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Article de méthode

Régénération épithéliale intestinale en réponse à une irradiation ionisante

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DOI :

10.3791/64028

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27 juillet 2022

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1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Dans cet article

Résumé

Le tractus gastro-intestinal est l’un des organes les plus sensibles aux blessures lors des traitements radiothérapeutiques contre le cancer. C’est à la fois un système d’organes avec l’une des capacités de régénération les plus élevées à la suite de telles insultes. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.

Résumé

L’épithélium intestinal est constitué d’une seule couche de cellules, mais contient plusieurs types de cellules différenciées en phase terminale, qui sont générées par la prolifération active de cellules souches intestinales situées au fond des cryptes intestinales. Cependant, lors d’événements de lésions intestinales aiguës, ces cellules souches intestinales actives subissent la mort cellulaire. L’irradiation gamma est un traitement du cancer colorectal largement utilisé qui, bien qu’efficace sur le plan thérapeutique, a pour effet secondaire d’épuiser le pool de cellules souches actives. En effet, les patients souffrent fréquemment d’un syndrome de radiation gastro-intestinale pendant la radiothérapie, en partie en raison de l’épuisement actif des cellules souches. La perte de cellules souches intestinales actives dans les cryptes intestinales active un pool de cellules souches intestinales de réserve typiquement quiescentes et induit une dédifférenciation des cellules précurseurs sécrétoires et entérocytaires. Sans ces cellules, l’épithélium intestinal n’aurait pas la capacité de se remettre de la radiothérapie et d’autres agressions tissulaires majeures. De nouvelles avancées dans les technologies de traçage de lignée permettent de suivre l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération et ont été utilisées avec succès pour étudier cela dans l’intestin. Cette étude vise à décrire une méthode d’analyse des cellules de l’épithélium intestinal de la souris à la suite d’une lésion radiologique.

Introduction

L’épithélium intestinal humain couvrirait approximativement la surface d’un demi-terrain de badminton s’il était placé complètement à plat1. Au lieu de cela, cette couche cellulaire unique séparant les humains du contenu de leurs intestins est compactée en une série de projections, de villosités et d’indentations en forme de doigts, des cryptes qui maximisent la surface des intestins. Les cellules de l’épithélium se différencient le long d’un axe crypte-villosités. Les villosités sont principalement constituées d’entérocytes absorbant les nutriments, de cellules caliciformes sécrétrices de mucus et de cellules entéroendocrines productrices d’hormones, tandis que les cryptes sont principalement constituées de cellules de Paneth productrices de défensine, de cellules souches actives et de réserve et de cellules progénitrices 2,3,4,5. De plus, la communication bidirectionnelle de ces cellules avec les cellules stromales et immunitaires du compartiment mésenchymateux sous-jacent et le microbiote de la lumière génère un réseau complexe d’interactions qui maintient l’homéostasie intestinale et est essentiel à la récupération après une blessure 6,7,8.

L’épithélium intestinal est le tissu qui s’auto-renouvelle le plus rapidement dans le corps humain, avec un taux de renouvellement de 2-6 jours 9,10,11. Au cours de l’homéostasie, les cellules souches actives à la base des cryptes intestinales (cellules cylindriques de la base cryptique), marquées par l’expression du récepteur couplé à la protéine G 5 (LGR5) riche en protéines répétées et riche en leucine, se divisent rapidement et fournissent des cellules progénitrices qui se différencient en toutes les autres lignées épithéliales intestinales. Cependant, en raison de leur taux mitotique élevé, les cellules souches actives et leurs progéniteurs immédiats sont particulièrement sensibles aux lésions par rayonnement gamma et subissent une apoptose après irradiation 5,12,13,14. Lors de leur perte, les cellules souches de réserve et les cellules non souches (sous-population de progéniteurs et certaines cellules différenciées en phase terminale) au sein des cryptes intestinales subissent une activation et reconstituent le compartiment de la crypte basale, qui peut alors reconstituer les populations cellulaires des villosités et, ainsi, régénérer l’épithéliumintestinal 15. En utilisant des techniques de traçage de la lignée, plusieurs groupes de recherche ont démontré que les cellules souches de réserve (quiescentes) sont capables de soutenir la régénération lors de la perte de cellules souches actives 13,16,17,18,19,20,21,22. Ces cellules sont caractérisées par la présence de l’oncogène de la protéine 1 du complexe polycomb (Bmi1), du gène de la transcriptase inverse de la télomérase de souris (mTert), de l’homéobox du houblon (Hopx) et du gène de la protéine 1 répétitive riche en leucine (Lrig1). En outre, il a été démontré que les cellules non souches sont capables de reconstituer les cryptes intestinales en cas de lésion 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particulier, il a été démontré que les progéniteurs des cellules sécrétoires et des entérocytes subissent une dédifférenciation lors d’une blessure, redeviennent des cellules souches et favorisent la régénération de l’épithélium intestinal. Des études récentes ont identifié des cellules exprimant plusieurs marqueurs qui possèdent la capacité d’acquérir des caractéristiques de type souche en cas de blessure (telles que DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Étonnamment, Yu et al. ont montré que même les cellules de Paneth matures (LYZ +) peuvent contribuer à la régénération intestinale37. De plus, en plus de provoquer l’apoptose des cellules épithéliales intestinales et de perturber la fonction de barrière épithéliale, l’irradiation entraîne une dysbiose de la flore intestinale, l’activation des cellules immunitaires et l’initiation d’une réponse pro-inflammatoire, ainsi que l’activation des cellules mésenchymateuses et stromales38,39.

