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Article de méthode

Entraînement en résistance ajusté en fonction de la posologie chez les souris présentant un risque réduit de lésions musculaires

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DOI :

10.3791/64000

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31 août 2022

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1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une technique unique appelée entraînement en résistance ajustée à la dose (DART), qui peut être incorporée dans des études de réadaptation de précision effectuées sur de petits animaux, tels que des souris.

Résumé

L’entraînement progressif en résistance (PRT), qui consiste à effectuer des contractions musculaires contre des charges externes progressivement plus importantes, peut augmenter la masse musculaire et la force chez les individus en bonne santé et dans les populations de patients. Il existe un besoin d’outils de réadaptation de précision pour tester l’innocuité et l’efficacité de la PRT afin de maintenir et/ou de restaurer la masse musculaire et la force dans les études précliniques sur des modèles animaux de petite et de grande taille. La méthodologie et le dispositif PRT décrits dans cet article peuvent être utilisés pour effectuer un entraînement de résistance ajusté à la posologie (DART). Le dispositif DART peut être utilisé comme dynamomètre autonome pour évaluer objectivement le couple contractile concentrique généré par les fléchisseurs dorsoles de la cheville chez la souris ou peut être ajouté à un système de dynamométrie isocinétique préexistant. Le dispositif DART peut être fabriqué avec une imprimante 3D standard basée sur les instructions et les fichiers d’impression 3D open source fournis dans ce travail. L’article décrit également le flux de travail d’une étude visant à comparer les lésions musculaires induites par la contraction causées par un seul épisode d’EICC aux lésions musculaires causées par un épisode comparable de contractions isométriques (OMA) dans un modèle murin de dystrophie musculaire de type 2B / R2 (souris BLAJ). Les données de huit souris BLAJ (quatre animaux pour chaque condition) suggèrent que moins de 10% du muscle antérieur du tibial (TA) a été endommagé par un seul épisode de DART ou d’ISOM, le DART étant moins dommageable que l’ISOM.

Introduction

L’exercice confère de nombreux avantages pour la santé des muscles squelettiques (examinés dans Vina et al.1). Plus précisément, l’entraînement progressif en résistance (PRT), qui consiste à effectuer des contractions musculaires contre des charges externes progressivement plus importantes (p. ex. haltères, haltères, circuits câble-poulie-poids), est connu pour aider à augmenter la masse musculaire et la force chez les personnes en bonne santé et les populations de patients (revue dans des publications antérieures 2,3 ). La PRT est basée sur le principe de surcharge, selon lequel, lorsque le muscle se contracte contre des charges externes de plus en plus importantes, il s’adapte en augmentant sa section transversale physiologique ainsi que sa capacité de production de force4. Les modèles existants de PRT chez les rongeurs comprennent l’escalade d’échelle avec résistance appliquée à la queue, la co-contraction des muscles agonistes contre la résistance des antagonistes, la course avec un harnais lesté, un exercice accroupi provoqué par un choc électrique et la résistance à la marche des roues 5,6,7,8,9,10 (revue dans des publications antérieures 11,12 ). Cependant, il n’existe actuellement aucun outil de recherche permettant d’effectuer une PRT ciblée avec précision et ajustée en fonction de la posologie chez la souris qui ressemble étroitement aux méthodes et dispositifs PRT utilisés dans la recherche et la pratique cliniques humaines12,13. Cela limite la capacité des chercheurs à étudier l’innocuité et l’efficacité de la PRT à dose précise dans les études fondamentales et précliniques chez la souris.

Pour surmonter cet obstacle, une méthodologie et un dispositif PRT sont développés dans cette étude sur la base des conceptions de circuits câble-poulie utilisées dans les équipements d’entraînement en résistance dans les gymnases modernes14,15,16. Cette méthode de PRT est appelée entraînement de résistance ajusté à la dose (DART), et le dispositif est appelé dispositif DART. En plus de sa fonctionnalité en tant qu’outil d’entraînement de réadaptation de précision, le dispositif DART peut également être utilisé comme instrument autonome pour évaluer objectivement le couple contractile concentrique maximal qui peut être généré par le muscle tibial antérieur (TA) chez une souris, de la même manière que le maximum d’une répétition (1RM, la charge maximale qui peut être soulevée / déplacée / pressée / accroupie avec succès une seule fois tout en maintenant une bonne forme) est évaluée chez l’homme17, 18. Le dispositif DART peut également être couplé à un dynamomètre isocinétique fabriqué sur mesure ou commercial pour mesurer la force tétanique isométrique maximale produite par le muscle TA chez une souris (comparable à la contraction volontaire maximale [MVC] chez l’homme), puis effectuer une PRT ajustée à la dose avec une résistance basée sur la force tétanique maximale (p. ex., 50 % de la force de crête).

