Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule

Résumé

La biochimie visuelle à molécule unique étudiée à travers des chambres microfluidiques est grandement facilitée à l’aide d’un baril en verre, de seringues étanches aux gaz, de connexions stables de tubes aux cellules d’écoulement et d’élimination des bulles en plaçant des vannes de commutation entre les seringues et les tubes. Le protocole décrit deux pièges optiques qui permettent de visualiser les transactions d’ADN et les interactions intermoléculaires.

Résumé

La biochimie visuelle est une technique puissante pour observer les propriétés stochastiques d’enzymes uniques ou de complexes enzymatiques qui sont obscurcis dans la moyenne qui a lieu dans les études en phase en vrac. Pour réaliser la visualisation, deux pinces optiques, où un piège est fixe et l’autre mobile, sont focalisés dans un canal d’une chambre microfluidique multiflux positionnée sur la platine d’un microscope à fluorescence inversée. Les pinces optiques piègent des molécules uniques d’ADN marqué par fluorescence et un flux de fluide à travers la chambre et au-delà des billes piégées, étire l’ADN à la forme B (sous une force minimale, c’est-à-dire 0 pN) avec l’acide nucléique observé comme une ficelle blanche sur un fond noir. Les molécules d’ADN sont déplacées d’un flux à l’autre, en traduisant l’étage perpendiculairement à l’écoulement pour permettre l’initiation des réactions de manière contrôlée. Pour réussir, des dispositifs microfluidiques avec des canaux optiquement transparents sont accouplés à des seringues en verre maintenues en place dans une pompe à seringues. Les résultats optimaux utilisent des connecteurs collés en permanence à la cellule d’écoulement, des tubes mécaniquement rigides et résistants aux produits chimiques, et connectés à des vannes de commutation qui éliminent les bulles qui empêchent l’écoulement laminaire.

Introduction

La capacité de visualiser les interactions protéine-ADN au niveau d’une seule molécule et en temps réel a fourni des informations significatives sur la stabilité du génome ^1,2. En plus de travailler avec des molécules d’ADN uniques une à la fois, la possibilité de visualiser les transactions entre molécules individuelles à proximité fournit des informations supplémentaires ^3,4,5. La manipulation de molécules d’ADN supplémentaires nécessite à la fois des pièges optiques supplémentaires ainsi que des cellules à flux microfluidique multicanaux de haute qualité⁶.

Il existe plusieurs méthodes disponibles pour générer plus d’un piège optique. Il s’agit notamment des miroirs à balayage galvanométrique, des modulateurs optiques acoustiques et de l’optique diffractive, qui génèrent des pincettes optiques holographiques 4,7,8,9. Souvent, les miroirs de balayage et les modulateurs optiques acoustiques produisent des pièges à temps partagé. Dans la configuration décrite ici, le faisceau d’un seul laser Nd:YAG est divisé en polarisation, puis les miroirs à balayage laser galvanomètre contrôlent la position de ce que l’on appelle le piège mobile (Figure 1)⁴. Pour faciliter le positionnement des miroirs et des filtres pour diriger le faisceau de piégeage vers l’ouverture arrière de l’objectif du microscope, un laser HeNe est utilisé. Cela facilite l’alignement global car le faisceau HeNe est visible à l’œil nu, alors que les faisceaux infrarouges ne le sont pas. Le faisceau HeNe est également plus sûr à travailler, ce qui rend le positionnement des miroirs et d’autres composants moins stressant. Initialement, le trajet du faisceau de ce laser est séparé du faisceau de 1064 nm, mais est introduit dans le même trajet du faisceau, puis dans l’objectif du microscope. Une fois l’alignement physique atteint, le positionnement du faisceau de 1064 nm au-dessus du faisceau HeNe est effectué, ce qui est facilité par l’utilisation d’une visionneuse infrarouge et de divers outils d’imagerie du faisceau pour visualiser la position et la qualité du faisceau. Ensuite, l’expanseur de faisceau est introduit et le faisceau infrarouge expansé résultant est aligné sur l’ouverture arrière de l’objectif. Enfin, l’objectif est retiré et la puissance de chaque faisceau polarisé est mesurée et ajustée à l’aide de plaques d’onde λ/2 pour être égale (Figure 1C). Les mesures de puissance sont également effectuées une fois que l’objectif est retourné et il y a généralement une perte de puissance de 53%. Il y a cependant une puissance suffisante pour former des pièges optiques fixes et mobiles stables dans le plan focal (Figure 1D).

