendant 30 min à 37 °C.
    3. Centrifuger l’échantillon à 800 x g pendant 10 min à 4 °C.
    4. Transférer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette dans des tubes à centrifuger neufs et propres de 1,5 mL.

2. Extraction de véhicules électriques

  1. Centrifuger les échantillons (préparés aux étapes 1.1.10 et 1.2.4) pendant 15 min à 2 500 x g (4 °C) pour éliminer les débris de grosses cellules et les plaquettes restantes.
  2. Transférer délicatement les surnageants dans des tubes à centrifuger neufs et propres de 1,5 mL et la centrifuger pendant 30 minutes à 16 800 x g (4 °C).
    REMARQUE: La vitesse de centrifugation peut être réglée sur plus de 10 000 x g pour extraire les VE12. Plus la vitesse de la centrifugeuse est élevée, plus la quantité de véhicules électriques peut être obtenue. Étant donné que la limite de vitesse de la centrifugeuse que nous avons utilisée est de 16 800 x g (voir le tableau des matériaux), nous avons choisi cette vitesse dans ce protocole.
  3. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles dans chaque tube avec 1 mL de PBS. Centrifuger pendant 30 min à 16 800 x g (4 °C).
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles dans chaque tube avec 50 μL de PBS. Conserver ces échantillons à 4 °C seulement pendant moins de 24 h ou, de préférence, les utiliser immédiatement pour les analyses suivantes (étapes 3 à 5).
    ATTENTION : Le stockage à -80 °C est inacceptable, car cela réduira la concentration des VE et augmentera la taille des particules des VE13, influençant ainsi l’analyse suivante des VE.

