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Spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde pour l’étude de la dynamique structurelle de l’alpha-synucléine dans des conditions physiologiques

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DOI :

10.3791/64050

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23 juin 2022

 , 
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

Dans cet article

Résumé

L’ensemble structurel de l’alpha-synucléine monomérique affecte sa fonction physiologique et ses propriétés physico-chimiques. Le présent protocole décrit comment effectuer une spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde et des analyses de données ultérieures pour déterminer des informations conformationnelles sur le monomère de cette protéine intrinsèquement désordonnée dans des conditions physiologiques.

Résumé

L’alpha-synucléine (aSyn) est une protéine intrinsèquement désordonnée dont les agrégats fibrillaires sont abondants dans les corps de Lewy et les neurites, qui sont les caractéristiques de la maladie de Parkinson. Pourtant, une grande partie de son activité biologique, ainsi que son agrégation, implique de manière centrale la forme monomère soluble de la protéine. L’élucidation des mécanismes moléculaires de la biologie et de la physiopathologie d’aSyn nécessite des méthodes structurellement très résolues et est sensible aux conditions biologiques. Ses structures méta-stables dépliées nativement rendent l’aSyn monomère intraitable à de nombreuses techniques de biologie structurale. Ici, l’application d’une telle approche est décrite: spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium (HDX-MS) sur l’échelle de temps de la milliseconde pour l’étude de protéines à faible stabilité thermodynamique et à faibles facteurs de protection, tels que aSyn. À l’échelle de temps de la milliseconde, les données HDX-MS contiennent des informations sur l’accessibilité des solvants et la structure liée à l’hydrogène d’aSyn, qui sont perdues à des temps d’étiquetage plus longs, ce qui donne finalement une résolution structurelle jusqu’au niveau d’acide aminé. Par conséquent, HDX-MS peut fournir des informations à des résolutions structurelles et temporelles élevées sur la dynamique conformationnelle et la thermodynamique, les interactions intra- et intermoléculaires et l’impact structurel des mutations ou des altérations des conditions environnementales. Bien que largement applicable, il est démontré comment acquérir, analyser et interpréter des mesures HDX-MS millisecondes dans aSyn monomère.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative qui touche des millions de personnes dans le monde1. Elle se caractérise par la formation d’inclusions cytoplasmiques connues sous le nom de corps de Lewy et de neurites de Lewy dans la région de la substantia nigra pars compacta du cerveau. Ces inclusions cytoplasmiques contiennent des agrégats de la protéine intrinsèquement désordonnée aSyn2. Dans la MP et d’autres synucléinopathies, aSyn se transforme d’un état désordonné soluble en un état malade insoluble et hautement structuré. Dans sa forme native, l’aSyn monomère adopte une large gamme de conformations stabilisées par des interactions électrostatiques à longue portée entre ses N- et C-termini et des interactions hydrophobes entre son terminus C et sa région NAC (NAC) 3,4,5,6. Toute perturbation de ces interactions stabilisatrices, telles que les mutations, les modifications post-traductionnelles et les changements dans l’environnement local, peut conduire à un mauvais repliement du monomère, déclenchant ainsi le processus d’agrégation7.

