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Article de méthode

Génération d’organoïdes rétiniens dérivés d’iPSC chez un patient humain pour modéliser la rétinite pigmentaire

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⸱

DOI :

10.3791/64045

⸱

16 juin 2022

 ,  , 
1Beijing Tongren Hospital, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory, Beijing Tongren Eye Center, Capital Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans ce protocole, des organoïdes rétiniens 3D dérivés de cellules souches pluripotentes (iPSC) induits par un patient atteint de rétinite pigmentaire ont été générés. Ces organoïdes ont réussi à récapituler certains phénotypes cliniques de la maladie de la rétinite pigmentaire.

Résumé

La rétinite pigmentaire (RP) est une maladie dégénérative rétinienne rare et héréditaire dont la prévalence est d’environ 1/4 000 de personnes dans le monde. La majorité des patients atteints de RP présentent une dégénérescence progressive des photorécepteurs entraînant une perte de vision périphérique, une cécité nocturne et, enfin, une cécité totale. À ce jour, des milliers de mutations dans plus de 90 gènes ont été signalées comme étant associées à la RP. Actuellement, il existe peu de modèles animaux disponibles pour tous les gènes affectés et les différents types de mutations, ce qui entrave largement le déchiffrage des mécanismes sous-jacents à la pathologie des gènes/mutations et limite le traitement et le développement de médicaments. Les organoïdes rétiniens (RO) 3D dérivés de cellules souches pluripotentes induites par le patient (iPSC) ont fourni un meilleur système pour modéliser la maladie précoce humaine que les cellules et les animaux. Afin d’étudier la RP, ces organoïdes rétiniens 3D dérivés de patients ont été utilisés pour récapituler les phénotypes cliniques de la RP. Dans les RO dérivées de patients RP, la mauvaise localisation de la rhodopsine était clairement mise en évidence. Par rapport à d’autres modèles animaux, les modèles d’organoïdes rétiniens dérivés d’iPSC de patients récapitulent plus fidèlement les caractéristiques de la RP et représentent une approche idéale pour l’étude de la pathogenèse de la maladie et pour le développement de médicaments.

Introduction

Les maladies de la rétine humaine, telles que la rétinite pigmentaire et la dégénérescence maculaire liée à l’âge, sont mal comprises en raison du manque de modèles expérimentaux appropriés 1,2. Bien que la rétine de la souris soit très similaire à la rétine humaine et qu’elle soit un outil puissant pour étudier l’étiologie de la dégénérescence rétinienne, il existe d’énormes différences d’espèces entre les souris et les humains 3,4. Par exemple, l’architecture nucléaire des cellules photoréceptrices chez la souris et l’homme est différente, et la rétine de la souris ne possède pas de macula 5,6. La technologie des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) nous permet de ramener les cellules spécialisées des organismes à l’état pluripotent initial grâce aux processus de « reprogrammation » par des combinaisons de facteurs de transcription et/ou de composés 7,8,9,10. Ces iPSC ont une capacité de division et de prolifération presque illimitée et pourraient se développer en divers types de cellules. Récemment, des organoïdes rétiniens 3D dérivés d’iPSC ont été développés pour modéliser les événements précoces du développement de la rétine humaine et pour délimiter la physiopathologie des maladies rétiniennes humaines 11,12,13,14,15. Les organoïdes rétiniens présentent de nombreux avantages : (1) ils peuvent être utilisés pour récapituler in vivo le développement rétinien et la pathogenèse de la maladie ; (2) ils peuvent être utilisés pour le criblage de médicaments à haut débit et les essais précliniques de thérapie génique ; et (3) ils peuvent être utilisés comme évaluations précliniques des options de traitement des maladies dégénératives de la rétine16,17.

L’un des objectifs de ce projet était d’étudier la pathogenèse de la pigmentose rétinienne (RP), une maladie qui reste incurable en raison de son extrême hétérogénéité18. À ce jour, plus de 90 gènes ont été identifiés comme étant associés à RP19,20. Le gène RPGR, qui est considéré comme l’un des gènes causaux les plus répandus de RP15, représente environ 16 % de tous les RP 4,21,22. Des iPSC porteuses d’une mutation de décalage de cadre dans le gène RPGR ont été générées et différenciées avec succès en organoïdes rétiniens 3D organisés et stratifiés14. En utilisant ces organoïdes, une morphologie anormale de la couche photorécepteur et la dislocation des opsines dans les photorécepteurs ont été observées.