3. Identification morphologique des VE

  1. Effectuez une analyse NTA.
    1. Selon la quantité de VE (grossièrement jugée par la taille des pastilles, les particules de plasma de 50 μL sont le minimum), transférer 5-50 μL de remise en suspension (étape 2.4), diluer dans 10 mL de solution tampon (PBS filtré avec un filtre de 0,22 μm) et mélanger suffisamment avec 1 mL de micro pointes de pipetière. Utilisez cette suspension finale pour la mesure des particules.
    2. Utilisez une seringue stérile de 1 mL pour injecter au moins 5 mL d’eau distillée à une vitesse modérée et constante jusqu’à ce que le nombre de particules affichées sur l’interface de détection soit inférieur à cinq.
      REMARQUE: Après injection de 1 mL d’eau distillée à travers tout le canal, le nombre de particules est directement indiqué sur l’interface de détection. Si le nombre est toujours supérieur à cinq, continuez à injecter 1 mL d’eau distillée jusqu’à ce que les critères soient satisfaits.
    3. Reconstituer 1 μL de solution d’étalonnage dans 1 mL d’eau distillée pour générer une solution primaire, puis prendre 100 μL de la solution primaire pour 25 mL d’eau distillée pour préparer une solution mère étalon (1:250 000). Conservez ce réactif fonctionnel à 4 °C pendant 1 semaine.
    4. Calibrer l’instrument NTA avec la solution mère étalon (étape 3.1.3). Injecter 1 à 5 mL de la solution d’étalonnage de travail avec une seringue stérile de 1 mL pour rincer le canal de la machine jusqu’à ce que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection soit compris entre 50 et 400 (de préférence autour de 300). Exécutez le programme d’étalonnage.
    5. Répétez l’étape 3.1.2 pour rincer le canal de la machine avant chaque mesure d’échantillon.
    6. Utiliser une seringue stérile de 1 mL pour injecter au moins 2 mL de solution tampon afin de rincer le canal de la machine à vitesse constante jusqu’à ce que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection soit inférieur à 10.
    7. Injecter 1 mL de l’échantillon EV préparé à l’étape 3.1.1 à une vitesse modérée et constante (la vitesse recommandée est de 0,5-1 mL/s).
      REMARQUE: La concentration optimale de particules fait que le nombre de particules affichées sur l’interface de détection varie de 50 à 400, de préférence autour de 300. Si le nombre de particules est trop élevé, répéter l’étape 3.1.2 pour rincer immédiatement le canal de la machine afin d’éviter la rétention de particules à la paroi du canal et ajuster la concentration de l’échantillon EV à l’étape 3.1.1, puis répéter à partir de l’étape 3.1.5.
    8. Effectuer l’analyse des particules et générer les rapports d’analyse conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    9. Si l’échantillon est précieux, pompez l’échantillon de VE avec la seringue de 1 mL et recueillez-les dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL. Répétez l’étape 2.2 pour extraire les véhicules électriques.
    10. Après avoir détecté tous les échantillons, injecter au moins 2 mL de solution tampon dans le canal de la machine, puis injecter au moins 5 mL d’eau distillée jusqu’à ce que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection soit inférieur à cinq.
    11. Utilisez une seringue stérile de 5 mL pour injecter au moins 10 mL d’air à vitesse constante (la vitesse recommandée est de 1 mL/s) afin d’éliminer l’eau dans le canal.
  2. Effectuer une analyse TEM.
    REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes avec de nouvelles suspensions EV. La grille du microscope électronique revêtu de carbone formvar a deux côtés, le côté de travail étant lumineux dans les grilles centrales. Le volume minimum de plasma pour extraire les VE pour la procédure ci-dessous est de 50 μL.
    1. Mélanger l’échantillon de VE (étape 2.4) avec un volume égal de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Déposer 4 μL des VE sur une grille et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT).
    2. Mettez quatre gouttes de PBS (une goutte équivaut à 50 μL) sur une feuille de film de polyéthylène (voir le tableau des matériaux). Transférez les grilles avec une pince microscopique propre et lavez le côté fonctionnel de la grille dans PBS d’une goutte à l’autre.
    3. Utilisez des papiers filtres pour enlever le PBS supplémentaire qui est resté dans les grilles.
    4. Incuber le côté fonctionnel de la grille dans de l’acide phosphotungstique à 1 % (voir le tableau des matières) pendant 2 minutes, puis répéter l’étape 3.2.2.
      ATTENTION: Puisque l’acide phosphotungstique est toxique, cette procédure doit être utilisée dans la hotte, et l’acide phosphotungstique redondant doit être spécifiquement recyclé plutôt que jeté directement.
    5. Placez les grilles face vers le haut dans un plat de 10 cm recouvert de papiers filtres. Les grilles peuvent être stockées chez RT pendant plusieurs années.
    6. Observez les grilles au microscope électronique en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE: Pour s’assurer que les particules individuelles sont observées, la concentration des VE doit être ajustée et la suspension doit être claire sans turbidité évidente. Avant de tomber, l’échantillon doit être bien mélangé. Les analyses représentatives de la TEM et de la NTA sont présentées à la figure 2.

4. Analyse de l’origine des véhicules électriques

REMARQUE: L’identification de l’origine cellulaire des VE nécessite l’application d’anticorps pour les marqueurs membranaires cellulaires typiques. Le volume plasmatique minimum pour extraire les VE pour la procédure ci-dessous est de 300 μL. Sur la base des structures bicouches lipidiques des VE, un colorant membranaire peut être utilisé pour les marquer. Pour les échantillons de plasma sanguin, CD18 pour les lymphocytes14 est choisi pour la représentation. Pour les échantillons d’os maxillaire, le récepteur associé aux ostéoclastes (OSCAR) pour les ostéoclastes15 est choisi à titre d’exemple. Avant le FC, assurez-vous que le cytomètre en flux est adapté à la mesure des VE16, car la limite inférieure de taille est très différente entre les cytomètres de flux distincts.