Bien qu’il existe une grande quantité de recherches sur les formes oligomères et fibrillaires d’aSyn 8,9,10,11, il est crucial d’étudier la forme monomère de la protéine et de mieux comprendre quels conformateurs sont fonctionnels (et comment) et lesquels sont sujets à l’agrégation 8,9,10,11 . Étant intrinsèquement désordonné, de seulement 14 kDa et difficile à cristalliser, le monomère aSyn ne se prête pas à la plupart des techniques biologiques structurelles. Cependant, une technique capable de mesurer la dynamique conformationnelle de l’aSyn monomère est la milliseconde HDX-MS, qui a récemment généré d’importantes observations structurelles qui seraient difficiles ou impossibles à obtenir autrement 12,13,14. Milliseconde HDX-MS mesure avec sensibilité la moyenne de l’ensemble conformationnel protéique en surveillant l’échange isotopique au niveau des hydrogènes amides, indiquant l’accessibilité au solvant et la participation au réseau de liaison hydrogène d’une région protéique particulière sur l’échelle de temps de la milliseconde. Il est nécessaire de souligner l’aspect milliseconde du HDX-MS car, en raison de sa nature méta-stable et dépliée nativement, aSyn présente une cinétique d’échange d’hydrogène très rapide qui se manifeste bien en dessous de la limite inférieure des systèmes HDX-MS conventionnels. Par exemple, la majeure partie de la molécule aSyn a complètement échangé de l’hydrogène contre du deutérium dans des conditions intracellulaires en moins de 1 s. Plusieurs laboratoires ont maintenant construit des instruments à mélange rapide; dans ce cas, un prototype d’instrument à flux de trempe à mélange rapide capable d’effectuer HDX-MS avec un temps mort de 50 ms et une résolution temporelle de 1 ms est utilisé15. Bien que la milliseconde HDX-MS ait récemment été extrêmement importante dans l’étude d’aSyn, elle est précieuse pour étudier plus largement les protéines /régions intrinsèquement désordonnées et un grand nombre de protéines dont les boucles / régions ne sont que faiblement stables. Par exemple, les médicaments peptidiques (p. ex., l’insuline; GLP-1/glucagon; tirzépatide) et les protéines de fusion peptidique (par exemple, l’inhibiteur du VIH FN3-L35-T1144) sont des formats de médicaments majeurs où les informations structurelles et de stabilité en phase de solution peuvent être un intrant critique pour les décisions de développement de médicaments, et, pourtant, la fraction peptidique n’est souvent que faiblement stable et intraitable par HDX-MS à l’échelle de tempsde seconde 16,17,18,19,20 . Il a été démontré que les méthodes émergentes HDX-MS avec marquage dans les domaines secondes/minutes dérivent des informations structurelles pour les quadruplex G de l’ADN, mais il devrait être possible de les étendre à des structures oligonucléotidiques plus diverses par l’application de HDX-MS21 millisecondes.

Les expériences HDX-MS peuvent être réalisées à trois niveaux différents : (1) ascendant (où la protéine marquée est digérée protéolytiquement), (2) intermédiaire (où la protéine marquée est digérée protéolytiquement, et les peptides résultants sont fragmentés davantage par des techniques de fragmentation douce), et (3) descendant (où les techniques de fragmentation douce fragmentent directement la protéine marquée)22 . Ainsi, les données hdX-MS sous-moléculaires nous permettent de localiser le comportement d’échange dans des régions spécifiques d’une protéine, ce qui rend essentiel d’avoir une couverture de séquence adéquate pour de telles expériences. La résolution structurelle de toute expérience HDX-MS repose sur le nombre de peptides protéolytiques ou de fragments dérivés de la protéine lors de la digestion ou de la fragmentation douce, respectivement. Dans chacun des trois types d’expériences décrits ci-dessus, le changement d’échange d’amide à chaque peptide / fragment est mappé sur la structure primaire de la protéine pour indiquer le comportement des régions localisées de la protéine. Bien que la résolution structurelle la plus élevée soit obtenue par fragmentation douce, la description de ces expériences est hors du cadre de la présente étude, qui se concentre sur la mesure des conformations de monomères aSyn. D’excellents résultats peuvent être obtenus avec le flux de travail « ascendant » couramment appliqué décrit ici.

Ici, des procédures sont fournies sur (1) comment préparer et manipuler des échantillons aSyn et des tampons HDX-MS, (2) comment effectuer une cartographie peptidique pour une expérience HDX-MS ascendante, (3) comment acquérir des données HDX-MS sur aSyn monomère dans des conditions physiologiques, en particulier dans le domaine temporel milliseconde (en utilisant un instrument personnalisé; des instruments alternatifs pour le marquage milliseconde ont également été décrits), et (4) comment traiter et analyser les données HDX-MS. Les méthodes utilisant l’aSyn monomère à pH physiologique (7,40) dans deux conditions de solution sont illustrées ici. Bien qu’elles soient d’une utilité critique dans l’étude d’aSyn, ces procédures peuvent être appliquées à n’importe quelle protéine et ne se limitent pas aux protéines intrinsèquement désordonnées.