Dans l’ensemble, un protocole étape par étape et accessible est décrit en détail ici sur la façon de générer des organoïdes rétiniens 3D dérivés du patient23,24. Ces organoïdes ont réussi à récapituler certains phénotypes cliniques de la maladie. Il s’agit d’un modèle encourageant pour étudier le développement de la rétine et les mécanismes de la maladie, pour le dépistage thérapeutique et pour évaluer la future thérapie génique préclinique.

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Protocole

Le protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine de la Capital Medical University.

1. Culture cellulaire et génération d’iPSC

  1. Choisissez des patients RPGR pour cette étude. Ici, trois patients, un porteur familial et trois témoins sains, ont été utilisés. Le patient 1 possédait une mutation c.1685_1686delAT dans l’exon 14 du gène RPGR, le patient 2 présentait une mutation c.2234_2235delGA dans l’exon 15 du gène RPGR et le patient 3 avait une mutation c.2403_2404delAG dans l’exon 15 du gène RPGR. Choisissez trois volontaires sains comme témoins14. Prélever des échantillons de sang total périphérique des patients et des témoins sains par ponction veineuse, et les mettre dans des tubes de prélèvement sanguin (Table des matériaux).
  2. Isoler les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par centrifugation à gradient de densité avec un milieu à gradient de densité25. Développer les PBMC CD34+ activés par des cytokines dans 8 mL de milieu d’amélioration de la croissance (tableau 1) dans une boîte de Pétri.
  3. Après 1 semaine, électroporatez les cellules mononucléées du sang périphérique CD34-positives avec un système de transfection (Table des matériaux) et choisissez les cellules CD34-positives et le programme T-01 intégré sans aucune modification. Transfect un cocktail de plasmides de reprogrammation (2 μg) qui pourraient produire des protéines humaines OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC et KLF4.
  4. Ensemencez les cellules transfectées dans des plaques à six puits recouvertes de protéines recombinantes humaines de vitronectine dans 2 mL de DMEM/F12 complété par B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) et hLIF (1000 U/mL) pour maintenir la croissance des iPSC.
  5. 3 semaines après la transduction, prélevez manuellement les colonies d’iPSC, transférez-les ensuite dans des plaques à six puits et maintenez-les dans le réactif B (Table des matériaux) pour l’expansion.
    REMARQUE : Les plaques à six puits doivent être recouvertes de protéine recombinante humaine de vitronectine. Diluer une solution de vitronectine dans du DPBS pour atteindre une concentration finale de 10 μg/mL. Ajoutez la vitronectine diluée dans des plaques à six puits traitées par culture tissulaire. Faites tourner la vaisselle de culture pour répartir uniformément la solution de vitronectine sur la surface des plaques à six puits. Incuber les plaques à 37 °C pendant au moins 1 h.
  6. Assurez-vous que les cellules sont désagrégées avec 0,5 mM d’EDTA lorsque les iPSC atteignent une confluence d’environ 80 % à 90 % et que le rapport de séparation est de 1:8 ou 1:10. Le jour du passage, ajouter la blébbistatine (2,5 μM) au réactif B (tableau 1).
    REMARQUE : La blébbistatine a été utilisée pour favoriser l’adhésion cellulaire et la viabilité des cellules souches et prévenir l’apoptose des cellules souches. 18 h plus tard, le milieu doit être rafraîchi avec le réactif B.

2. Génération d’OI humaines

REMARQUE : Les iPSC doivent être dissociés lorsqu’ils atteignent environ 80 %-90 % de confluence.