Pour imager les transactions d’ADN, les cellules à flux microfluidique jouent un rôle clé car elles permettent des mesures contrôlées au niveau de la molécule unique avec une résolution spatiale et temporelle élevée (Figure 2). Le terme microfluidique désigne la capacité de manipuler des fluides dans un ou plusieurs canaux de dimensions allant de 5 à 500 μm^10,11. Le terme flux fait référence au fluide réel dans un canal et le canal fait référence au canal physique dans lequel un flux de fluide ou des flux se déplacent. La conception de cellules d’écoulement à canal unique a un canal physique commun où les réactions sont observées et il n’y a généralement qu’un seul flux de fluide présent. Ainsi, ces conceptions sont connues sous le nom de cellules d’écoulement à flux unique. En revanche, les cellules d’écoulement multiflux sont définies comme un dispositif microfluidique dans lequel deux canaux d’entrée ou plus convergent en un seul canal physique commun (figure 2A). À l’intérieur du canal commun, les flux de fluide qui proviennent des canaux individuels s’écoulent parallèlement les uns aux autres et restent séparés avec seulement un mélange minimal entre eux en raison de la diffusion (Figure 2B). Dans la majorité des configurations expérimentales, une seule pompe pousse les fluides dans chaque canal à la même vitesse. En revanche, lorsque la direction limite est utilisée, trois pompes ou plus, contrôlées indépendamment, poussent les fluides à travers les canaux. Cependant, chaque pompe fonctionne à une vitesse différente, mais le débit net dans le canal commun est constant¹². Cela permet l’échange rapide des composants du canal principal simplement en modifiant la vitesse de la pompe.

En plus de l’écoulement laminaire, un autre facteur critique est le profil de vitesse parabolique dans le flux de fluide laminaire. La vitesse d’écoulement la plus élevée se produit au milieu du cours d’eau et la plus lente se produit près des surfaces (figure 2C)¹³. Ce profil doit être pris en compte pour étirer complètement une molécule d’ADN qui est attachée à une bille maintenue dans le flux pour une visualisation précise de l’ADN fluorescent et des analyses précises d’une seule molécule. Ici, l’ADN est étiré à la forme B et est maintenu en place sous 0 pN de force. Pour ce faire, la position du piège optique doit être focalisée à une position de 10 à 20 μm de la surface inférieure du couvercle (Figure 2D). Des précautions doivent être prises pour que la molécule d’ADN ne soit pas étirée au-delà de la forme B, car cela peut inhiber les réactions enzymatiques. Dans des conditions tampons typiques, 1 μm = 3 000 pb d’ADN¹⁴. De plus, en piégeant 10 à 20 μm de la lamelle de couverture, le complexe d’ADN est positionné loin de la surface, minimisant ainsi les interactions de surface.

De nombreuses méthodes ont été utilisées pour créer des canaux de dispositifs microfluidiques et celles-ci peuvent être effectuées en laboratoire ou des cellules d’écoulement peuvent être achetées auprès de sources commerciales 6,15,16,17. Les matériaux optimaux utilisés pour construire les cellules d’écoulement doivent être mécaniquement rigides, optiquement transparents avec une faible fluorescence et imperméables aux solvants organiques⁶. Fréquemment, le verre flotté borosilicaté ou la silice fondue sont utilisés pour fournir un environnement d’écoulement stable pendant une période prolongée qui convient au piégeage optique, à la visualisation et à la détection de force. Ces matériaux permettent également l’utilisation de solvants non aqueux (p. ex. méthanol de qualité spectrophotométrique) pour simplifier le mouillage de surface et l’élimination des bulles d’air, et de dénaturants (p. ex. chlorhydrate de guanidinium 6M) ou de détergents pour nettoyer la cellule d’écoulement. Enfin, les méthodes utilisées pour introduire des fluides dans les cellules d’écoulement varient des systèmes complexes de pompes à vide aux pompes à seringue unique 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Dans l’approche décrite ici, on utilise une pompe à seringue pouvant accueillir jusqu’à 10 seringues (figure 3A). Cela offre la flexibilité d’utiliser des cellules d’écoulement à canal unique ou des cellules d’écoulement avec plusieurs canaux d’entrée. Ici, une cellule d’écoulement à trois canaux est utilisée et est accouplée à des seringues maintenues en place sur la pompe à seringue à l’aide d’un tube en polyéther-éther-cétone (PEEK) (figure 3A-C). Le débit des fluides est contrôlé par des vannes de commutation à quatre voies et sert ainsi à minimiser l’introduction de bulles dans la cellule d’écoulement (Figure 3A,D). De plus, les seringues étanches aux gaz Hamilton qui ont des parois de verre rigides et des pistons revêtus de polytétrafluoroéthylène (PTFE) sont recommandées car elles fournissent un mouvement de piston exceptionnellement doux qui est essentiel pour obtenir un écoulement régulier^14,27.