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Protocole

1. Expression des protéines et purification d’aSyn

  1. Préparez aSyn à la suite d’un rapport9 publié précédemment.
  2. Dialyze dans un tampon de stockage sûr (par exemple, Tris, pH 7,2 ).
  3. Au besoin, concentrer l’échantillon (p. ex., tubes de microcentrifugation à filtre rotatif utilisant 3 kDa MWCO, 14 000 x g pendant environ 10 à 30 min, voir tableau des matériaux).
    REMARQUE: Il est conseillé de ne pas se concentrer excessivement. L’intégrité de l’ensemble monomère n’a pas été vérifiée au-delà de 25 μM.
  4. Aliquote et conserver à −80 °C
    REMARQUE: La protéine monomère aSyn est stable jusqu’à 1 an dans ces conditions de stockage.

2. Préparation du tampon HDX

REMARQUE: Étant donné que Tris a un coefficient de température élevé, la mesure du pH doit être ajustée en fonction de la température à laquelle la réaction HDX sera effectuée, qui est de 20 ° C dans ce protocole.

  1. Préparer un tampon d’équilibre pour l’état A et l’état B en pesant 0,002 mol de Tris dans 100 mL d’eau de qualité LC-MS. Pour l’état B, ajouter 29,8 mg de KCl, 14,2 mg de MgCl2, 36,8 g de CaCl2 et 836 mg de NaCl au tampon Tris. Ajustez le pH à 7,40 ± 0,05.
    REMARQUE: Le tampon d’équilibre doit contenir les conditions dans lesquelles aSyn doit être étudié. Dans ce cas, il s’agit de 20 mM de Tris à pH 7,4 +/− sels.
  2. Préparer le tampon d’étiquetage pour l’état A et l’état B en pesant 0,002 mol de Tris dans 100 mL d’eau deutérée. Pour l’état B, ajouter 29,8 mg de KCl, 14,2 mg de MgCl2, 36,8 g de CaCl2 et 836 mg de NaCl au tampon d’étiquetage Tris. Le du tampon d’étiquetage correspond au pH du tampon d’équilibre. Puisque pH = - 0,41, ajuster de sorte que le pH-mètre indique 6,99 ± 0,0523,24.
    REMARQUE: Le tampon d’étiquetage doit avoir les mêmes composants que le tampon d’équilibre, sauf qu’il est préparé à l’aide d’eau deutérée.
  3. Préparer un tampon de trempe en pesant 0,010 mol de Tris et 0,050 mol d’urée et compléter jusqu’à 100 mL avec de l’eau de qualité LC-MS. Ajuster le pH à 2,50 ± 0,05 à 0,5 °C.
    REMARQUE: Un écran de tampon de trempe doit être effectué avant les expériences HDX pour identifier le meilleur tampon de trempe pour la protéine d’intérêt. Différentes concentrations et combinaisons de dénaturants (p. ex. urée et chlorhydrate de guanidinium) et d’agents réducteurs (p. ex. tris(2-carboxyéthyl)phosphine) sont examinées, ainsi que des paramètres physiques tels que le volume et la température de piégeage, pour déplier et digérer efficacement la protéine trempée. Un tampon de trempe comprenant 100 mM de Tris et 0,5 M d’urée à un pH de 2,50 est optimal pour la présente étude.
  4. Préparer le tampon de lavage de la colonne de digestion en pesant 0,125 mol de chlorhydrate de guanidinium dans une bouteille en verre Duran. Ajouter 25 mL de méthanol et 250 μL d’acide formique. Compléter jusqu’à 250 mL avec de l’eau de qualité LC-MS.
    REMARQUE : Pour la colonne de pepsine Enzymate BEH (voir tableau des matériaux), utilisez un tampon de lavage de colonne de 0,5 M de chlorhydrate de guanidinium, de méthanol à 10 % (v/v) et d’acide formique à 0,1 % (v/v).
  5. Préparer le lavage faible de la seringue en pipetant 0,5 μL d’acide formique dans 249,5 mL d’eau de qualité LC-MS.
  6. Préparez le lavage fort de la seringue en mélangeant des parties égales d’eau de qualité LC-MS, de méthanol, d’acétonitrile et d’isopropanol. Ajouter l’acide formique à une concentration finale de 2 % (v/v).
    REMARQUE: Pour éviter la contamination croisée entre les différents tampons et la protéine et pour permettre le nettoyage de l’orifice d’injection, il est essentiel que des solutions de lavage à seringue soient préparées et que le chemin d’écoulement vers la valve (souvent appelé « doublure de lavage ») soit entièrement apprêté avec du liquide. L’acide formique est facultatif pour le lavage faible de la seringue.