  1. Dissocier les colonies humaines d’iPSC (hiPSC) à l’aide de 0,5 mM d’EDTA à 37 °C pendant 5 min.
  2. Séparez les amas de hiPSC en cellules uniques par pipetage doux. Comptez les cellules pour l’entretien et cultivez-les dans le réactif B (tableau 1).
  3. Le jour 0, ensemencer 12 000 cellules/puits dans 96 puits coniques à fond en V pour la réagrégation cellulaire dans 100 μL de milieu de différenciation (tableau 1).
  4. Le jour 6, aspirer soigneusement le milieu de culture cellulaire et ajouter 100 μL du milieu de différenciation contenant 20 μM Y 27632 et 1,5 nM (55 ng/mL) hBMP4.
  5. Le jour 9, remplacez la moitié du milieu de différenciation pour maintenir la concentration de hBMP4 à environ 0,75 nM.
  6. Prélever 60 μL du milieu de différenciation de chaque puits et ajouter 60 μL du milieu de différenciation frais contenant 20 μM d’Y-27632 dans chaque puits.
  7. Le 12e jour, remplacer la moitié du milieu de différenciation par un milieu de différenciation frais pour obtenir 0,375 nM hBMP4.
  8. Le 18e jour, transférez les agrégats dans une nouvelle boîte de Pétri avec des pointes de 10 ml et coupez chaque agrégat en 2 à 4 morceaux avec un couteau microchirurgical sous un microscope inversé pour générer plus d’organoïdes.
  9. Transférez les agrégats du même groupe dans un tube à centrifuger de 15 ml. Lorsque les agrégats se déposent au fond des tubes, aspirez le surnageant.
  10. Remettre les agrégats en suspension avec 1 mL de milieu neural rétinien (DMEM/F12, 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de supplément N-2, 0,5 μM d’acide rétinoïque, 0,1 mM de taurine, 1 % de pénicilline-streptomycine) et les transférer dans des boîtes de Pétri antiadhésives contenant 15 mL de milieu neural pour la rétine. Mettez 10 à 15 organoïdes rétiniens dans une boîte de Pétri.
  11. Rafraîchissez le milieu de culture tous les 5 jours. Maintenez la culture dans l’obscurité car l’acide rétinoïque est sensible à la lumière (Figure 1) et vérifiez la formation du tissu rétinien humain auto-organisateur avec un microscope inversé 26,27,28,29.

3. Analyse des organoïdes rétiniens

  1. Coloration par immunofluorescence de rétines 3D dérivées de hiPSC
    1. Fixez les rétines 3D dans 1 mL de paraformaldéhyde frais à 4 % dans du DPBS pendant 20 min à 4 °C. Ensuite, rincez les organoïdes avec 1 mL de tampon DPBS.
    2. Mesurer 0,5 g d’agarose (tableau des matériaux) et mélanger la poudre d’agarose avec 100 ml de DPBS dans une fiole allant au micro-ondes. À l’aide d’un micro-ondes, dissoudre l’agarose pendant 1 à 3 minutes jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute. Laissez refroidir la solution d’agarose à environ 40 °C.
    3. Intégrez-les dans 2 % dans DPBS.
    4. Découpez les échantillons en sections d’une épaisseur de 50 μm à l’aide d’un vibratome. Placez les coupes coupées sur des lames de microscope à adhérence (tableau des matériaux) et stockez-les à -80 °C.
    5. Décongeler les tranches pendant 15 min à température ambiante (RT).
    6. Lavez les tranches avec du DPBS pendant 5 minutes et répétez 3 fois.
    7. Utilisez 0,5 % de Triton X-100 dans une solution DPBS pour perméabiliser les tranches pendant 15 minutes à RT.
    8. Retirez la solution de perméabilisation, lavez les tranches avec du DPBS pendant 5 minutes et répétez l’opération 3 fois.
    9. Incuber les tranches avec 1 % de BSA et 0,5 % de Triton X-100 dans DPBS pendant 30 min à RT.
    10. Incuber les tranches avec un anticorps anti-Rhodopsine (1:1000) et un anticorps anti-L/M opsine (1:1000) dilués dans 1 % BSA et 0,1 % Triton X-100 pendant 16 h à 4 °C.
    11. Lavez les tranches avec du DPBS pendant 5 minutes et répétez 3 fois.
    12. Incuber les tranches avec l’anticorps anti-souris d’âne et l’anticorps secondaire de lapin (1:500) dilué dans 1 % de BSA et 0,1 % de Triton X-100 pendant 1 h à RT.
    13. Ajouter 30 nM de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans le DPBS pendant 15 min à RT pour la coloration nucléaire.
    14. Lavez les tranches avec du DPBS pendant 5 minutes et répétez l’opération 5 fois.
    15. Montez les tranches avec le support d’enrobage (Table des matériaux) et recouvrez les lames (Table des matériaux). Conserver dans une boîte sombre et conserver à 4 °C jusqu’à 4 semaines.
  2. Extraction et séquençage de l’ARN
    1. Prélever 1 à 3 (selon les tailles) rétines 3D dérivées de chaque témoin et patient aux mêmes points de différenciation (jour 0, jour 47, jour 91, jour 121 et jour 151) dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN (Table des matériaux) sur glace.
    2. Utilisez l’homogénéisateur (table des matériaux) pour perturber les échantillons, 1 min ON, 30 s OFF, pendant trois cycles, et vérifiez que l’échantillon n’est pas perturbé.
    3. Arrêtez l’homogénéisation lorsque les échantillons sont totalement homogénéisés et faites tourner vigoureusement le tube pendant 30 s.
    4. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 15 min.
    5. Centrifuger les échantillons à 13 800 x g pendant 15 min à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau tube sans RNase de 2 mL.
    6. Ajouter 0,4 mL de chloroforme dans le tube, le vortex et la centrifugeuse à 13 800 x g pendant 10 min à 4 °C.
    7. Transférez soigneusement une partie (environ 2/3) de la phase supérieure incolore dans un nouveau tube sans RNase. N’aspirez pas et ne dérangez pas l’interface blanche contenant l’ADN.
    8. Ajouter 0,5 mL d’isopropanol froid, agiter pendant 30 s et centrifuger à 13 800 x g pendant 15 min à 4 °C. Une pastille se forme sur le côté du fond du tube.
    9. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et conservez la pastille.
      REMARQUE : La pastille d’ARN est gélatineuse et transparente lorsque la pureté est très élevée.
    10. Ajouter 1 mL d’éthanol froid à 70 %, agiter vigoureusement les échantillons pendant 30 s et centrifuger à 13 800 x g pendant 10 min à 4 °C.
    11. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et faites sécher la pastille à l’air libre dans la hotte à RT pendant 5 à 10 min. Ne séchez pas trop le granulé.
    12. Ajoutez 20 à 50 μL d’eau exempte de RNase et remettez la pastille en suspension avec précaution en le pipetant de haut en bas.
    13. Appliquer 1 μL d’ARN sur un spectrophotomètre (Table des matériaux). Au total, environ 10 μg d’ARN provenant respectivement de témoins et de patients ont été utilisés pour la préparation de la banque Illumina30.
    14. Stockez l’ARN à −80 °C.