  1. Resuspendre les échantillons (étape 2.4) avec 500 μL de PBS et transférer 50 μL dans un tube à centrifuger neuf et propre de 1,5 mL comme témoin blanc (tube A) et un autre 50 μL dans un nouveau tube à centrifuger propre de 1,5 mL comme simple tube de coloration pour FITC (tube B). Ajouter 0,5 μL de colorant membranaire au tube primaire pour la coloration de la membrane. Incuber pendant 5 min à TA.
  2. Centrifuger le tube primaire pendant 30 min à 16 800 x g (4 °C). Jeter le surnageant et remettre les pastilles en suspension avec 200 μL de PBS.
  3. Diviser chaque échantillon de 50 μL en quatre tubes centrifugeuses de 1,5 mL pour les tubes de coloration simples pour l’EP (tube C), la coloration des marqueurs de surface (tube D) et les témoins d’anticorps secondaires seulement (tube E).
  4. Ajouter l’anticorps primaire d’OSCAR dans les échantillons d’EV osseuse ainsi que l’anticorps CD18 dans les échantillons plasmatiques de VE (voir le tableau des matériaux) dans le tube B (étape 4.1) et le tube D (étape 4.3) séparément (dilué à 1:100). Incuber pendant 1 h à 4 °C.
  5. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 16 800 x g (4 °C). Jeter le surnageant, remettre les pastilles en suspension avec 500 μL de PBS, puis centrifuger à nouveau pendant 30 minutes à 16 800 x g (4 °C) pour éliminer les anticorps primaires supplémentaires.
  6. Jeter le surnageant et remettre les pastilles en suspension avec 50 μL de PBS, puis ajouter des anticorps secondaires conjugués FITC (voir le tableau des matériaux), respectivement (dilué à 1:200) (tube E). Ajouter les mêmes anticorps secondaires au tube B (étape 4.1) et au tube D (étape 4.3). Incuber tous les tubes pendant 1 h, à 4 °C dans l’obscurité.
    REMARQUE: Les anticorps de marquage conjugués à fluorescence directe peuvent également être utilisés pour traiter la détection de FC avec des contrôles d’isotype appropriés.
  7. Diluer une goutte de suspension de billes de 0,2, 0,5 et 1 μm (voir le tableau des matériaux) respectivement dans 1 mL de PBS, et faire passer d’abord chaque taille de billes pour s’assurer de la barrière choisie pour les véhicules électriques. Réglez le seuil du cytomètre en flux pour rechercher les billes et la population EV en utilisant une diffusion vers l’avant (FSC) et une diffusion latérale (SSC) appropriées.
    1. Définissez l’état terminal sur le calcul de 100 000 particules teintées à la membrane. Analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 3.
      REMARQUE: L’équipement NTA avec canaux de fluorescence peut également être utilisé pour l’analyse d’origine, et la préparation de l’échantillon est la même que FC.

5. Analyse de la teneur en protéines des VE

REMARQUE: L’analyse de la teneur en protéines dans les VE est effectuée par transfert Western. Par exemple, les VE plasmatiques et osseux ont été sélectionnés pour analyser l’état métabolique de la 6-phosphogluconate déshydrogénase (DPI) et de la pyruvate kinase M2 (PKM2). Golgin84 (l’organite de Golgi) a été utilisé comme témoin négatif, et la flottilline (protéine membranaire), la caveolin (protéine intégrale des cavéoles) et la β-actine (le cytosquelette)17 ont été utilisées comme témoin positif dans les VE par rapport aux échantillons cellulaires. La mitofilline et la α-actinine-4 ont été choisies comme grands marqueurs EV, tandis que CD9 et CD81 ont été choisis comme petits marqueurs EV pour illustrer les sous-populations EV18. Apoa1 a été sélectionné comme marqueur de lipoparticules plasmatiques19. Pour les détails respectifs sur les réactifs, voir le tableau des matériaux.