Dans le système expérimental décrit, des cellules d’écoulement avec deux à cinq canaux d’entrée ont été utilisées. Le nombre de canaux d’entrée est dicté par l’expérience en cours. Pour l’étude de RecBCD et Hop2-Mnd1, deux canaux de flux étaient suffisants ^14,28. Pour l’hélicase, l’enzyme a été liée à l’extrémité libre de l’ADN et traduite en un flux contenant du magnésium et de l’ATP pour initier la translocation et le déroulement. Pour Hop2-Mnd1, l’ADN piégé optiquement a été traduit dans le flux de fluide adjacent contenant des protéines et un tampon ± ions métalliques divalents. L’utilisation de cellules d’écoulement à trois canaux permet de piéger l’ADN dans le flux 1, de traduire l’ADN dans le flux 2 pour permettre la liaison aux protéines, puis de lancer le flux 3 où l’ATP est présent, par exemple, pour déclencher des réactions. Une variante de ce qui précède consiste à utiliser une protéine marquée par fluorescence dans le canal 2, ce qui rend le flux de fluide complètement blanc et empêche la visualisation de l’ADN. Lorsque cette molécule est traduite dans le flux 3, les protéines et l’ADN sont maintenant visibles lorsque les réactions sont initiées.

L’utilisation de vannes de commutation à quatre voies pour contrôler le débit de fluide est un élément essentiel du système pour éliminer les bulles dans les cellules d’écoulement. Les bulles nuisent à la stabilité de l’écoulement des fluides car elles se contractent et se dilatent de manière imprévisible, ce qui entraîne des changements rapides de la vitesse d’écoulement et l’introduction de turbulences. Lorsque les vannes sont positionnées entre les seringues et le tube d’admission, le chemin d’écoulement est déconnecté en changeant la position de la vanne lorsque les seringues sont remplacées. Lorsque la nouvelle seringue est mise en place, le piston peut être enfoncé manuellement de sorte que >6 μL est éjecté (le volume mort de la valve) et cela élimine presque entièrement les bulles.

La fixation des connecteurs aux cellules d’écoulement est souvent l’étape limitant la vitesse dans l’utilisation des cellules d’écoulement. Nous décrivons l’utilisation de deux types de connecteurs : amovibles dits press-fit et permanents (assemblages nanoports). Les connecteurs amovibles sont simples à adhérer à une cellule d’écoulement et différents types de tubes flexibles en plus du PTFE recommandé peuvent être testés avec ces connecteurs. Il s’agit d’un moyen rapide et rentable de tester les tubes et les connecteurs sans sacrifier les cellules d’écoulement en verre plus coûteuses. En revanche, les assemblages nanoports sont fixés en permanence, résistent à des pressions allant jusqu’à 1 000 psi et, entre nos mains, leur utilisation est limitée aux tubes en PEEK de différents diamètres. Ce n’est pas un inconvénient car les tubes en PEEK sont utilisés de préférence. Une seule cellule d’écoulement en verre avec des assemblages permanents fixés peut être réutilisée pendant plus de 1 an avec une utilisation prudente.

Protocole

1. Alignement et test du piège laser avec des billes de polystyrène

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 1A,B.