Cet article décrit la construction du dispositif DART et explique comment il peut être couplé à un dynamomètre sur mesure, qui a été décrit dans les publications antérieures 19,20,21,22, pour évaluer le couple contractile et effectuer l’EICC. L’étude décrit également comment le dispositif DART a été utilisé pour comparer les dommages musculaires induits par l’exercice causés par un seul épisode de DART (4 séries de 10 contractions concentriquement biaisées avec 50% 1RM) aux dommages causés par un épisode comparable de contractions isométriques (4 séries de 10 contractions isométriques) dans un modèle murin de dystrophie musculaire de type 2B (LGMD2B, ou LGMDR2)23,24. Le modèle murin étudié manque d’une protéine appelée dysferline, qui joue un rôle important dans la protection du muscle squelettique contre les lésions musculaires d’apparition retardée à la suite de contractions excentriques nuisibles 22,25,26,27,28,29,30 . Il a également été démontré chez des souris mâles déficientes en dysferline que l’exercice forcé concentré n’est pas aussi dommageable que l’exercice forcé excentrique et que l’exposition antérieure à un entraînement concentriquement biaisé offre une protection contre les blessures résultant d’un épisode ultérieur de contractions excentriquementbiaisées 22. Étant donné que la présente étude a été menée pour tester la faisabilité de la méthodologie et du dispositif DART actuels pour effectuer un entraînement de résistance à dosage ajusté et biaisé concentriquement, des souris mâles déficientes en dysferline ont été choisies pour l’étude afin de comparer les nouvelles données du dispositif DART avec les données précédentes. Dans les études futures, des souris BLAJ femelles seront incluses pour étudier l’effet du sexe en tant que variable biologique par rapport à la réponse à l’EICC. Les souris âgées de ~ 1,5 an ont été étudiées car elles présentent déjà des changements dystrophiques dans de nombreux groupes musculaires et, par conséquent, modélisent l’état physiopathologique dans lequel les muscles pourraient être chez les patients qui ont déjà une faiblesse musculaire et une atrophie musculaire et qui recherchent des soins de réadaptation pour maintenir la masse musculaire et la force26.

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Protocole

Les expériences décrites dans cet article ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Wayne State University, Detroit, Michigan, États-Unis, conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (1996, publié par National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, États-Unis). B6. Des souris A-Dysfprmd/GeneJ (alias souris BLAJ, mâles, ~1,5 ans) qui modélisent LGMD2B/R2 ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Plan d’étude

  1. Choisissez la ou les souches de souris pertinentes pour la ou les questions de recherche — p. ex., étude B6. Souris A-Dysfprmd / GeneJ (souris BLAJ) si vous essayez de répondre à la question de savoir si oui ou non DART concentriquement biaisé induit des lésions musculaires généralisées chez les souris qui modélisent LGMD2B / R2.
  2. Assigner les souris aux groupes d’étude en fonction du plan d’étude - p. ex., assigner au hasard les souris à un groupe d’entraînement en résistance ajustée à la dose (EICC) ou à un groupe d’entraînement isométrique (ISOM), et tenter d’équilibrer les groupes le mieux possible en fonction de l’appariement par portée et/ou âge (p. ex., tableau 1).