3. Procédure de cartographie des peptides

  1. Préparez l’exemple en suivant l’étape ci-dessous.
    1. Filtrez le stock de protéines aSyn décongelé du congélateur à −80 °C avec des filtres à seringue de 0,22 μm. Mesurer l’absorbance de la protéine mère filtrée à 280 nm pour déterminer la concentration par la loi de Beer-Lambert. Diluer la protéine à une concentration de 5 μM dans le tampon d’équilibre (étape 2.1.).
      NOTE: La loi de Beer-Lambert: A = εcl, où A est l’absorbance, ε est le coefficient d’extinction de la protéine à la longueur d’onde mesurée (280 nm ici) avec les unités M−1cm−1, c est la concentration en protéines dans M, et l est la longueur du chemin en cm. Pour aSyn26 de type sauvage, ε = 5960 M−1cm−1.
  2. Configurez la méthode de chromatographie liquide.
    1. Créez un fichier d’entrée avec un temps de chargement/piégeage de 3 min à une pression de 7000-9000 psi, suivi d’un gradient de 5% d’acétonitrile à 40% d’acétonitrile en 7 min, suivi d’étapes de lavage répétées de 5% à 95% d’acétonitrile-eau pendant 10 min.
    2. S’assurer que le spray de verrouillage (p. ex. enképhaline de leucine, voir tableau des matériaux) s’écoule à 2000 psi et est connecté à la sonde de pulvérisation de verrouillage source du spectromètre de masse.
  3. Configurez les méthodes MSE de spectrométrie de masse.
    REMARQUE: MSE est une méthode d’acquisition indépendante des données à large bande sans isolation de masse précurseur. Par conséquent, tous les ions dans la plage m/z sélectionnée sont fragmentés davantage à l’aide de la dissociation induite par collision (CID)27.
    1. Dans le fichier de méthode MS, choisissez MSE Continuum et configurez un temps d’acquisition compris entre 2 et 10 minutes, une source d’électropulvérisation et un mode de résolution positive. Acquérez MSE sur 50-2000 Da, en scannant toutes les 0,3 s.
    2. Pour la fonction 1 (basse énergie), configurez le piège et transférez les énergies de collision à 4 V. Pour la fonction 2 (haute énergie), configurez l’énergie de collision de transfert de rampe pour qu’elle soit constante à 4 V et l’énergie de collision du piège comme indiqué dans le tableau 1 pour chaque niveau d’énergie de cartographie.
      REMARQUE: Les méthodes MSE de mobilité ionique peuvent également être utilisées. D’autres méthodes de cartographie (p. ex., acquisition dépendante des données ou DDA) peuvent être utilisées à la discrétion de l’utilisateur.
  4. Configurez le robot échantillonneur automatique (voir Tableau des matériaux).
    1. Ajouter 50 μL de la protéine 5 μM à un flacon de récupération totale. Placez le flacon en position d’échantillon dans la chambre droite HDX. Assurez-vous que cette chambre est à 0,5 °C.