ATTENTION : L’expérimentateur doit porter des lunettes de protection appropriées ou des lunettes de sécurité laser pendant l’alignement du faisceau laser. Comme le système de pince optique décrit ici utilise à la fois des faisceaux HeNe et IR, deux ensembles distincts de verrerie de sécurité laser sont nécessaires.

1. Alignement HeNe Beam
   1. Positionnez tous les composants optiques sur la breadboard. Alignez la breadboard de manière à ce qu’elle soit aussi proche que possible d’un angle de 90° par rapport au microscope.
   2. Fixez le tube d’accouplement contenant l’objectif et la lentille telan au microscope (Figure 1A-11,12).
      REMARQUE: L’objectif telan est un système de lentilles qui est utilisé pour focaliser l’image sur le plan d’image intermédiaire dans les oculaires.
   3. Allumez le laser HeNe et ouvrez l’obturateur (Figure 1A-18). Le faisceau doit frapper le filtre (figure 1A-3) à une hauteur de 54 mm réfléchissant 50 % de la lumière sur le miroir 5 (figure 1A-5). Les 50 % restants du faisceau frappent le miroir 4 (figure 1A-4) à la même hauteur que le miroir 3.
   4. Régler le miroir 4 (figure 1A-4) de sorte que le faisceau frappe le miroir 6 (figure 1A-6) à une hauteur de 51 mm.
   5. Régler le miroir 6 (figure 1A-6) de sorte que le faisceau soit dirigé vers le miroir galvanique inférieur à une hauteur de 51 mm. Le faisceau qui sort du miroir galvanique supérieur sera de 57,5 mm.
   6. Régler le miroir 3 (figure 1A-3) de sorte que ce faisceau frappe le miroir 5 (figure 1A-5) à une hauteur de 57,5 mm. Une fois réfléchi par le miroir 5, le faisceau doit frapper le miroir 9 (figure 1A-9) à la même hauteur. Le faisceau est effectivement recombiné au miroir 9, traverse l’objectif et le système de lentilles telan sur le miroir 21 (Figure 1A-21), qui le reflète dans l’objectif.
   7. Placez une lame de microscope propre sur la scène du microscope. Allumez l’appareil photo et imagez les faisceaux des faisceaux fixes et de balayage individuellement sur l’écran. En commençant par le miroir 3, puis 5 et 9, enfin 21, effectuez de petits ajustements pour positionner le faisceau fixe au centre de l’écran.
   8. Pour vous assurer que l’angle du faisceau sortant du miroir 21 est de 90°, modifiez la hauteur Z du microscope et positionnez le faisceau imagé sur les surfaces supérieure et inférieure de la lame. Lorsqu’ils sont identiques, le faisceau est dans la bonne position, qui est perpendiculaire à la scène. Déclenchez ce faisceau à l’aide de l’obturateur 19 (Figure 1A-19).
   9. En commençant par les miroirs 4 et 6, effectuez de petits ajustements pour positionner le faisceau fixe au centre de l’écran. Obturez ce faisceau.
2. Alignement du faisceau infrarouge (IR)
   ATTENTION : Effectuez toutes les étapes à faible puissance laser pour des raisons de sécurité.
   1. Ajuster la plaque d’onde 14 (figure 1A-14) pour ajuster le rapport entre les faisceaux transmis et réfléchis répartis au niveau du séparateur de faisceau 2 (figure 1A-2). Le séparateur de faisceau 2 réfléchit la composante s du faisceau laser et transmet la composante p.
   2. Le faisceau qui traverse 2, frappe le miroir 7 (Figure 1A-7), qui dévie le faisceau sur le miroir galvanique inférieur. Il devrait suivre la trajectoire du faisceau HeNe sur le miroir 21. Effectuez de petits mouvements de miroir 7 pour réaliser ce positionnement.
   3. Régler le miroir 2 de sorte que le faisceau réfléchi par le miroir 2 frappe le miroir 10 (figure 1A-10) à une hauteur de 57,5 mm.
   4. Le faisceau est réfléchi du miroir 10 sur le miroir 8 (figure 1A-8) à une hauteur de 57,5 mm. Le faisceau suivant doit frapper le miroir 9 à la même hauteur. Si ce n’est pas le cas, apportez de petits ajustements aux miroirs 10 et 8 au besoin.
   5. Retirez l’objectif et placez la tête du capteur de puissance au-dessus du port de la tourelle d’objectif.
   6. Utilisez les plaques 14, 15 et 16 (Figure 1A-14,15,16) pour ajuster la puissance de chaque faisceau laser afin qu’ils soient égaux comme illustré à la Figure 1C.
   7. Mettre en place le détendeur de poutre 1 (figure 1A-1). Ajustez le faisceau laser expansé pour qu’il soit circulaire sans coma ni astigmatisme.
   8. Pour tester les pièges optiques, faites une solution de billes de polystyrène de 1 μm en suspension dans l’eau. Ensuite, placez 10 μL de cette solution sur une lame de microscope, placez une lamelle de couverture sur le dessus et scellez avec du vernis à ongles. Placez la lame sur la platine du microscope et testez les pièges optiques en piégeant ces billes de 1 μm. Assurez-vous que les perles sont aspirées dans les pièges et maintenues de manière stable lorsque la scène est déplacée. Le piégeage devrait se faire de la même manière efficace de tous les côtés du piège.