2. Fabrication de l’appareil DART

  1. Concevez les composants de l’appareil DART à l’aide d’un logiciel d’assistance par ordinateur (CAO) approprié (Figure 1) en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Boîtier de conception pour roulement de roue à faible frottement (voir le tableau des matériaux, basé sur la conception du roulement de bloc d’oreiller) avec rapporteur intégré (à utiliser comme goniomètre pour mesurer les angles des articulations de la cheville).
    2. Concevez une tour pour le palier de roue et un rapporteur.
    3. Concevez une plaque de pied pour positionner le pied de la souris. Concevez un essieu pour relier le repose-pieds au roulement de roue.
  2. Fabriquez les composants du dispositif DART avec une imprimante 3D appropriée (Figure 1).
    1. Enregistrez les conceptions créées avec un logiciel de CAO en stéréolithographie (. STL) fichiers.
      REMARQUE : le fichier . Les fichiers STL (Supplementary Coding Files 1-4) peuvent être utilisés et modifiés en créditant l’auteur correspondant de cet article et en citant cet article.
    2. Ouvrez le fichier . STL avec un logiciel de tranchage approprié (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE: Le logiciel de découpage convertit un modèle 3D virtuel en une pile de tranches, qui peuvent être imprimées séquentiellement par une imprimante 3D pour générer un objet 3D.
    3. Avec un logiciel de tranchage, générez la fabrication assistée par ordinateur G-CODE (CAM, . GCODE), qui sont spécifiques à l’imprimante 3D et au filament qui sera utilisé.
    4. Suivez le manuel de l’imprimante 3D (voir Tableau des matériaux) pour imprimer les composants du périphérique DART avec . GCODE.
    5. Choisissez un filament d’imprimante 3D approprié, tel que l’acide polylactique (PLA) 1,75 mm 1 kg/bobine, Gris (voir Tableau des matériaux).
  3. Assemblez le dispositif DART en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Insérez un roulement de roue 608 à faible frottement (diamètre de l’alésage de 8 mm, diamètre extérieur de 22 mm, tel qu’un roulement avec billes en céramique en nitrure de silicium logées en acier inoxydable 420, voir le tableau des matériaux) dans le carter de roulement de roue (Figure 1).
    2. Insérez l’essieu dans l’alésage du roulement de roue (Figure 1).
    3. Collez le repose-pieds sur l’essieu avec de la colle (voir le tableau des matériaux) qui convient pour coller le PLA (Figure 1).
    4. Placez le palier de roulement de roue au-dessus de la tour de palier de roue et fixez l’ensemble à une base en acrylique avec des fixations à vis (Figure 1).
      REMARQUE: Il n’y a pas d’exigences de taille spécifiques pour la base en acrylique - elle doit juste être assez grande pour accueillir l’animal et l’appareil DART et assez petite pour tenir sur une surface de travail. La base acrylique utilisée pour la présente étude mesure environ 30 cm de large, 45 cm de long et 0,5 cm d’épaisseur.

3. Préparation des souris pour DART ou ISOM

  1. Placer chaque souris sous anesthésie générale avec de l’isoflurane inhalé administré par un système d’anesthésie approprié (voir le tableau des matériaux, 2% -5% pour l’induction; 1%-4% pour l’entretien; à effet) pour réduire le stress et la douleur.
    1. Induire une anesthésie dans la chambre d’induction du système d’anesthésie (2% -5% isoflurane).
    2. Transférer la souris dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie tout en effectuant des procédures sur l’animal (1% -4% isoflurane). Confirmer l’efficacité de l’anesthésie en fonction de l’absence de retrait des membres postérieurs à une pincée d’orteil d’une paire de pincettes.
    3. Fournir un soutien thermique – p. ex., avec un coussin chauffant en gel isotherme et une lampe chauffante placée à ~1 m au-dessus de la souris. Vérifiez avec un thermomètre que la température sur et autour de la base acrylique est maintenue à ~38 °C, afin que la souris ne surchauffe pas.
  2. Préparez la peau sur le muscle antérieur du tibial gauche (TA) de la souris et sur tous les aspects antérieurs et latéraux du membre postérieur gauche pour l’DART ou l’ISOM.
    1. Enlevez la fourrure de la souris avec une crème dépilatoire (crème dépilatoire, voir Tableau des matières). Appliquez la crème dépilatoire et laissez-la agir pendant ~2 min.
    2. Nettoyez la jambe avec des lingettes imbibées d’eau distillée pour enlever la fourrure et toute la crème résiduelle de la peau. Les crèmes dépilatoires peuvent irriter et / ou endommager la peau si elles sont laissées sur la peau de la souris pendant de longues périodes et, par conséquent, éliminer complètement.
    3. Après l’enlèvement de la fourrure, désinfectez la peau avec une méthode de lavage approuvée, comme avec une solution de gommage povidone iodée et 70% d’éthanol.
  3. Appliquez un protecteur (p. ex. vaseline) sur les yeux et la peau épilée avec un coton-tige propre pour protéger les yeux et la peau épilée du dessèchement.
  4. Placez une épingle stabilisatrice à travers la métaphyse tibiale.
    1. Appliquez 5% de crème de lidocaïne sur le tibia pour engourdir la zone.
    2. Passez une aiguille hypodermique stérile de 26 G, d’un demi-pouce, dans la partie la plus large de la partie proximale de l’os tibial (c.-à-d. la métaphyse tibiale, également connue sous le nom de tête tibiale). Une fois la goupille stabilisatrice fixée, retirez la partie en plastique de l’aiguille hypodermique en tenant l’aiguille avec un hémostatique stérile et en pliant la partie en plastique jusqu’à ce qu’elle se détache.
  5. Positionnez la souris pour la formation DART ou OMI.
    1. Posez la souris en décubitus dorsal. Assurez-vous que la souris est toujours bien connectée au cône nasal pour maintenir l’anesthésie.
    2. À l’aide d’une paire de pinces à épiler stériles, introduisez la goupille tibiale dans une pince crocodile en métal (voir le tableau des matériaux), de sorte que les extrémités de la goupille tibiale soient maintenues par la pince crocoditaire. Déplacez le bras réglable de la pince crocodile pour vous assurer que le pied de la souris est placé sur la plaque de pied du dispositif DART.
    3. Attachez le pied de souris sur la plaque de pied de l’appareil DART avec du ruban adhésif de laboratoire.
    4. Placez le pied de la souris à un angle de 90° par rapport au long axe de l’os tibial de la souris. Si elle est placée correctement, la plaque de pied sera perpendiculaire à la base en acrylique (c.-à-d. le plancher ou ce qui est considéré comme le plan horizontal).
    5. Posez la plaque plantaire sur la butée de flexion plantaire créée en plaçant une aiguille hypodermique de 18 G, 1,5 po de long à travers les trous prépercés du rapporteur du dispositif DART (Figure 1).