    2. Ajouter un flacon de réactif de tampon d’équilibre et deux flacons de réactif de tampon d’étiquetage aux positions de réactif un, deux et trois dans la chambre gauche HDX. Assurez-vous que cette chambre est à 20 °C en réglant le régulateur de température Peltier (voir Tableau des matériaux). Ajoutez un flacon de réactif de tampon de trempe à la position de réactif un dans la chambre droite HDX.
    3. Ajouter huit flacons de récupération totale dans les positions de réaction de la chambre gauche HDX et huit flacons de récupération maximale dans les positions de réaction de la chambre droite HDX.
      REMARQUE: Pour assurer un nettoyage complet et une reproductibilité maximale des volumes distribués, il est conseillé d’effectuer un lavage à la seringue et un lavage d’amorçage sur les seringues d’échantillonnage automatique. Par exemple, exécutez une séquence de (1) lavage faible, (2) lavage fort, (3) lavage faible avant de commencer les expériences de cartographie. Cette séquence peut être répétée abondamment, et il est recommandé de le faire jusqu’à 20x ou jusqu’à ce que la seringue soit complètement mouillée.
    4. Configurez un exemple de liste avec les méthodes LC et MS appropriées dans le logiciel de planification et démarrez la planification.
      NOTE: Pour la présente étude, Chronos est utilisé comme logiciel de planification (voir Tableau des matériaux).
  5. Traiter les données cartographiques.
    1. Identifiez les peptides à partir des fichiers d’expérience de cartographie à l’aide d’un logiciel approprié (voir tableau des matériaux).
    2. Importez les données d’identification peptidique dans DynamX (voir tableau des matériaux) en utilisant les paramètres de seuil peptidique suivants : intensité minimale = 5000, longueur minimale de la séquence = 0, longueur maximale de la séquence = 40, produits minimaux = 1, produits minimaux par acide aminé = 0,25, produits consécutifs minimaux = 2, intensité de somme minimale pour les produits = 0, score minimum = 0 et erreur MH+ maximale (ppm) = 0.
      REMARQUE: Vous pouvez également dériver les paramètres optimisés en fonction d’un flux de travail recommandé28.
    3. Sélectionnez Données dans le menu et cliquez sur Importer les résultats PLGS. Cliquez sur Ajouter pour choisir les fichiers de données pertinents pour l’affectation spectrale. Lorsque tous ont été ajoutés, cliquez sur Suivant et entrez les paramètres de filtre ci-dessus. Ensuite, cliquez sur Terminer.
    4. Organisez manuellement des affectations isotopiques pour obtenir la carte finale de couverture peptidique d’aSyn dans DynamX.