2. Préparation de la chambre microfluidique

1. Si la cellule d’écoulement est un dispositif de fabrication commerciale fabriqué à partir de polydiméthylsiloxane (PDMS) sur une lamelle de couverture, passez à l’étape 3. S’il s’agit d’un dispositif en verre avec des connecteurs connectés, passez à l’étape 4.
2. Si la cellule d’écoulement n’a pas de connecteurs connectés, collez-les d’abord aux trous d’entrée de la lame de microscope. Reportez-vous à l’étape 3 pour connaître la procédure de connexion des connecteurs.

3. Connexions de cellules d’écoulement à l’aide d’une cellule de flux PDMS

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 2D.

1. Placez la cellule d’écoulement sur une surface plane et propre. Tenez le tube en PTFE à 3 mm de l’extrémité libre à l’aide d’une pince. Poussez le tube dans l’orifice préformé (l’orifice peut supporter une pression de ligne de 2 bars).
2. Répétez cette procédure pour chacun des ports restants. Raccordez les orifices d’entrée à la pompe de seringue et la sortie à un flacon usagé (Figure 4A,B).
3. Remplissez chaque seringue en verre avec 1 mL de méthanol de qualité spectrophotométrique. Fixez chaque seringue à une vanne de commutation. Assurez-vous que la sortie de la vanne est dirigée vers les déchets et purgez chaque conduite avec 50 μL de méthanol (figure 4C, position fermée).
4. Basculez la position de sortie sur la cellule d’écoulement (Figure 4C, position ouverte). Pomper 800 μL de méthanol à travers la cellule d’écoulement à un débit de 100 μL/h pour mouiller les surfaces et éliminer les bulles.
5. Le lendemain, répétez ce processus en utilisant 800 μL d’eau ultrapure. La cellule d’écoulement est maintenant prête à l’emploi.

4. Fixation des connecteurs de tuyauterie à ajustement de presse

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 2F.

1. Si des connecteurs de tuyauterie pressables doivent être utilisés, retirez soigneusement le ruban adhésif d’un côté du connecteur et placez-le sur le trou de la lame de microscope. Appuyez pendant quelques secondes. Répétez le processus pour les connecteurs restants.
2. Placez la cellule d’écoulement sur une surface plane et propre. Tenez le tube en PTFE à 3 mm de l’extrémité libre à l’aide d’une pince. Poussez le tube dans le trou préformé dans l’orifice et répétez cette procédure pour chacun des orifices restants.
3. Fixez le tube des entrées aux vannes de commutation. Passez à l’étape 7.

5. Attachement des assemblées permanentes

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 2A-C.