Le rayonnement gamma est un outil thérapeutique précieux dans le traitement du cancer, en particulier pour les tumeurs colorectales40. Cependant, l’irradiation affecte de manière significative l’homéostasie intestinale en induisant des dommages aux cellules, ce qui conduit à l’apoptose. L’exposition aux rayonnements provoque de multiples perturbations qui ralentissent le rétablissement d’un patient et est marquée par des lésions muqueuses et une inflammation dans la phase aiguë et de la diarrhée, de l’incontinence, des saignements et des douleurs abdominales à long terme. Cette panoplie de manifestations est appelée toxicité des rayonnements gastro-intestinaux. De plus, la progression radio-induite de la fibrose transmurale et/ou de la sclérose vasculaire peut ne se manifester que des années après le traitement38,41. Simultanément à la blessure elle-même, le rayonnement induit une réponse de réparation dans les cellules intestinales qui active les voies de signalisation responsables de l’initiation et de l’orchestration de la régénération42. La maladie de l’intestin grêle radio-induite peut provenir d’une radiothérapie pelvienne ou abdominale administrée à d’autres organes (comme le col de l’utérus, la prostate, le pancréas, le rectum)41,43,44,45,46. Les lésions par irradiation intestinale constituent donc un problème clinique important, et une meilleure compréhension de la physiopathologie qui en résulte est susceptible de faire progresser le développement d’interventions visant à atténuer les complications gastro-intestinales associées à la radiothérapie. Il existe d’autres techniques qui permettent d’étudier le but régénérateur de l’épithélium intestinal en dehors de la radiation. Des modèles murins transgéniques et chimiques pour étudier l’inflammation et la régénération par la suite ont été développés47. Le sulfate de sodium de dextrane (DSS) induit une inflammation dans l’intestin et conduit au développement de caractéristiques similaires à celles de la maladie inflammatoire de l’intestin48. Une combinaison de traitement DSS avec le composé pro-cancérogène azoxyméthane (OMA) peut entraîner le développement d’un cancer associé à la colite48,49. Les lésions induites par la reperfusion ischémique sont une autre méthode utilisée pour étudier le potentiel de régénération de l’épithélium intestinal. Cette technique nécessite de l’expérience et des connaissances chirurgicales50. En outre, les techniques susmentionnées causent différents types de lésions que les rayonnements et peuvent entraîner l’implication de différents mécanismes de régénération. De plus, ces modèles prennent beaucoup de temps, alors que la technique de rayonnement est assez brève. Récemment, des méthodes in vitro utilisant des entéroïdes et des colonoïdes générés par l’intestin et le côlon ont été utilisées en combinaison avec des lésions radiologiques pour étudier les mécanismes de la régénération intestinale51,52. Cependant, ces techniques ne récapitulent pas complètement l’organe qu’elles modélisent53,54.

Le protocole présenté comprend la description d’un modèle murin de lésion par rayonnement gamma en combinaison avec un modèle génétique qui, après un traitement au tamoxifène, permet de retracer les lignées provenant de la population de cellules souches de réserve (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Ce modèle utilise une irradiation totale du corps de 12 Gy, qui induit des lésions intestinales suffisamment importantes pour activer les cellules souches de réserve tout en permettant l’étude ultérieure de la capacité de régénération intestinale dans les 7 jours suivant la lésion55.

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Protocole

Toutes les souris ont été hébergées dans la Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) de l’Université Stony Brook. Le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stony Brook a approuvé toutes les études et procédures impliquant des sujets animaux. Les expériences impliquant des sujets animaux ont été menées en stricte conformité avec le protocole approuvé de manipulation des animaux (IACUC #245094).

NOTE: Les souches de souris B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) et B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) ont été obtenues commercialement (voir le tableau des matériaux) et croisées pour obtenir Bmi1-Cre ER; Souris Rosa26eYFP (Bmi1ctrl), comme décrit précédemment56,57,58.

1. Logement de Bmi1-Cre ER; Souris Rosa26 eYFP

  1. Gardez les souris dans une animalerie à une température allant de 68-72 ° F et une humidité allant de 30-70%, dans un cycle lumière / obscurité de 12 h / 12 h, avec de l’eau et du chow ad libitum normal.
  2. Avant les expériences, confirmer les génotypes de souris à l’aide d’une technique de génotypage PCR standard57,58.

