Un protocole de dosage en fosse simple pour visualiser et quantifier la résorption ostéoclastique in vitro

Summary

Nous présentons ici une procédure de dosage simple et efficace pour les essais en fosse de résorption utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium.

Abstract

Les ostéoclastes matures sont des cellules multinucléées qui peuvent dégrader les os par la sécrétion d’acides et d’enzymes. Ils jouent un rôle crucial dans diverses maladies (p. ex. ostéoporose et cancer des os) et sont donc des objets de recherche importants. In vitro, leur activité peut être analysée par la formation de fosses de résorption. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple de dosage en fosse utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium (CaP), qui peuvent être facilement visualisées et quantifiées. Des précurseurs d’ostéoclastes dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été cultivés sur les plaques revêtues en présence de stimuli ostéoclastogènes. Après 9 jours d’incubation, les ostéoclastes ont été fixés et colorés pour l’imagerie par fluorescence tandis que le revêtement CaP a été contre-coloré par la calcéine. Pour quantifier la zone résorbée, le revêtement CaP sur les plaques a été coloré avec 5% d’AgNO₃ et visualisé par imagerie en champ clair. La zone de la fosse de résorption a été quantifiée à l’aide d’ImageJ.

Introduction

Les ostéoclastes (OC) sont des macrophages spécifiques aux tissus dérivés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), jouant un rôle central dans le remodelage osseux avec les ostéoblastes¹. Les troubles osseux induits par les hormones sexuelles, immunologiques et malins qui détruisent les os de manière systémique ou locale sont dus à une activité ostéoclastique excessive, y compris l’ostéoporose liée à la ménopause², la polyarthrite rhumatoïde³, la maladie parodontale⁴, la maladie osseuse myélomateuse⁵ et les métastases osseuses ostéolytiques

Protocol

Le protocole a été examiné et approuvé par le comité d’éthique local (numéro d’approbation 287/2020B02).

1. Préparation de plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium

1. Préparation de la solution mère de calcium (25 mM CaCl₂·2H₂O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O dans le tampon Tris)
   1. Préparez un tampon Tris de 1,0 M et ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl.
   2. Installez un bécher en verre sur un agitateur magnétique et ajoutez 100 mL de tampon Tris de 1,0 M.
   3. Peser 0,368 g de CaCl₂·2H₂O, 8,0 g de NaCl et 0,....

Results

Le revêtement de phosphate de calcium sur le fond des plaques de culture cellulaire a été effectué en deux étapes de revêtement comprenant une pré-calcification de 3 jours et une étape de calcification de 1 jour. Comme le montre la figure 1, du phosphate de calcium uniformément réparti a été obtenu au fond des plaques de 96 puits. Le revêtement a très bien adhéré au fond après les étapes de lavage effectuées.

Discussion

Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique utilisant des CO dérivés et développés in vitro à partir de PBMC. Les plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisées peuvent être facilement préparées et visualisées à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. En plus des PBMC non triés adoptés dans ce protocole, les OC générés à partir de cellules monocytaires murines²¹ et de cellules macrophages de moelle osseuse^17<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Nitrate d’argent
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, sans nucléosides
amphotéricine B	Biochrom	03-028-1B	Amphotéricine B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Chlorure de calcium dihydraté
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	sérum fœtal bovin
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Tampon de fixation	Biolegend	420801	Paraformaldéhyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Acide chlorhydrique
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Humain recombinant M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Chlorure de magnésium
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Hydrogénophosphate de sodium anhydre
NaCl	Merk	S7653-250G	chlorure de sodium
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate de soude
PBS	Lonza	17-512F	Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (1X), DBPS sans calcium et magnésium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Mélange pénicilline-streptomycine
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloïdine
RANKL	PeproTech	310-01	Ligand sRANK humain recombinant (dérivé d’E. coli)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxyméthyl)aminométhane
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phényl Polyéthylène Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Enzymes de dissociation cellulaire recombinante