1. Effectuez la fixation sur une surface propre et plane ou sur un collecteur personnalisé pour maintenir la cellule d’écoulement et les connecteurs en place pendant le collage.
2. Placez la cellule d’écoulement sur une surface plane propre ou dans la section encastrée du collecteur (figure 2B). Placez une petite quantité de colle pour verre sur le fond de l’ensemble et insérez le joint.
3. Placez le nanoport sur l’un des trous d’entrée de la lame de microscope. Poussez doucement vers le bas et maintenez-le en place sans mouvement latéral. Répétez le processus pour les ports restants.
4. Laisser sécher ou serrer en place dans le collecteur. Retirez délicatement la cellule d’écoulement du collecteur et assurez-vous que les assemblages s’alignent bien avec les orifices d’entrée de la cellule d’écoulement. Passez à l’étape 7 lorsque vous êtes prêt.

6. Connexions et préparation des cellules d’écoulement

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 4A,B.

1. Placez une cellule d’écoulement sur la platine du microscope. Fixez le tube à l’aide des connecteurs serrés aux doigts.
2. Remplissez chaque seringue en verre avec 1 mL de méthanol de qualité spectrophotométrique. Fixez chaque seringue à une vanne de commutation. Assurez-vous que la sortie de la vanne est dirigée vers les déchets et purgez chaque conduite avec 50 μL de méthanol (figure 4C, position fermée).
3. Basculez la position de sortie sur la cellule d’écoulement (Figure 4C, position ouverte). Pomper 800 μL de méthanol à travers la cellule d’écoulement à un débit de 100 μL/h pour mouiller les surfaces et éliminer les bulles.
4. Le lendemain, répétez ce processus en utilisant 800 μL d’eau ultrapure. La cellule d’écoulement est maintenant prête à l’emploi.

7. Contrôle de l’écoulement des fluides

1. Tournez les vannes de commutation en position fermée (figure 4C). Retirez les seringues, jetez l’eau résiduelle et remplissez les seringues avec des solutions expérimentales, par exemple des perles d’ADN; enzyme; et ATP. Remettez les seringues dans la pompe et connectez-les aux vannes de commutation.
2. Dans cette position, forcez manuellement les pistons vers le bas de 5 à 10 μL pour éliminer les bulles. Réglez la position de la vanne de commutation sur Ouvert.
3. Utilisez le schéma de débit pour obtenir une vitesse d’écoulement du fluide optimale pour le piégeage et la visualisation, comme indiqué dans le tableau 1. L’écoulement optimal du fluide pour le piégeage optique devrait permettre un piégeage stable des billes et une fois l’ADN étiré, il devrait être de forme B (~ 3 000 bp / μm).

8. Piégeage de billes de polystyrène avec des molécules d’ADN uniques attachées

1. À un grossissement de 10x, localisez la frontière entre les flux de fluide à proximité des points d’entrée du canal. Ajoutez de l’huile à l’objectif 100x et passez au grossissement plus élevé.
2. Ouvrez les volets des pièges optiques (les deux ou un à la fois). Les faisceaux laser focalisés devraient piéger les billes et l’ADN devrait s’étirer immédiatement.
3. Une fois qu’un complexe a été piégé, traduire l’étage perpendiculairement à l’écoulement (Figure 3A,C, encadré). Cela déplacera le complexe piégé de la solution de billes d’ADN dans le flux 2. Une traduction ultérieure déplacera le complexe vers le volet 3.

9. Nettoyage des cellules d’écoulement

REMARQUE: Effectuez cette opération quotidiennement.

1. Éteignez la pompe lorsque l’expérience est terminée. Tournez les vannes de commutation en position fermée (figure 4C).
2. Retirez les seringues et videz-les. Rincer trois fois à l’eau distillée filtrée.
3. Remplissez les seringues avec une solution de nettoyage. Placez les seringues dans la pompe et connectez-les aux vannes de commutation.
4. Purgez les vannes de commutation et changez la position pour l’ouvrir. Pomper 800 μL de solution de nettoyage à un débit de 100 μL/h généralement pendant la nuit.
5. Le lendemain, fermez les vannes de commutation, puis retirez et rincez les seringues à l’eau. Rincer la cellule d’écoulement et les conduites avec 4-800 μL d’eau à un débit de 400-800 μL/h. Si un nettoyage plus rigoureux des cellules d’écoulement est nécessaire, remplacer la solution de nettoyage par du chlorhydrate de guanidium 6M.