2. Préparation des animaux et du matériel

  1. Transférez les souris dans la salle de logement expérimentale au moins 7 jours avant toute expérimentation pour permettre aux souris de s’acclimater.
  2. Jumeler les animaux expérimentaux et témoins en fonction du sexe et de l’âge.
  3. Soumettre les animaux témoins à une recombinaison induite par la Cre induite par le tamoxifène, mais pas à une irradiation (traitement fictif, 0 Gy) tout en veillant à ce que les animaux de laboratoire reçoivent l’injection de tamoxifène et soient exposés à une irradiation gamma.
  4. Préparer la solution de tamoxifène. Resuspendre la poudre de tamoxifène dans de l’huile de maïs stérile à une concentration de 30 mg/mL. Sonifier pendant 3 min en cycles de 30 s ON et 30 s OFF avec une amplitude de 60%, puis tourner dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante (RT). La solution de tamoxifène peut être congelée à −20 °C, mais ne la congelez pas plus d’une fois. De préférence, préparez une solution fraîche à chaque fois et ne la conservez pas.
    REMARQUE: Le tamoxifène est sensible à la lumière. Enveloppez-le avec du papier d’aluminium pendant la rotation à température ambiante.
    ATTENTION : Le tamoxifène est une substance potentiellement dangereuse : danger pour la santé (SGH08) et danger pour l’environnement (SGH09).
  5. Préparer la solution mère de 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU). Remettez en suspension la poudre d’EdU dans 1/5 du volume total de diméthylsulfoxyde stérile (DMSO) et ajoutez lentement les 4/5 restants du volume total d’eau ultrapure stérile. Une fois complètement dissous, aliquote et conserver à −20 °C.
    ATTENTION : La 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et le diméthylsulfoxyde (DMSO) sont des substances potentiellement dangereuses : danger pour la santé (H340 et H631, et H227, H315 et H319, respectivement). EdU peut causer des défauts génétiques et est soupçonné de nuire à la fertilité ou aux enfants à naître, et le DMSO peut causer une irritation de la peau et des yeux.
  6. Préparer les réactifs pour la collecte et la fixation des tissus: diluer l’éthanol pour préparer une solution aqueuse à 70%, refroidir le DPBS à 4 °C et préparer le tampon fixateur de Bouin modifié (50% d’éthanol et 5% d’acide acétique dans leH2Odistillé) et le formol tamponné à 10%.
    ATTENTION : L’alcool éthylique est une substance potentiellement dangereuse : danger pour la santé (H225-H319), inflammable (GHS02) et provoque une toxicité aiguë (SGH07). L’acide acétique est une substance potentiellement dangereuse : dangereuse pour la santé (H226-H314), inflammable (GHS02) et corrosive (GHS05). Le formol est une substance potentiellement dangereuse : dangereuse pour la santé (H350, H315, H317, H318, H370) et corrosive. Le formol peut causer le cancer, une irritation de la peau et des yeux, des dommages aux organes et des réactions allergiques cutanées.
  7. Préparer le matériel nécessaire à l’euthanasie selon une méthode approuvée (chambre CO2 , par exemple), un kit de dissection de souris (ciseaux, pinces), des boîtes de Petri, une aiguille à gavage de 16 G fixée à une seringue de 10 ml pour rincer les intestins et des cassettes histologiques.

3. Irradiation gamma (TCC) du corps entier et prélèvement de tissus

  1. Deux jours avant l’exposition à l’irradiation gamma, injecter aux animaux de laboratoire une dose unique de tamoxifène pour induire une recombinaison médiée par Cre et un traçage de la lignée cellulaire BMI1/EYFP+ . Peser chaque animal et calculer une dose de 40 mg/kg de poids corporel de tamoxifène remis en suspension dans de l’huile de maïs. Désinfectez la région abdominale avec de l’éthanol à 70 % et administrez le tamoxifène par voie intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de 27 G fixée à une seringue de 1 mL.
  2. Observer les animaux pendant les 48 heures suivantes afin d’exclure toute toxicité potentielle du tamoxifène.
  3. Transférer les souris dans la salle d’irradiation comme spécifié par l’institution locale.
  4. Calculer le temps d’exposition à l’irradiation libéré par la source 137Cs en fonction du débit de dose exact actuel. Par exemple, si le débit de dose actuel est égal à 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), le temps d’exposition en minutes est calculé comme étant la dose désirée/0,759. Pour irradier les animaux à une dose de 12 Gy TBI, le temps d’exposition est de ~15,81 min (15 min et 48 s).