  1. Remettez les pastilles en suspension (étape 2.4) dans 50 μL de tampon de lyse RIPA et incuber pendant 30 min sur glace.
  2. Quantifier les concentrations de protéines de tous les échantillons de la microplaque à 96 puits au moyen du dosage des protéines BCA en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    1. Diluer les 2 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) avec 0,9 % de solution saline normale (NS) (contenant 0,9 % (p/v) de chlorure de sodium) dans 0,5 mg/mL. Ajouter les 0,5 mg/mL de BSA et 0,9 % de NS dans trois puits dupliqués avec certains volumes, comme le montre le tableau 1.
    2. Déposer 2 μL des échantillons (étape 5.1) et ajouter 18 μL de NS dans trois puits dupliqués séparément.
    3. Préparer une solution de travail en mélangeant le réactif BCA A avec le réactif B (50:1 Réactif A:B). Ajouter 200 μL de la solution de travail dans chaque puits et agiter doucement pendant 30 s.
    4. Incuber la microplaque de 96 puits pendant 20-25 min à 37 °C.
    5. Mesurer la DO à 596 nm à l’aide du spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux).
    6. Exportez les données.
    7. Tracez une courbe standard et calculez la concentration en protéines des échantillons.
  3. Selon les résultats, diluer les échantillons à 1 μg/μL avec 0,9% de NS et 5x tampon de chargement SDS-PAGE (250 mM Tris· HCl, pH 6,8, 10 % SDS, 30 % (v/v) glycérol, 10 mM de DTT, 0,05 % (p/v) de bleu de bromophénol, voir le tableau des matières). Sceller hermétiquement les tubes avec un film et chauffer pendant 5 min à 100 °C.
  4. Charger les échantillons et l’échelle protéique dans un gradient de concentration de 4% à 20% Hepes-Tris gel (voir Tableau des matériaux).
    NOTE: Choisissez le pourcentage de gel en fonction du poids moléculaire des protéines d’intérêt.
  5. Faites passer le gel dans le tampon courant à 80 V jusqu’à ce que les protéines forment une ligne, puis passez à 120 V pendant 1 h jusqu’à ce que le colorant de chargement soit au fond du gel.
    NOTE: La durée de fonctionnement peut varier en fonction de l’équipement utilisé ou du type et de la concentration du gel.
  6. Transférer le gel sur la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (voir le tableau des matières), pré-incubé dans de l’alcool méthylique pendant 20 s. Utilisez un système de transfert humide pour transférer pendant 1 h à 200 mA.
    ATTENTION : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulle à l’intérieur du système de transfert et gardez la membrane PVDF humide.
    NOTE: Le temps de transfert peut varier en fonction du poids moléculaire de la protéine cible; 1 KD a généralement besoin de 1 min.
  7. Préparer un tampon bloquant le BSA à 5 % en ajoutant 2,5 g de BSA (voir le tableau des matières) dans 50 mL de solution saline tamponnée Tris (TBST) (2 mL de Tween ajoutés dans 2 L de solution PBS) dans un tube centrifuge de 50 mL. Agiter jusqu’à dissolution de la poudre. Bloquer les membranes dans ce tampon pendant 2 h à TA avec agitation.
  8. Incuber les membranes avec des anticorps primaires spécifiques dilués avec TBST à une concentration appropriée (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000 ; Golgin84, 1:1000; Flottilline-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; DPI, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actine, 1:3000) pendant une nuit à 4 °C.
  9. Laver les membranes dans le tampon de lavage (2 mL de Tween ajoutés dans 2 L de solution PBS) quatre fois (15 min à chaque fois), et incuber les membranes avec les anticorps secondaires appropriés à 1:4000 pendant 1 h à TA avec agitation.
  10. Lavez les membranes dans le tampon de lavage quatre fois (15 minutes à chaque fois) et imagez les membranes à l’aide du kit de chimiluminescence et d’un système d’imagerie sur gel (voir le tableau des matériaux).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selon le flux de travail expérimental, les VE peuvent être extraits du sang périphérique et des tissus solides (Figure 1). L’os maxillaire d’une souris âgée de 8 semaines est d’environ 0,1 ± 0,05 g, et environ 300 μL de plasma peuvent être prélevés sur la souris. En suivant les étapes du protocole, 0,3 mg et 3 μg de VE peuvent être collectés, respectivement. Comme analysé par TEM et NTA, les caractéristiques morphologiques typiques des VE sont des vésicules membranaires rondes en forme de co...