4. Formation DART ou ISOM

  1. Optimisez le placement de l’électrode en plaçant une électrode bipolaire, transcutanée et neuromusculaire de stimulation électrique (NMES, voir le tableau des matériaux) sur la face inférolatérale de l’articulation du genou de la souris (Figure 1B).
    1. Avec des impulsions uniques (1 Hz) provenant d’un stimulateur électrique de laboratoire (voir le tableau des matériaux), stimuler la branche fibulaire du nerf sciatique, qui fournit une innervation motrice aux muscles fléchisseurs de la cheville (Figure 1B).
    2. Étant donné que le muscle tibial antérieur (TA) représente plus de 90% de la force contractile totale produite par les muscles fléchisseurs dorso-dorsaux de la cheville31, observez le ventre et le tendon du muscle TA pour détecter des signes de contractions de contraction provoquées électriquement.
      REMARQUE: Une légère proéminence osseuse qui correspond à l’os du péroné peut aider à placer l’électrode si le testeur peut le sentir à travers l’électrode. Cela nécessite un peu de pratique et d’apprentissage de la part du testeur pour avoir une idée du placement optimal des électrodes.
    3. Déplacez la butée de flexion plantaire vers le trou du rapporteur qui correspond à 20° de flexion plantaire de la position où le pied est orthogonal (90°) au tibia — c’est la position à laquelle le couple contractile maximal du muscle TA est généralement observé sur la base des rapports précédents21. Cela peut devoir être personnalisé par l’utilisateur en fonction de facteurs spécifiques aux souris étudiées.
    4. Visualisez le couple de contraction à l’aide d’un banc à souris en reliant la plaque plantaire du dispositif DART à la plaque de pied du dynamomètre — p. ex., reliez la plaque de pied du dispositif DART à une plaque de pied robotisée du banc dynamométrique de cheville construite sur mesure avec une suture en soie non élastique (semblable à la figure 1A) et attachez la suture à la plaque de pied du dynamomètre (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE: La plaque de pied a des trous intégrés dans la conception d’impression 3D. En plaçant la suture à travers la paire de trous qui se trouvent dans la deuxième rangée à partir de l’extrémité du pied de la plaque plantaire, la suture se trouve à ~20 mm de l’axe dorsiflexion/flexion plantaire (Figure 1A, B). Le banc dynamométrique a été décrit dans les rapports précédents 19,20,21,22.
  2. Optimisez la tension de sortie du stimulateur NMES.
    1. Après avoir optimisé le placement de l’électrode, optimisez l’amplitude de la tension de sortie du stimulateur électrique - cela est nécessaire pour confiner NMES au nerf fibulaire commun et au muscle TA et réduire le risque de provoquer des co-contractions chez les plantarflexors.
      REMARQUE: Si des co-contractions sont obtenues, elles peuvent être visualisées à travers le couple de sortie du dynamomètre et également être vues dans la flexion plantaire des orteils.
  3. Réglez le stimulateur NMES pour l’entraînement DART ou OMI.
    REMARQUE: Les paramètres suivants peuvent devoir être personnalisés par l’utilisateur en fonction de facteurs spécifiques aux souris étudiées et au but des études.
    1. Réglez le stimulateur pour produire des trains d’impulsions répétés de fréquence de 125 Hz - cette fréquence produit des contractions tétaniques fusionnées maximales sans débordement de NMES dans d’autres groupes musculaires chez les souris BLAJ21. Pour ce faire, réglez les cadrans en fonction de la fréquence d’impulsion (125 Hz), de la durée du train (500 ms) et des trains par seconde (1 train/s) et en activant l’interrupteur à bascule pour les trains d’impulsions répétitifs.
    2. Réglez le stimulateur pour produire des trains d’impulsions d’une durée de 500 ms entrecoupés de 500 ms de repos entre les trains d’impulsions.
    3. Déplacer la butée de flexion plantaire vers le trou du rapporteur qui correspond à 160° par rapport à l’axe long du tibia (flexion plantaire de 70° du pied orthogonale au tibia). C’est la position dans laquelle le pied de la souris BLAJ peut être déplacé passivement sans résistance des tissus mous21.
    4. Pour l’EICC, appliquer une résistance appropriée contre laquelle le muscle TA doit travailler concentriquement — p. ex. 5 g comme illustré à la figure 1A, B; voir la courbe d’étalonnage poids/couple dans le dossier supplémentaire 1.
    5. Appliquez une résistance en suspendant le poids à l’aide d’une suture en soie non élastique attachée au repose-pieds du dispositif DART (Figure 1A, B).
    6. Ajustez la résistance - c’est-à-dire appliquez ~50% du maximum d’une répétition (1RM) (par exemple, 5 g si la souris peut soulever un poids maximum de 10 g avec une seule contraction), ce qui tire le pied à travers au moins la moitié de la plage active disponible de dorsiflexion.
    7. Effectuer un entraînement DART approprié chez des souris assignées au groupe DART – p. ex., effectuer un seul entraînement DART, qui implique quatre séries de 10 répétitions de contractions concentriques avec 2 minutes de repos entre les séries, semblables aux programmes d’entraînement en résistance progressive utilisés chez les humains32 (voir la vidéo supplémentaire 1).
    8. Effectuer une formation ISOM appropriée chez les souris assignées au groupe ISOM – p. ex., effectuer une seule période d’entraînement ISOM, qui implique quatre séries de 10 répétitions de contractions isométriques avec 2 minutes de repos entre les séries, semblable à l’EICC (voir la vidéo supplémentaire 2).
    9. Pour l’entraînement ISOM, placez le pied de la souris à 160° par rapport à l’axe long du tibia (flexion plantaire de 70° du pied orthogonal au tibia) et maintenez cette position statique en collant la suture de soie à la plaque plantaire du banc robotisé.
      REMARQUE: Comme la suture ne peut pas glisser, la plaque plantaire du dispositif DART ne peut pas se déplacer en dorsiflexion, contraignant ainsi les dorsiflexeurs à se contracter isométriquement.