  5. Désinfecter la chambre d’échantillonnage dans l’irradiateur gamma avec une solution d’éthanol à 70%; Placez le tapis absorbant et les animaux à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage.
    REMARQUE : Les animaux traités de manière simulée doivent être placés dans la salle d’irradiation, mais ils ne doivent pas être exposés à une irradiation gamma.
  6. Placez le couvercle et fermez la chambre.
  7. Programmez l’irradiateur gamma pour exposer les animaux à 12 Gy TBI.
    1. Allumez la machine en tournant la clé en position START.
    2. Entrez le numéro de l’opérateur à l’aide d’un clavier numérique et confirmez en appuyant sur ENTRÉE.
    3. Entrez le code PIN à l’aide d’un clavier numérique et confirmez en appuyant sur ENTRÉE.
    4. Appuyez sur 1 pour connaître les options.
    5. Appuyez sur 1 pour les paramètres de la minuterie.
    6. Appuyez sur 1 pour connaître le temps d’irradiation.
    7. Entrez le paramètre de minuterie pour le cycle suivant à l’aide d’un clavier numérique (format hh:mm:ss) et confirmez en appuyant sur ENTRÉE.
    8. Confirmez les paramètres une fois de plus en appuyant sur ENTRÉE.
    9. Revenez au menu d’accueil en appuyant sur EFFACER 2x.
    10. Appuyez sur START pour lancer l’exposition.
  8. Quittez la pièce pendant le temps de l’exposition active. La machine s’arrêtera automatiquement une fois le temps prédéfini écoulé et commencera à émettre un bip.
    ATTENTION : Le césium 137 (137Cs) est une substance dangereuse mortelle (danger pour la santé : H314). L’exposition externe à de grandes quantités de 137Cs peut causer des brûlures, une maladie aiguë des radiations et même la mort.
  9. Éteignez l’appareil en tournant la clé en position STOP.
  10. Ouvrez la chambre d’échantillonnage, retirez le couvercle, transférez les animaux dans la cage et désinfectez la chambre d’échantillonnage avec une solution d’éthanol à 70%.
  11. Transférez les animaux dans la salle de logement conventionnelle et observez leur état après le traitement.
  12. Surveillez le poids des animaux tous les jours et euthanasiez-les immédiatement (malgré le point temporel prévu) si des symptômes d’altération du bien-être, de détresse ou de perte de poids supérieure à 15% du poids corporel de départ sont observés.
  13. Trois heures avant l’euthanasie prévue, désinfectez la région abdominale et, à l’aide d’une seringue à insuline de 28 G, injectez aux souris 100 μL de solution mère d’EdU (administrée par voie intrapéritonéale).
  14. Prélever les intestins proximaux à 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h et 168 h après l’irradiation.
    1. Pratiquer l’euthanasie au CO2 selon les normes de l’établissement d’attache.
      ATTENTION : Le dioxyde de carbone est une substance dangereuse (H280). Contient du gaz sous pression; Peut exploser s’il est chauffé. Peut déplacer l’oxygène et provoquer une suffocation rapide.
    2. Ensuite, disséquez la partie proximale de l’intestin grêle, retirez les tissus attachés, rincez avec du DPBS froid à l’aide d’une aiguille d’alimentation droite de 16 G fixée à une seringue de 10 mL, fixez avec le tampon fixateur de Bouin modifié à l’aide d’une aiguille d’alimentation droite de 16 G fixée à une seringue de 10 mL, coupez longitudinalement et roulez les intestins proximaux en utilisant la technique swiss-roll décrite précédemment59.
  15. Placer les mouchoirs dans une cassette histologique et laisser reposer 24 à 48 h à température ambiante dans un récipient contenant du formol tamponné à 10 %. Le volume du formol doit être suffisant pour couvrir complètement les cassettes histologiques. Lorsque le temps d’incubation est écoulé, à l’aide de forceps, transférer les cassettes histologiques dans le récipient rempli d’éthanol à 70%. Ensuite, procédez à l’encastrement de paraffine tissulaire.
    REMARQUE : L’encastrement de paraffine tissulaire a été effectué par le laboratoire de base en histologie de recherche de l’Université Stony Brook. La procédure peut être arrêtée ici et les blocs de paraffine peuvent être stockés à température ambiante.
    ATTENTION : Le formol est une substance potentiellement dangereuse : danger pour la santé (H350, H315, H317, H318, H370) et corrosive. Le formol peut causer le cancer, une irritation de la peau et des yeux, des dommages aux organes et des réactions allergiques cutanées.