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lors de l’étude des caractéristiques, du devenir et de la fonction des véhicules électriques, il est crucial d’isoler les véhicules électriques à haut rendement et à faible contamination. Diverses méthodes existent pour extraire les VE, telles que la centrifugation par gradient de densité (DGC), la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et les tests d’immunocapture 4,20. Ici, l’une des méthodes les plus couramment utilisées, la centrifugation différentielle,...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000974, 81870796, 82170988 et 81930025) et de la China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 et BX20190380). Nous sommes reconnaissants de l’aide du Centre national expérimental de démonstration de l’enseignement de la médecine de base (AMFU).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % de paraformaldéhyde  ;Biosharp143174Microscope électronique à transmission
Alexa fluor 488 Anticorps secondaire anti-chèvreYeason34306ES60Cytométrie en flux
Alexa fluor 488 Anticorps secondaire anti-lapinInvitrogenA11008Cytométrie
en flux Anticorps anti-CD18Abcamab131044Cytométrie en flux
Anticorps anti-CD81Abcamab109201Western blot
Anticorps anti-CD9HuabioET1601-9Western blot
Anticorps anti-mitoflineAbcamab110329Western blot
APOA1 Rabbit pAbAbAbcloneA14211Western blot
BCA protein assay kitTIANGENPA115Western blot
BLUeye Prestained Protein LadderSigma-Aldrich94964-500ULWestern blot
Albumine sérique bovineMP Biomedical218072801Western blot
Anticorps anti-cavéoline-1Santa Cruz Biotechnologysc-53564Western blot
CellMask Coloration de membrane de plasma orangeInvitrogenC10045Cytométrie en flux
ChimiluminescenceAmersham BiosciencesN/Ablot
Ciseaux opératoires incurvésJZ Instrument chirurgicalJ21040EV
Isolation Balance électroniqueZhi KeZK-DSTEV
Spectrophotomètre EpochBioTekN/AWestern blot
Tubes EppendorfEppendorf3810XEV
isolation Flotillin-1 anticorpsPTM BIOPTM-5369Western blot
Système d’imagerie sur gelTanon4600Western blot
Golgin84Novusnbp1-83352
Western blot Grids - Formvar/Carbon Coated - Cuivre 200 meshPolysciences24915Microscope électronique à transmission
Heparine SolutionStemCell  ;7980Isolement EV
Liberase Research GradeSigma-Aldrich5401127001EV isolement
Pince à épiler microscopiqueJZ Instrument chirurgicalJD1020Isolement EV
Cytomètre en flux NovoCyteACEAN/ACytométrie en flux
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20 %, 10 puitsEpizymeLK206Western blot
OSCAR( D-19)Santa Cruz BiotechnologySC-34235Cytométrie en flux
PBS (2x)ZHHCPW013Western blot
Pentobarbital sodiqueSigma-Aldrich57-33-0Anesthésie
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jacson115-035-003blot
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jacson111-035-003Transfert Western
Acide phosphotungstiqueRHAWN12501-23-4Microscope électronique à transmission
PKM2(d78a4) xp rabbit  ; mab  ;Signalisation cellulaire4053tWestern blot
Film de polyéthylène (PE)Xiang yi200150055Microscope électronique à transmission
Membranes de fluorure de polyvinylidène  ;Roche3010040001Western blot
Inhibiteurs de protéaseRoche4693132001Western blot
Anticorps recombinant anti-DPIAbcamab129199Western blot
Tampon de lyse RIPABeyotimeP0013Western blot
SDS-PAGE tampon de chargement (5x)CwbioCW0027SWestern blot
Taille billesInvitrogenF13839Cytométrie en flux
Microcentrifugeuses de table à grande vitesseHitachiCT15EEV Isolation
Microscope électronique à transmissionHITACHIH-7650Microscope électronique à transmission
Tween-20MP Biomedicals19472Mélangeur vortex Western blot
GenieScientific IndustriesSI0425EV isolation
ZetaView BASIC NTA - Suivi des nanoparticules Microscope vidéo PMX-120Particle MetrixN/AAnalyse du suivi des nanoparticules
&alpha ;-actinine-4 Rabbit mAbcloneA3379Western blot
&beta ;-actinCwbioCW0096MWestern blot
Western Western

Références

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Isolation des VEcentrifugation diff rentielleVE plasmatiquesVE tissulairesprofilage des antig nes de surfacecytom trie en fluxanalyse de la cargaison prot iqueWestern Blotsuivi des nanoparticules

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