Résultats

Le test initial de l’alignement et de la résistance du piège est effectué avec des billes de polystyrène non fluorescentes de 1 μm. Étant donné que la plupart des recherches effectuées en laboratoire utilisent la fluorescence, nous testons davantage la résistance du piège en utilisant des billes de polystyrène vert dragon de 1 μm (figure 1D, E). Par la suite, les travaux passent au piégeage optique des complexes ADN-billes où l’ADN est coloré avec le colorant bis-intercalant...

Discussion

L’assemblage soigneux du système d’écoulement est essentiel au succès des expériences ^4,6. L’un des aspects les plus difficiles du protocole est la fixation des connecteurs à la surface du verre. Pour cela, nous utilisons les deux approches suivantes : les connecteurs de tubes press-fit et les assemblages nanoports. Les connecteurs press-fit adhèrent facilement au verre, puis poussent les tubes en PTFE dans les trous préformés à l’aide de pinces. Lorsqu’un access...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Objectif 100x	Leica	506318 ou 506038	Objectifs à immersion dans l’huile ; Imagerie et piégeage optique seulement ; Objectifs Plan APO optimisés pour l’imagerie de fluorescence
Objectif 10X	Leica	506263	Utilisé pour localiser les points des faisceaux laser pendant l’alignement ; pour trouver la mise au point et la position X-Y dans la cellule d’écoulement
Perles fluorescentes de 1 mm	Bangs Labs	FSDG004	Utilisé pour la performance de taraudage, la détermination de la position focale
Perles de polystyrène de 1 mm	Bangs Labs	CPO1004	Utilisé pour l’évaluation des performances du piège et la liaison aux molécules biotinylées
Objectif 63x	Leica	506081	Utilisé pour localiser les points des faisceaux laser pendant l’alignement et pour trouver la mise au point et la position X-y dans la cellule d’écoulement ; peut être utilisé pour le piégeage optique car il a un diamètre d’ouverture arrière identique à celui du 100X ; lentille d’immersion dans l’huile
Laser d’alignement	Lumentum	série	1100Laser HeNe de 10 mW visible à l’œil nu qui est utilisé pour positionner les optiques
Caméra d’alignement du faisceau	Amscope	MU303	Une caméra simple, peu coûteuse et contrôlée par logiciel pour l’imagerie de la position du faisceau Logiciel de contrôle de la
caméra et de capture d’image	Hamamatsu	HCImage	Coordonne les activités de la Lambda DG4 avec la caméra pour faciliter la commutation rapide de la longueur d’onde
Caméra ; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	Caméra CCD pour l’imagerie d’expériences sur des molécules uniques
Monture C pour la caméra d’alignement de faisceaux	Solutions d’imagerie ponctuelle	DE50CMT	Fournit un positionnement optimal de la caméra pour l’imagerie des faisceaux laser pendant l’alignement
Monture C pour la caméra			Orca Flash 4Dispose d’une bague de retenue pour maintenir un filtre bloquant IR en place. Cela élimine le faisceau IR réfléchi par les pièges optiques et facilite une imagerie plus claire des objets piégés.
Cube de filtre de fluorescence Cy5	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Utilisé en conjonction avec Lambda DG4 pour imager Cy5 uniquement
Fitc-TxredCube de filtre de fluorescence	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Utilisé en conjonction avec Lambda DG4 pour imager les tubes FITC et TXRed
Fluidics	Grace Bio	46004	Tubes en PTFE en alternative au PEEK ; Fonctionne bien sur certaines cellules d’écoulement. Peut être utilisé avec des cellules d’écoulement PDMS ou des cellules d’écoulement en verre lorsque des connecteurs de tube Grace Bio fit sont utilisés
Cube de filtre de fluorescence GFP	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Utilisé en conjonction avec Lambda DG4 pour imager GFP uniquement
Cellules d’écoulement en verre	Translume	Custom	Canaux d’écoulement clairs pour l’imagerie (Fig. 2E)
Colle à verre	Loctite	233841	Colle sûre et facile les assemblages Nanoport aux cellules d’écoulement en verre