4. Analyse histologique

  1. Refroidir les cassettes histologiques contenant les échantillons de tissus incorporés dans la paraffine en les plaçant sur de la glace pendant au moins 1 h. À l’aide d’un microtome, préparer des sections de 5 μm d’épaisseur pour la coloration. Chaque tissu doit être tranché horizontalement pour couvrir tout l’échantillon roulé.
    1. Après avoir coupé le bloc de paraffine, transférer les sections de tissu dans un bain-marie chauffé à 45 °C et placer les sections sur des lames chargées. Laissez sécher les lames sur une grille pendant la nuit à température ambiante.
      REMARQUE: La procédure peut être arrêtée ici et les lames peuvent être stockées à température ambiante.
  2. Placez les lames dans un support à glissière et faites cuire dans un four à 65 °C pendant la nuit. Les diapositives peuvent être cuites pour un temps plus court, 1-2 h. Cependant, cela n’est pas conseillé dans le cas de lames fraîchement coupées (moins de 1 mois).
    REMARQUE: Placez le jeu de coloration manuelle sous le capot chimique et effectuez les incubations avec du xylène, de l’éthanol et de l’hématoxyline sous le capot chimique.
  3. Le lendemain, refroidissez les lames en les plaçant dans un support de glissière sous le capot chimique pendant 10 min.
  4. Déparaffiniser les tissus en plaçant le porte-lames dans un récipient rempli à 100% de xylène pendant 3 min. Répéter l’incubation en utilisant du xylène frais à 100%.
    REMARQUE : À partir de ce moment, assurez-vous que les spécimens sont conservés humides en tout temps.
    ATTENTION : Le xylène est une substance potentiellement dangereuse : inflammable (GHS02), provoquant une toxicité aiguë (GHS07) et un danger pour la santé (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Les effets dangereux potentiels sont qu’il est mortel s’il est avalé ou pénètre dans les voies respiratoires et peut causer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires. De plus, il peut affecter les fonctions motrices en provoquant de la somnolence ou des étourdissements et causer des dommages aux organes en cas d’exposition prolongée ou répétée.
  5. Réhydrater les sections dans un gradient d’éthanol en plaçant séquentiellement le porte-lames dans des récipients remplis des solutions suivantes : éthanol 100 %, 2 min; 95% d’éthanol, 2 min; 70% d’éthanol, 2 min.
  6. Transférer le support de glissière dans le récipient rempli d’eau distillée et rincer à l’eau distillée courante pendant 2 min.
  7. Placez le support de lame dans un récipient rempli de solution d’hématoxyline et laissez tacher pendant 5 minutes (sous le capot chimique).
  8. Transférer le support de glissière dans le récipient rempli d’eau du robinet et rincer à l’eau courante du robinet jusqu’à ce que la coloration à l’hématoxyline devienne bleuâtre, généralement après 2 minutes.
  9. Transférer le support à glissière dans le récipient rempli de solution de carbonate de lithium à 5 % (p/v). Trempez 10x.
    ATTENTION : Le carbonate de lithium est une substance potentiellement dangereuse : provoquant une toxicité aiguë (SGH07) et un danger pour la santé (H302 - H319). Il est nocif en cas d’ingestion, nocif au contact de la peau et provoque une irritation oculaire grave.
  10. Transférer le support de glissière dans le récipient rempli d’eau distillée et rincer à l’eau distillée courante pendant 2 min.
  11. Placez le support de glissière dans un récipient rempli d’éosine et de teinture pendant 5 min.
  12. Transférer le porte-lames dans le récipient rempli d’éthanol à 70% et rincer brièvement (10 s).
  13. Déshydrater les sections en plaçant séquentiellement le porte-lames dans les récipients remplis de solutions de gradient d’éthanol: éthanol à 95%, 5 trempettes; 100% éthanol, 5 trempettes.
  14. Dégagez les lames en plaçant le porte-lames dans le récipient rempli à 100% de xylène pendant 3 min. Répéter l’incubation en utilisant du xylène frais à 100%.
  15. Sortez la lame de la grille, séchez la zone autour des mouchoirs à l’aide d’une serviette en papier et, selon la taille de l’échantillon, ajoutez une goutte ou deux de support de montage à base de xylène sur la surface de l’échantillon. Montez en plaçant doucement un couvercle sur la lame de verre (veillez à ne pas laisser de bulles d’air). Appuyez doucement si nécessaire. Toute la surface du verre doit être couverte et scellée.
  16. Sécher les lames en les laissant sous le capot chimique pendant la nuit. En règle générale, le support de montage se solidifie en moins de 24 h. Pour s’assurer que les lames sont sèches, un échantillon de lames peut être fait. À l’aide d’une glissière vide, placez une goutte du support de montage et laissez sous le capot chimique pendant la nuit. Le lendemain, touchez la goutte et vérifiez si elle est solidifiée.
  17. Lorsque les lames sèchent, analysez l’histologie des tissus à l’aide d’un microscope optique ou d’un microscope plus avancé avec un canal de champ clair.
    1. Placez une lame de microscope sur la scène, déplacez-vous jusqu’à ce que l’échantillon soit au centre du champ de vision, ajustez la mise au point à l’aide du bouton de mise au point et utilisez un objectif de grossissement 10x et / ou 20x pour analyser l’histologie par rapport aux tissus témoins (irradiés simulés).
    2. Si le microscope est équipé d’une caméra, prenez également des images.
      REMARQUE: La procédure peut être arrêtée ici; Les lames peuvent être stockées à température ambiante et analysées ultérieurement. Ne conservez pas les lames plus de 30 jours, car les taches s’estompent lentement.