5. Soins post-opératoires pour les souris

  1. Prenez des précautions pour maintenir une bonne hygiène du membre postérieur exercé et réduire la douleur au site de l’aiguille.
    1. Après l’entraînement DART ou OMI, enduisez la partie visible de la broche tibiale avec une pommade antibiotique triple (400 U/g de bacitracine, 3,5 mg/g de néomycine et 5000 U/g de polymixine-B, voir le tableau des matériaux), puis retirez soigneusement la broche du côté médial du tibia. Rincer la peau sur la cuisse latérale et le haut de la jambe avec de la povidone iodée et de l’eau stérile. Appliquer 5% de crème de lidocaïne sur le tibia pour contrôler la douleur au site de l’aiguille.
  2. Laissez les souris se remettre de l’anesthésie.
    1. Retirez la souris du cône nasal et laissez-la récupérer de l’anesthésie dans une cage de récupération exempte de litière. Fournir un soutien thermique à la souris pendant qu’elle se remet de l’anesthésie, par exemple avec un coussin chauffant en gel isotherme.
  3. Remettez la souris dans sa cage d’origine après qu’elle se soit complètement remise de l’anesthésie. Ensuite, retournez la cage à l’animalerie, où les souris d’étude sont hébergées jusqu’à ce que des expériences de suivi soient effectuées. Surveillez les souris quotidiennement.