4. Étude d’échange hydrogène/deutérium à la milliseconde

  1. Nettoyez l’instrument prototype FastHDX (voir Tableau des matériaux) avant de commencer les expériences HDX.
    1. Ouvrez l’interface graphique du logiciel HDX compatible et autorisez le système à s’initialiser.
    2. Entrez la température de la chambre d’échantillonnage à 20 °C et la chambre de trempe à 0,5 °C. Cliquez sur Définir pour appliquer les nouvelles températures.
    3. Installez les tubes de centrifugeuse avec de l’eau de qualité LC-MS à toutes les entrées.
    4. Dans l’onglet Livraison de plomberie du titreur , vérifiez les seringues gauche et droite et cliquez sur Prime pour éliminer les bulles d’air latentes dans les tubes. Répétez jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu.
    5. Dans l’onglet Macros , cochez toutes les cases correspondant aux seringues. Cliquez sur Calibrer la position d’accueil des seringues. Cliquez sur Wash Syringe Load Loop. Cliquez sur Laver tous les volumes de la boucle de mélange.
    6. Répétez l’étape 4.1.5. 1x plus.
    7. Si des bulles apparaissent dans les seringues tampons, dégazez en dégayant la seringue et en éjectant la bulle verticalement. Remplacez la seringue et recalibrez-la à la position zéro.
  2. Configurez l’instrument prototype FastHDX pour les expériences HDX.
    1. Ajouter 500 uL d’aSyn filtré de 5 μM dans un flacon de récupération totale et placer à l’intérieur d’un réfrigérateur de table pour éviter l’oligomérisation et l’agrégation induites par la température.
    2. Ajouter 50 mL de tampons d’équilibre, d’étiquetage et de trempe à chaque tampon (2. Préparation du tampon HDX étapes 1-3) entrée dans les chambres gauche et droite.
    3. Ajouter 50 mL de tampon de lavage de colonne (2. Préparation du tampon HDX étape 4) à l’entrée de lavage de la pepsine.
    4. Pour amorcer les lignes de lavage des protéines et des colonnes 1x, vérifiez les seringues gauche et droite dans l’onglet Livraison de plomberie du titreur et cliquez sur Prime une fois.
      REMARQUE: Tout clic ultérieur sur Prime entraînera des répétitions supplémentaires du processus prime, entraînant la consommation de grandes quantités d’échantillon de protéines. Il est conseillé d’éviter cela, même en cas de retard dans le logiciel après une tentative de clic sur un bouton.
    5. Répétez les étapes 4.1.5. 1x.
    6. Dans l’onglet Manual Quench Flow , entrez les paramètres requis, expliqués aux étapes 4.2.7.-4.2.10.
    7. Pour une expérience de cours temporel, entrez les temps en millisecondes à l’aide du bouton Points symboliques . Si des réplications sont nécessaires, ajoutez le même point temporel plusieurs fois, par exemple, pour un triple de 50 ms, 50 50 50 doivent être saisis. La liste d’exemples dans le logiciel de spectromètre de masse (MassLynx est utilisé ici, voir Tableau des matériaux) doit correspondre exactement à ces points temporels.
      REMARQUE: Les noms de fichiers de la liste d’échantillons de spectromètres de masse et/ou l’exemple de texte doivent être utilisés pour garantir un enregistrement permanent des temps d’étiquetage HDX correspondant à ceux saisis dans l’interface graphique du logiciel FastHDX. Les temps d’étiquetage pour chaque exécution d’échantillon ne seront stockés nulle part ailleurs.
    8. Définissez le temps de recouvrement (minutes) sur la durée du temps de piégeage. Ici, il est 3.00.
    9. Définir Attendre HPLC (mins) = (temps d’interruption + durée d’exécution + 1,5 min).
      REMARQUE: Par exemple, pour une expérience avec un piégeage de 3 minutes et un gradient de 17 minutes, ce sera 21,50 minutes.
    10. Cliquez sur la case Exécuter vide uniquement si vous exécutez des expériences vides entre des exemples d’exécutions. Si oui, assurez-vous qu’une entrée (c’est-à-dire une ligne valide dans la liste d’exemples) dans le logiciel pour l’exécution vide après chaque exécution d’échantillon.
    11. Une fois que la liste d’exemples est prête sur le logiciel, mettez en surbrillance les entrées appropriées et démarrez l’exécution dans le logiciel en cliquant sur le bouton Lecture et FastHDX dans le logiciel.
      REMARQUE: En raison du brouillage hydrogène/deutérium, les méthodes MS uniquement ou les techniques de fragmentation douce (dissociation par transfert d’électrons, dissociation par capture d’électrons et photoconsiliation ultraviolette) ne peuvent être utilisées que29. Pour aSyn à un pH physiologique de 7,40, des points temporels allant de 50 ms à 300 s sont les plus applicables car ils couvrent toute la courbe d’absorption du deutérium8.