5. Coloration par immunofluorescence

  1. Refroidir les cassettes histologiques contenant des échantillons de tissus contenant de la paraffine en les plaçant sur de la glace pendant au moins 1 h. À l’aide d’un microtome, préparer des sections de 5 μm d’épaisseur pour la coloration. Chaque tissu doit être tranché horizontalement pour couvrir tout l’échantillon roulé.
    1. Après avoir coupé le bloc de paraffine, transférer les sections de tissu dans un bain-marie chauffé à 45 °C et placer les sections sur des lames chargées. Laissez sécher les lames sur une grille pendant la nuit à température ambiante.
      REMARQUE: La procédure peut être arrêtée ici et les lames peuvent être stockées à température ambiante.
  2. Placez les lames dans un support à glissière et faites cuire dans un four à 65 °C pendant la nuit. Les diapositives peuvent être cuites pour un temps plus court, 1-2 h. Cependant, cela n’est pas conseillé dans le cas de glissières fraîchement coupées (il y a moins de 1 mois).
    REMARQUE: Placez le jeu de coloration manuelle sous le capot chimique et effectuez les incubations avec du xylène, de l’éthanol et duH2O2 / méthanol sous le capot chimique.
  3. Le lendemain, refroidissez les lames en les plaçant dans un support de glissière sous le capot chimique pendant 10 min.
  4. Déparaffiniser les tissus en plaçant le porte-lames dans un récipient rempli à 100% de xylène pendant 3 min. Répéter l’incubation en utilisant du xylène frais à 100%.
    REMARQUE : À partir de ce moment, assurez-vous que les spécimens sont conservés humides en tout temps.
  5. Tremper la peroxydase endogène en incubant les lames pendant 30 min dans un récipient rempli de solution de peroxyde d’hydrogène à 2% dans du méthanol sous la hotte chimique.
    ATTENTION : L’alcool méthylique est une substance potentiellement dangereuse : danger pour la santé (H225-H301, H311, H331-H370), inflammable (SGH02), et provoque une toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation) (SGH08). Le peroxyde d’hydrogène est une substance potentiellement dangereuse : corrosive (SGH05) et provoque une toxicité aiguë (SGH07).
  6. Réhydrater les sections dans un gradient d’éthanol en plaçant séquentiellement le porte-lames dans des récipients remplis des solutions suivantes: 100% éthanol, 3 min; 95% d’éthanol, 3 min; 70% d’éthanol, 3 min.
  7. Transférer le support de glissière dans un récipient rempli d’eau distillée et rincer à l’eau distillée courante pendant 2 min.
  8. Pour récupérer les antigènes, transférer le porte-lames dans un récipient contenant 250 ml de solution tampon de citrate (citrate de sodium 10 mM, 0,05 % Tween-20, pH 6,0) et cuire à 110 °C pendant 10 min à l’aide d’une chambre de détoilettage.
  9. Transférer le récipient entier dans la chambre froide et laisser refroidir progressivement au cours des 30 minutes.
  10. Après 30 min, remplacer la solution tampon de citrate par de l’eau distillée et rincer à l’eau distillée courante jusqu’à ce que tous les morceaux de paraffine flottants soient retirés.
  11. Retirez les lames du support (une à la fois), tapotez sur une serviette en papier et séchez soigneusement la zone autour du spécimen avec une serviette en papier. Dessinez une forme fermée autour de l’échantillon à l’aide d’un stylo qui fournit une barrière hydrophobe (stylo PAP). Placer dans une chambre humidifiée.
  12. Bloquer avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans TBS-Tween en ajoutant 200 μL de la solution sur la surface d’un échantillon. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite. Incuber à 37 °C dans une chambre humidifiée pendant 30 min.
  13. Retirez la solution de blocage en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier. Remettre dans une chambre humidifiée. Ajouter 100 μL de la concentration appropriée des anticorps primaires remis en suspension dans un tampon de blocage et incuber à 4 °C en berçant doucement pendant la nuit. Pour l’IMC1/FEJP, utiliser du poulet anti-GFP (dilution 1:500); pour le Ki-67, utiliser de l’anti-Ki-67 de lapin (dilution 1:200).
  14. Retirer la solution d’anticorps en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier; placez les lames dans un porte-lames et transférez-les dans le contenant rempli de TBS-Tween. Laver les lames en agitant pendant 5 min. Répéter 3x. Chaque fois, utilisez une nouvelle portion du tampon TBS-Tween.
  15. Retirez les lames du support (une à la fois), retirez l’excès de solution de lavage en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier et placez-la dans une chambre humidifiée. Ajouter 100 μL de la concentration appropriée d’anticorps secondaires remis en suspension dans un tampon de blocage et incuber à 37 °C pendant 30 min. Les anticorps secondaires doivent être conjugués à un fluorophore. Pour BMI1/EYFP, utilisez l’âne anti-poulet Alexa Fluor 647 (dilution 1:500); pour le Ki-67, utiliser l’anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 488 (dilution 1:500).
  16. Retirer la solution d’anticorps en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier; placez les lames dans un porte-lames et transférez-les dans le contenant rempli de TBS-Tween. Laver les lames en agitant pendant 5 min. Répéter 3x. Chaque fois, utilisez une nouvelle portion du tampon TBS-Tween.
  17. Retirez les lames du support (une à la fois), retirez l’excès de solution de lavage en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier et placez-la dans une chambre humidifiée. Ajouter 100 μL de la solution de coloration EdU préparée selon les instructions du fabricant et en utilisant le fluorophore Alexa Fluor 555.
  18. Retirez la solution EdU en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier; placez les lames dans un porte-lames et transférez-les dans le contenant rempli de TBS-Tween. Laver les lames en agitant pendant 5 min. Répéter 2x. Chaque fois, utilisez une nouvelle portion du tampon TBS-Tween.
  19. Retirez les diapositives du support (une à la fois); Retirez l’excès de solution de lavage en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier et placez-la dans une chambre humidifiée. Effectuer la contre-coloration Hoechst 33258 en ajoutant 100 μL de la solution Hoechst 33258 (dilution 1:1000 dans TBS-Tween) sur la surface de l’échantillon. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 5 min.
  20. Retirez la solution Hoechst 33258 en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier; placer les lames dans un porte-lames et les transférer dans un contenant rempli de TBS-Tween. Laver les lames en agitant pendant 5 min.
  21. Retirez la lame du porte-lame, séchez la zone autour des tissus à l’aide d’une serviette en papier et, selon la taille de l’échantillon, ajoutez une goutte ou deux de support de montage à base d’eau sur la surface de l’échantillon. Montez en plaçant doucement un couvercle sur la lame de verre (veillez à ne pas laisser de bulles d’air). Appuyez doucement si nécessaire. Toute la surface du verre doit être couverte et scellée.
  22. Sécher les lames en les laissant dans l’obscurité à température ambiante pendant la nuit. En règle générale, le support de montage se solidifie en moins de 24 h. Pour s’assurer que les lames sont sèches, un échantillon de lames peut être fait. Utilisez une diapositive vide; Placez une goutte du support de montage et laissez sous le capot chimique pendant la nuit. Le lendemain, touchez la goutte et vérifiez si elle est solidifiée.
  23. Lorsque les lames sèchent, les tissus colorés peuvent être analysés à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de filtres de longueur d’onde d’émission permettant la visualisation de la coloration Ki-67, EdU et BMI1 / EYFP (535 nm, 646 nm et 700 nm, respectivement).
  24. Placez une lame de microscope sur la scène, déplacez-vous jusqu’à ce que l’échantillon soit au centre du champ de vision, ajustez la mise au point à l’aide du bouton de mise au point et utilisez l’objectif de grossissement 10x et / ou 20x pour analyser la coloration par rapport aux tissus témoins (irradiés simulés). Si le microscope est équipé d’une caméra, des images peuvent également être prises. Prenez des images pour chaque canal séparément et fusionnez-les plus tard.
    REMARQUE: La procédure peut être arrêtée ici; les lames peuvent être stockées à 4 °C et analysées ultérieurement. Ne conservez pas les lames plus de 14 jours, car les taches s’estompent lentement.