Cellules d’écoulement sandwich verre/PDMS	CIDRA Services de précision	sur mesure	Cellules d’écoulement construites selon vos spécifications ; les canaux d’imagerie sont dégagés (Fig. 2C)
Hamilton Solution de nettoyage	Hamilton	18311	Solution de nettoyage douce mais efficace pour les cellules d’écoulement en verre ; ne fait pas de bulles lorsqu’elle est utilisée avec précaution
Système d’éclairage	Sutter Instrument	Lamda DG4	Abandonné et recommandé Lambda 721
Système d’éclairage	Sutter Instrument	Lamda DG4	Abandonné Logiciel d’analyse d’images Lambda 721
	Cybernétique multimédia Image	Pro Premiere	Analyse d’images et suivi de molécules uniques Logiciel d’analyse d’images
	Fidji/NIH Image/Image J	Shareware	Analyse d’images et suivi de molécules uniques
Image carte d’affichage	Melles Griot	06 DLA 001	Produit alternatif de Thorlabs : VRC5
Huile d’immersion	Zeiss	444960	Immersol 518 F sans fluorescence
Outils d’alignement du faisceau laser	Thor labs	FMP05/M ; dgo5-1500-h1 ; BHM1  ;	Utilisé pour s’assurer que les poutres sont horizontales et à la bonne hauteur
Visionneuse de faisceau laser	Laboratoires canadiens de photonique	IR 3150	Utilisé pour imager des points de faisceau IR sur des miroirs et des cibles
Wattmètre laser	Thor labs		Mesure de la puissance laser ainsi que de la force du piège
Lunettes de sécurité laser (HeNe)	Thor labs	LG7 ou 8	Blocs >3 OD unités de lumière de longueurs d’onde >600 nm
Lunettes de sécurité laser (IR)	Thor labs	LG11	Blocs >7 unités OD de lumière de longueurs d’onde ³ ; 1000 nm
Mcherry  ; cube de filtre de fluorescence	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Utilisé en conjonction avec Lambda DG4 pour l’imagerie mcherry uniquement
Microscope	Leica	DMIRE2	Port DIC supprimé pour s’adapter au miroir de piégeage/alignement dichroïque
Logiciel de contrôle du microscope  ;	UCSF/shareware	uManager	Contrôle le microscope, permet l’alignement focal des objectifs ainsi que le contrôle de la platine Assemblage de
nanoports	IDEX	N333	Connecteurs collés aux cellules d’écoulement Support de
table optique	Thor Labs PA52502 Support de table d’isolation		active
Optiques et lentilles	Solar TII	Divers	Miroirs interférentiels, télescopes et lentilles conçus sur mesure pour le système
Cellules d’écoulement PDMS	ufluidix	d’écoulement personnalisées	construites selon vos spécifications ; les canaux d’imagerie sont clairs (Figs. 2B et D)
Tube PEEK	IDEX	1532	Fournit une excellente connexion aux cellules d’écoulement et aux vannes de commutation
Cube de filtre de fluorescence Pinkel	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Utilisé en conjonction avec Lambda DG4 pour imager rapidement plusieurs fluorophores
Connecteurs de tube à ajustement pressant	GraceBio	46003	Connecteur en silicone transparent avec adhésif qui se lie bien au verre
Miroirs de balayage	GSI Lumonics	VM500	Utilisé pour assurer le contrôle du deuxième piège optique. GSI Lumonics n’existe plus. Des miroirs similaires peuvent être achetés auprès de Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage	Microscopie électronique Sciences	68042-08	Fournit une règle à l’écran pour le positionnement du faisceau et l’étalonnage du système
Vannes de commutation	IDEX	V-101T	Contrôlez la direction de l’écoulement du fluide et éliminez l’introduction de bulles dans les cellules d’écoulement
Seringue et collecteur de vannes	Atelier d’usinage	Aucun
Pompe à seringue	Harvard Apparatus	PHD 2000	Contrôle le débit de fluide à travers des cellules d’écoulement
Logiciel de pompe à seringue	Harvard Apparatus	70-6000	Le contrôle de débit permet un contrôle transparent et programmable du débit de fluides
Seringues	Hamilton	81320	Étanche aux gaz, PTFE Luer Lock, barils en verre avec Pistons revêtus de téflon
table	Thor Labs	T36H	Laser de
piégeage	Newport/Spectra Physics	J-series ; BL106C	Laser Nd :YAG ; 1064 nm ; laser 5W