6. Prélèvement de tissus

  1. Récoltez le muscle TA de souris dans son intégralité et congelez pour la cryoconservation en suivant les étapes ci-dessous.
    1. En fonction de la ou des questions de recherche, à un moment approprié après l’entraînement (p. ex., 3 jours après l’EICC ou l’ISOM), euthanasier les souris selon les protocoles approuvés.
      REMARQUE : Pour la présente étude, des souris ont été euthanasiées par luxation cervicale sous anesthésie générale (isoflurane inhalé, 2 % à 5 % à effet). La thoracotomie bilatérale a assuré la mort.
    2. Disséquez les membres postérieurs de la souris pour enlever le muscle TA exercé (à gauche) et le muscle TA non exercé (à droite). Pesez les muscles récoltés. Ensuite, trempez chaque muscle dans de l’huile minérale pour la cryoprotection et placez le muscle sur une lingette de laboratoire propre pour éponger l’excèsd’huile 21.
  2. Placez le muscle sur un morceau de papier d’aluminium. Tenez le bord de la feuille avec un long hémostatique et immergez rapidement la feuille et le muscle dans l’azote liquide contenu dans un récipient en plastique approprié pour geler le muscle.
    1. Après environ 2 minutes d’immersion dans l’azote liquide, transférer le muscle congelé dans des flacons cryogéniques marqués. Conservez les flacons dans un congélateur à −80 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire pour d’autres études.

7. Études histologiques sur le tissu musculaire

  1. Préparer des sections cryostat de muscle TA d’une épaisseur de 5 μm. Recueillir les sections de cryostat sur des lames de microscope chargées. Fixez les sections avec de l’acétone maintenue froide à −30 °C et laissez sécher les sections à l’air.
  2. Colorer les sections de tissu musculaire avec de l’hématoxyline suivie d’éosine (coloration H & E, voir le tableau des matériaux).
    1. Plongez les sections pendant 5 min dans de l’hématoxyline (coloration nucléaire bleu foncé) dans un pot de coloration en verre. Enlevez l’excès d’hématoxyline en rinçant les sections à l’eau du robinet jusqu’à ce qu’on ne voie plus de bleuissement de l’eau.
    2. Immerger les sections pendant 5 min dans un réactif bleuissant dans un bocal en verre. Aspirer l’excès de réactif bleuissant des sections avec une pipette d’aspiration en verre.
    3. Plongez les sections pendant 5 min dans de l’éosine (coloration cytoplasmique rose) dans un pot de coloration en verre. Enlevez l’excès d’éosine en trempant les sections rapidement et à plusieurs reprises (~ 10 fois) dans de l’éthanol à 95% dans un pot de coloration en verre.
    4. Laissez les sections sécher à l’air libre et procédez à la visualisation au microscope optique.
  3. Préparez des images en mosaïque haute résolution de coupes transversales entières de muscle TA grâce à l’imagerie au microscope.
    REMARQUE: L’utilisateur devra peut-être personnaliser les étapes d’imagerie et d’analyse d’image qui suivent en fonction de son microscope et de son logiciel d’acquisition et d’analyse d’images.
    1. Capturez des images numériques avec l’objectif 10x d’un microscope optique et d’un appareil photo numérique monté sur le microscope.
    2. Capturez environ 15 à 20 images, en vous déplaçant le long de la coupe transversale de chaque muscle de manière à une grille, de sorte que chaque nouvelle image chevauche ~25% avec l’image précédente.
      REMARQUE : ce processus permet de capturer un ensemble d’images pouvant être pavées numériquement (également appelé assemblage d’images) pour créer une image composite haute résolution de l’ensemble de la section transversale du muscle TA (Figure 2).
    3. Enregistrez des images numériques dans . Format TIFF.
    4. Ouvrez les images numériques avec un logiciel de traitement et d’analyse d’images approprié (voir le tableau des matériaux).
    5. Mosaïquez ou assemblez des images individuelles en une image composite de l’ensemble du muscle TA en procédant comme suit : avec toutes les images individuelles qui se chevauchent de chaque muscle TA ouvertes dans le logiciel, cliquez sur Fichier > sélectionnez Automatiser > sélectionnez Photomerge > sélectionnez Collage > sélectionnez Ajouter des fichiers ouverts > cliquez sur OK.
    6. Lorsqu’une nouvelle image en mosaïque/cousue du muscle TA est préparée et affichée, enregistrez l’image dans . Format TIFF pour des analyses plus approfondies.
  4. Quantifier les dommages musculaires par analyse visuelle dans les images en mosaïque de l’ensemble du muscle TA avec un logiciel d’analyse d’image approprié.
    1. Dans le logiciel d’analyse d’images, sélectionnez la fonction Mesure dans le menu Analyser pour délimiter et mesurer la surface de l’ensemble de la section transversale du muscle TA (Figure 2).
    2. Dans le logiciel d’analyse d’images, sélectionnez la fonction Mesure dans le menu Analyser pour définir et mesurer les zones de chaque muscle TA qui sont endommagées, c’est-à-dire les zones qui présentent une perturbation cytoplasmique des fibres musculaires, des fibres musculaires absentes et une infiltration de cellules inflammatoires22 (Figure 2).
    3. Exprimez la somme de la surface totale endommagée en pourcentage de la section transversale totale du muscle TA (figure 2, tableau 2).