6. Coloration TUNEL

  1. Refroidir les cassettes histologiques contenant des échantillons de tissus contenant de la paraffine en les plaçant sur de la glace pendant au moins 1 h. À l’aide d’un microtome, préparer des sections de 5 μm d’épaisseur pour la coloration. Chaque tissu doit être tranché horizontalement pour couvrir tout l’échantillon roulé.
    1. Après avoir coupé le bloc de paraffine, transférer les sections de tissu dans un bain-marie chauffé à 45 °C et placer les sections sur des lames chargées. Laissez sécher les lames sur une grille pendant la nuit à température ambiante.
      REMARQUE: La procédure peut être arrêtée ici et les lames peuvent être stockées à température ambiante.
  2. Placez les lames dans un support à glissière et faites cuire dans un four à 65 °C pendant la nuit.
    REMARQUE: Les lames peuvent être cuites pour un temps plus court, 1-2 heures. Cependant, il n’est pas conseillé dans le cas de lames fraîchement coupées (il y a moins de 1 mois). Placez le kit de coloration manuelle sous la hotte chimique et effectuez les incubations avec du xylène et de l’éthanol sous la hotte chimique.
  3. Le lendemain, refroidissez les lames en les plaçant dans un support de glissière sous le capot chimique pendant 10 min.
  4. Déparaffiniser les tissus en plaçant le porte-lames dans un récipient rempli à 100% de xylène pendant 3 min. Répéter l’incubation en utilisant du xylène frais à 100%.
    REMARQUE : À partir de ce moment, assurez-vous que les spécimens sont conservés humides en tout temps.
  5. Réhydrater les sections dans un gradient d’éthanol en plaçant séquentiellement le porte-lames dans des récipients remplis des solutions suivantes: 100% éthanol, 3 min; 95% d’éthanol, 3 min; 90% d’éthanol, 3 min; 80% d’éthanol, 3 min; 70% d’éthanol, 3 min.
  6. Transférer le support de glissière dans un récipient rempli d’eau distillée et rincer à l’eau distillée courante pendant 1 min.
  7. Retirez les lames du support (une à la fois), tapotez sur une serviette en papier et séchez soigneusement la zone autour du spécimen avec une serviette en papier. Dessinez une forme fermée autour de l’échantillon à l’aide d’un stylo qui fournit une barrière hydrophobe (stylo PAP). Placer dans une chambre humidifiée.
  8. Incuber avec la protéinase K sans DNase. Ajouter 100 μL de la solution de protéinase K sans DNase (dilution 1:25 dans la DPBS) sur la surface de l’échantillon à l’intérieur de la barrière hydrophobe. Incuber à température ambiante dans une chambre humidifiée pendant 15 min.
    ATTENTION : La protéinase K est une substance potentiellement dangereuse : danger pour la santé (H315 - H319 - H334).
  9. Retirer la solution de protéinase K en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier; placer les lames dans un support de diapositive et les transférer dans le récipient rempli de DPBS. Laver les lames en agitant pendant 5 min. Répéter 2x. Chaque fois, utilisez une nouvelle portion de DPBS.
  10. Préparer le mélange réactionnel TUNEL : Mélanger la solution étiquetée (1x) avec la solution enzymatique (10x). Pipette bien.
  11. Retirez les diapositives du support (une à la fois); Retirez l’excès de solution de lavage en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier et placez-la dans une chambre humidifiée. Ajouter 50 μL de mélange réactionnel TUNEL sur la surface de l’échantillon et incuber dans l’obscurité à 37 °C dans une chambre humidifiée pendant 60 min. Pour un témoin négatif, utiliser uniquement la solution d’étiquetage (sans TdT).
  12. Retirez la solution TUNEL en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier; placer les lames dans un support de diapositive et les transférer dans un récipient rempli de DPBS. Laver les lames en agitant pendant 5 min. Répéter 2x. Chaque fois, utilisez une nouvelle portion de DPBS.
  13. Retirez les diapositives du support (une à la fois); Retirez l’excès de solution de lavage en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier et placez-la dans une chambre humidifiée. Effectuer la contre-coloration Hoechst 33258 en ajoutant 100 μL de la solution Hoechst 33258 (dilution 1:1000 dans TBS-Tween) sur la surface de l’échantillon. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 5 min.
  14. Retirer la solution de Hoechst 33258 en tapotant la lame de verre sur une serviette en papier; placer les lames dans un support de diapositive et les transférer dans le récipient rempli de DPBS. Laver les lames en agitant pendant 5 min.
  15. Retirez la glissière du support de glissière; Sécher la zone autour des tissus à l’aide d’une serviette en papier et, selon la taille de l’échantillon, ajouter une goutte ou deux de milieu de montage à base d’eau sur la surface de l’échantillon. Montez en plaçant doucement un couvercle sur la lame de verre (veillez à ne pas laisser de bulles d’air). Appuyez doucement si nécessaire. Toute la surface du verre doit être couverte et scellée.
  16. Sécher les lames en les laissant dans l’obscurité à température ambiante pendant la nuit. En règle générale, le support de montage se solidifie en moins de 24 h. Pour s’assurer que les lames sont sèches, un échantillon de lames peut être fait. Placez une goutte du support de montage et laissez dans l’obscurité à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, touchez la goutte et vérifiez si elle est solidifiée.
  17. Lorsque les lames sèchent, les tissus colorés peuvent être analysés à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de filtres de longueur d’onde d’émission permettant la visualisation de la coloration TUNEL (535 nm).
  18. Placez une lame de microscope sur la scène, déplacez-vous jusqu’à ce que l’échantillon soit au centre du champ de vision, ajustez la mise au point à l’aide du bouton de mise au point et utilisez un objectif de grossissement 10x et / ou 20x pour analyser la coloration par rapport aux tissus témoins (irradiés simulés). Si le microscope est équipé d’une caméra, des images peuvent également être prises. Prenez des images pour chaque canal séparément et fusionnez-les plus tard.
    REMARQUE: La procédure peut être arrêtée ici; les lames peuvent être stockées à 4 °C et analysées ultérieurement. Ne conservez pas les lames plus de 14 jours, car les taches s’estompent lentement.