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Résultats

L’illustration schématique décrit les procédures de différenciation pour générer des organoïdes rétiniens sains et dérivés d’iPSC de patients (Figure 1). Des iPSC aux OI, des variations peuvent être produites en raison de plusieurs facteurs. Le statut de l’iPSC est l’étape déterminante de la génération de l’OI. De plus, il est fortement recommandé aux chercheurs d’enregistrer chaque étape, catalogue et numéro de lot de tous les supports afin que l’ensemble des expériences puisse être suivi. ...

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Discussion

Les organoïdes rétiniens sont des structures laminées en 3D dérivées de cellules souches embryonnaires (CSE) et constituent un modèle très prometteur pour imiter les modèles spatiaux et temporels du développement rétinien humain31,32. Les RO sont constitués de différents types de cellules rétiniennes, notamment des photorécepteurs, des cellules bipolaires, des cellules ganglionnaires, des cellules amacrines, des cellules horizont...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions M.S. Yan-ping Li et Zhuo-lin Liu pour leur soutien technique et leurs commentaires utiles concernant le manuscrit. Ce travail a été en partie soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), la Fondation municipale des sciences naturelles de Pékin (Z200014, 82125007) et le Programme national de R-D clé de Chine (2017YFA0105300).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
96 puits coniques à fond en VSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83&ndash ; 01R& D Systems2939/10
Lames de microscope à adhésionCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Système de transfection
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR& D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Tube de prélèvement sanguinBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Lames de couvertureCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham' s F12Gibco10565-042
Âne anti-souris 488InvitrogenA-21202
Âne anti-lapin 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Milieu d’enrobageFluorSaveTM Réactif345789
EX-CYTE milieu d’amélioration de la croissanceSigma811292Amélioration de la croissance moyenne
Sérum fœtal bovinGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Gradient de densité moyen
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061Supplément de L-glutamine
HA-100STEMCELL Technologies72482
Jambon s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogénéisateurEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove' s Modified Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Serum Replacement - Multi-SpeciesGibcoA3181502Milieu de remplacement sérique
L/M-opsinMilliporeab5405
MonothioglycérolSigmaM6145
N-2supplément Thermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop SpectrophotomètreThermo Fisher ScientificND2000Spectrophotomètre
ncEpic 125x SupplémentNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Supplément
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basal hpsc
medium ncLaminin511 protéine recombinante humaineNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Pénicilline-streptomycineGibco15140-122
BMP4 humain recombinantR& D Systems314-BP
Acide rétinoïqueSigmaR2625
RhodopsinSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
TaurineSigmaT8691
Réactif TrizolInvitrogen15596026
VitronectineNuwacell BiotechnologiesRP01002
Couteau V-LanceAlcon Surgical8065912001

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Cellules souches pluripotentes induitesd g n rescence des photor cepteursorgano des d riv s de patientsmauvaise localisation de la rhodopsined g n rescence r tiniennemod lisation de maladiesd veloppement de m dicamentsmutation g n tique

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