8. Analyses statistiques

  1. Organiser les données comme le montrent les tableaux 1 à 3 et effectuer des tests T non appariés (si des tests de normalité et de variances homogènes sont réussis)33 ou des tests de somme de rang de Mann-Whitney (si les tests de normalité et de variances homogènes ne sont pas réussis)21 avec un logiciel approprié (voir le tableau des matériaux).

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Résultats

Des souris mâles BLAJ, âgées de ~1,5 an, ont été étudiées. Les souris BLAJ modélisent la maladie musculaire humaine, LGMD2B/R2. Ces souris sont particulièrement sensibles aux lésions musculaires d’apparition retardée lors d’un seul épisode de contractions musculaires excentriques22,29. Les souris BLAJ ont donc été choisies pour ces études afin d’apprendre si l’EICC pouvait être réalisée de manière non préjudiciable en ajustant précisément la résistance contre laq...

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Discussion

Cet article présente des instructions étape par étape sur la façon de construire un appareil pour effectuer un type d’entraînement de réadaptation de précision appelé entraînement de résistance ajusté à la dose (DART). Le travail décrit également l’application du dispositif et de la méthodologie DART dans une étude d’entraînement pour comparer les dommages musculaires 3 jours après un seul épisode de DART (groupe DART) avec les dommages 3 jours après un entraînement isométrique comparable (groupe DART).