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Résultats

L’utilisation de l’irradiation totale du corps (TBI) de 12 Gy en combinaison avec le traçage génétique murin de la lignée permet une analyse approfondie des conséquences des lésions radiologiques dans l’intestin. Pour commencer, Bmi1-CreER; Les souris Rosa26eYFP ont reçu une seule injection de tamoxifène, ce qui induit une expression améliorée de la protéine fluorescente jaune (EYFP) au sein d’une population de cellules souches de réserve Bmi1+ . Deux jours après l’injection de t...

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Discussion

Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il permet l’analyse précise des changements dans l’épithélium intestinal au cours des 7 jours suivant la blessure. Il est important de noter que les points temporels sélectionnés reflètent les étapes cruciales de la lésion et sont caractérisés par des altérations distinctes de l’intestin (phases de lésion, d’apoptose, de régénération et de normalisation)60. Ce modèle d’irradiation a été établi et soigneusement évalué, ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pour son expertise dans la préparation des échantillons de tissus et la Division of Laboratory Animal Resources de l’Université Stony Brook pour son aide en matière de soins et de manipulation des animaux. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health DK124342 accordées à Agnieszka B. Bialkowska et DK052230 au Dr Vincent W. Yang.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 1 mLBD
309659-16G Aiguilles réutilisables pour petits animaux : DroiteVWR20068-630-27G
x 1/2 » aiguilleBD
305109-28G x 1/2 » Monoject 1mL seringue à insulineCovidien
1188128012-5-Ethynyl-2&prime ;-deoxyuridine (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL dans du DMSO stérile : eau (1:4 v/v), aliquote et entreposer à -20° ; C
Azer Scientific  ; 10 % de formol tamponné neutreFisher Scientific22-026-213-B6.129X1-Gt
(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JThe Jackson LaboratorySouche # :006148
B6 ; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain # :010531
Albumine sérique bovine Fraction V, choc thermiqueMillipore-Sigma3116956001
Poulet anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 kit d’imagerie, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-Huile
de maïsMillipore-SigmaC8267-Chambre
de dévoilementBiocare MedicalDC2012-Sulfoxyde
de diméthyle (DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100DNaase sensible à la lumière
protéinase KInvitrogenC10618Hdiluée 25x dans DPBS
Donkey anti-poulet AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-Eosin
FisherScientific S176
Microscope à fluorescence Nikon Eclipse 90i Lumière vive et fluorescente, avec objectifs : 10X, 20XNikon
Fluoromount Montage aqueux MediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy min-1
Chèvre anti-lapin AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Solution d’hématoxyline, Gill n° 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Microtome rotatif de Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, pentahydraté (bis-benzimide)Thermo Fisher ScientificH3569dilution 1:1000
Solution de peroxyde d’hydrogène, ACS, 29-32 %, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-Kit
détection de la mort cellulaire in situ, fluorescéine (Roche)Millipore-Sigma11684795910
bloqueur de liquide Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Carbonate de lithium (poudre/certifié ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000,5 g/1 L dH2O
Seringue Luer-Lok stérile, usage unique, 10 mLVWR89215-218-Méthanol
VWRBDH1135-4LP
Produits Pharmco. Alcool éthylique, 200 PROOFFisher Scientific
NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acide acétique ACS GradeCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-Rabbit
anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Milieu de montageFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie pour la cuisson de lames à 65 degrésFisher Scientific50-728-103
Citrate de sodium dihydratéFisher ScientificS279-500
Kit de dissection en acier inoxydableVWR25640-002
Superfrost Plus micro lames [taille : 25 x 75 x 1 mm]VWR  ; 48311-703
TamoxifèneMillipore-SigmaT564830 mg/mL dans de l’huile de maïs stérile, de préférence fraîche ou à court terme à -20° ; C, sensible à la lumière
Tissue-Tek 24-Slide Supports avec poignée amovibleSakura4465
Tissue-Tek  ; Accu-Edge  ; Lames à profil basSakura4689
Tissue-tek  ; Kit de coloration manuelleSakura4451
Tissue-Tek Plat de coloration, vert avec couvercleSakura4456
Tissue Tek Staining Dish, blanc avec couvercleSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette Cassettes de traitementVWR87002-292-VWR
Micro Cover GlassesVWR48393-081
XyleneFisher ScientificX5P-1GAL
de

Références

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