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions de la Jain Foundation Inc., R03HD091648 du NICHD, une subvention pilote de AR3T sous NIH P2CHD086843, un prix FRAP de l’EACPHS à Wayne State University, un Faculty Startup Package de Wayne State University et un contrat de sous-traitance de 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) à JAR. Cette étude a également été financée par une subvention de recherche de l’American Physical Therapy Association - Michigan (APTA-MI) à JMB, MEP et JAR. Les auteurs remercient la Dre Renuka Roche (professeure agrégée, Eastern Michigan University, MI) pour avoir lu le manuscrit de manière critique et fourni des commentaires. Les auteurs remercient M. Anselm D. Motha pour ses conseils sur l’impression 3D. Les auteurs remercient les patients atteints de dysferlinopathies qui ont partagé leurs histoires sur le site Web de la Fondation Jain à https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, en particulier leurs expériences avec l’exercice.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AnMiao Star 608 Roulement à billes en céramiqueAnmiao Star (N/A)AMS127Roulement de roue de haute précision à faible frottement.  ; Si la marque et le modèle ne sont pas disponibles dans le commerce, une version alternative d’un roulement de roue 608 à faible frottement, d’un diamètre d’alésage de 8 mm,  ; Un diamètre extérieur de 22 mm, avec des billes en céramique de nitrure de silicium dans un boîtier en acier inoxydable 420 devrait suffire. Un frottement excessif dans le roulement de roue aura un impact négatif sur les performances du dispositif DART et augmentera la résistance globale aux contractions musculaires.
Axio Scope.A1 microscopeCarl Zeiss (Peabody, MA)Produit #Axio Scope.A1Microscope à lumière et à fluorescence
B6. A-Dysfprmd/GeneJ (alias souris BLAJ)Le Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  ; Colonie spéciale maintenue par la Fondation Jain Inc. pour les collaborateurs qui étudient la dysferline.Stock #012767Souris déficientes en dysferline qui modélisent la dystrophie musculaire de type 2B/R2 de la ceinture humaine.
Électrode bipolaire, transcutanée, de stimulation électrique neuromusculaire (NMES)Harvard Apparatus, Holliston, MABS4 50&ndash ; 6824Électrode pour NMES.  ; Si cette électrode n’est pas disponible dans le commerce, veuillez contacter l’auteur correspondant pour obtenir des alternatives.
Coplin Staining DishThermoFisher (Waltham, MA)N° de catalogue S17495Plat/pot de coloration pour hématoxyline et éosine (H& E) coloration des sections
Cura 4.4.1. LogicielUltimaker, Utrecht, Pays-BasUltimaker Cura 4.4.1.Logiciel de découpage pour convertir des fichiers de stéréolithographie en fichiers G-CODE
Coussin chauffant en gel isotherme DeltaphaseBraintree Scientific (Braintree, MA)Article #39DPCoussin chauffant pour fournir un soutien thermique aux animaux sous anesthésie
Eosin YMillipore Sigma (Burlington, MA)HT110132-1LColoration cytoplasmique rose
Gorilla Super GlueThe Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH)Gorilla Super Glue Micro Adhésifcyanoacrylate précis pour coller les composants PLA
Solution d’hématoxyline, Gill No.3Millipore Sigma (Burlington, MA)GHS332-1LColoration bleu foncé pour noyaux
HM525NX cryostatThermoFisher (Waltham, MA)Catalogue #HM525NXCryostat pour faire des sections congelées de
lingettes de laboratoire musculaire.  ; Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Essuie-glaces Kimwipes Delicate Task, 1 pliThermoFisher (Waltham, MA)N° de catalogue 06-666.  ; Fabricant #34120Lingettes de laboratoire pour éponger l’huile minérale des tissus musculaires avant la congélation instantanée et à d’autres fins.
Labview 2014National Instruments, Austin, Texas, États-UnisLogiciel Labview 2014pour des programmes/routines personnalisés qui font fonctionner le dynamomètre et déclenchent le stimulateur NMES.
Flacons de Dewar en PEHD à l’azote liquideThermoFisher (Waltham, MA)S34074B.  ; Thermo Scientific 41502000/EMDFlacon pour retenir l’azote liquide pour la congélation des muscles ou d’autres tissus
Crème dépilatoire magiqueSoftsheen Carson (New York, NY)N/ACrème dépilatoire sans rasoir
Pince crocodile en métalJINSHANGTOPK (entreprise basée sur le Web)24Pcs 51mm Pince crocodile en métal Pinces à ressortPince à ressort pour maintenir la goupille tibiale Diapositives
MicrscopeGlobe Scientific (Mahwah, NJ)1354W. Lames de verre blanc diamantLames de microscope chargées
Huile minéraleThermoFisher (Waltham, MA)BP26291Huile minérale pour cryoprotéger les tissus musculaires avant la congélation instantanée
Monoprice Premium Imprimante 3D Filament PLAMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)#11778Filament d’imprimante 3D Premium PLA 1.75mm 1 kg/bobine, Gris.  ; C’est le matériau utilisé pour imprimer en 3D des composants d’appareils.
Imprimante 3D Monoprice Select Mini V2 Monoprice(Rancho Cucamonga, CA)Imprimante 3D Mini V2pour la fabrication assistée par ordinateur de composants d’appareils.
NIH ImageNational Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD)NIH Image for WindowsLogiciel de traitement et d’analyse d’images utilisé pour quantifier la zone de lésions musculaires.  ; NIH Image est également connue sous le nom d’Image J.
Photoshop CS4Adobe (San Jose, CA)Creative Suite (CS4). Version 64 bits pour WindowsLogiciel de traitement et d’analyse d’images utilisé pour générer des images en mosaïque/cousue de la section transversale d’un muscle entier à partir d’images de champs individuels chevauchant Unité d’isolation
de stimulation PSIU6Grass Instruments (West Warwick, RI)Unité d’isolationPSIU6Unité d’isolement pour NMES.  ; Les stimulateurs, tels que le modèle 4100 d’A-M, sont équipés d’une unité d’isolation de stimulation intégrée
Matériau de suture tressé noir en soie Roboz 4-0Roboz Surgical (Gaithersburg, MD)Matériau de suture Roboz Surgical SUT152pour connecter la plaque de pied de l’appareil DART à la plaque de pied du dynamomètre ou à la résistance pour l’entraînement en résistance
Stimulateur à impulsions carrées S48Grass Instruments (West Warwick, RI)StimulateurS48Stimulateur électrique de laboratoire pour NMES .  ; Si ce stimulateur n’est pas disponible dans le commerce, le stimulateur haute puissance isolé modèle 4100 des systèmes A-M pourrait être une alternative. Veuillez contacter le co-auteur Jones pour plus d’informations.
Scott' s réactif bleuissantRicca Chemical Company (Arlington, TX)6697-32Solution de bleuissement qui intensifie la coloration nucléaire à l’hématoxyline
SigmaStat version 3.5Logiciel Systat (San Jose, CA)SigmaStat version 3.5Progiciel statistique pour les analyses statistiques
Vaporisateur d’isoflurane de tableVetEquip (Livermore, CA)Item #901801Système
d’anesthésie de table inhaléPommade de premiers soins antibiotique tripleGlobal Health Products (entreprise basée en mariage)Pommade de premiers soins antibiotique Globe Triple, 1 oz (paquet de 2) Pommade antibiotique de premiers soins Pommadeantibiotique appliquée sur la broche tibiale dans le cadre des soins post-opératoires
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Références

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