5. Traitement des données

  1. Chargez le fichier des peptides attribués spectralement à partir des expériences de cartographie des peptides. Ouvrez le menu Fichier et cliquez sur Ouvrir dans le logiciel DynamX (voir Tableau des matériaux).
  2. Importez des fichiers bruts dans le logiciel de mesure de masse préféré (par exemple, DynamX, HDExaminer, etc.). Ouvrez le menu « Données » et cliquez sur MS Files. Cliquez sur Nouvel état pour créer des états pour chaque condition de protéine étudiée.
    1. Cliquez sur Nouvelle exposition pour ajouter chaque point temporel HDX. Cliquez sur Nouveau RAW pour importer les fichiers .raw. Faites glisser chaque fichier .raw vers la position correcte. Cliquez sur OK lorsque vous avez terminé.
  3. Attribuez d’abord automatiquement les isotopes (ceci est automatique à la suite de l’étape 5.2. ci-dessus), puis organisez manuellement l’affectation isotopique pour assurer une qualité de données élevée.
  4. Exportez les données du cluster dans un fichier .csv avec des colonnes dans l’ordre suivant : nom de la protéine, numéro de début de la séquence, numéro de fin de séquence, séquence, modification, fragment, absorption maximale possible, masse d’espèces monoisotopiques, nom de l’état, temps d’exposition, nom du fichier, charge, temps de rétention, intensité et centroïde.
  5. Ouvrez le menu Données dans le logiciel de mesure de masse et cliquez sur Exporter les données du cluster.

6. Analyse des données

  1. Chargez les données de cluster exportées dans le logiciel d’analyse HDX préféré. Ici, HDfleX est utilisé30 (voir tableau des matériaux).
  2. Adaptez les données expérimentales pour tous les peptides et états, en sélectionnant les méthodes de correction de rétro-échange appropriées pour obtenir les constantes de vitesse observées pour la réaction HDX.
  3. Calculez un seuil de signification globale par la méthode préférée (HDfleX prend en charge plusieurs options pour cela) et effectuez des tests de signification hybride pour déterminer les différences significatives entre les États par rapport à31,32.
    REMARQUE : Si la différence observée est supérieure au seuil global et que la valeur de p est inférieure au niveau de confiance choisi (p. ex., 95 %), la différence est considérée comme significative.

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Résultats

En raison de sa nature intrinsèquement désordonnée, il est difficile de capturer les changements structurels complexes dans aSyn à pH physiologique. HDX-MS surveille l’échange isotopique au niveau des hydrogènes amides dorsaux, sondant la dynamique et les interactions conformationnelles des protéines. C’est l’une des rares techniques pour acquérir ces informations à des résolutions structurelles et temporelles élevées. Ce protocole est largement applicable à un large éventail de protéines et de conditions tampons, et cel...

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Discussion

Dans le présent article, les procédures suivantes sont décrites: (1) effectuer des expériences de cartographie peptidique sur aSyn monomère pour obtenir la couverture de séquence la plus élevée, (2) acquérir des données HDX-MS millisecondes sur aSyn monomère dans des conditions physiologiques, et (3) effectuer l’analyse des données et l’interprétation des données HDX-MS résultantes. Les procédures fournies sont généralement simples à exécuter, chaque expérience d’étiquetage ne dure généralement qu’environ 8 h pour trois ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

NS est financé par la bourse du jubilé de diamant du Conseil de l’Université. JJP est soutenu par une bourse UKRI Future Leaders [Numéro de subvention : MR/T02223X/1].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 × ; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &mu ; m C18 colonne  ;Waters Corporation186002346Colonne analytique
Acétonitrile HPLC grade >99,9 % HiPerSolvVWR20060.420Pour phases mobiles LC
CaCl2Sigma AldrichC5670Sel pour tampons HDX
ChronosAxel Semrau (Acheté auprès de Waters Corporation)667006090Logiciel de planification pour permettre automatiquement plusieurs injections d’échantillons HDX-MS. D’autres logiciels sont disponibles auprès d’autres fournisseurs, par exemple HDXDirector ou LEAP
Shell Chlorure de deutériumGoss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-2-50Pour les tampons de marquage HDX
Oxyde de deutérium (99,9 % D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-4Eau deutérée
DynamX 3.0Waters Corporation176016027Assignation isotopique et calcul de l’incorporation du deutérium
Enzymate BEH PepsinColumn Waters Corporation186007233Pepsin
Digestion Column Acide formique, 99,0 % LC/MS GradeFisher Scientific10596814Pour les phases mobiles LC
Chlorhydrate de guanidiniumSigma AldrichRDD001-500GChaotrope/Denaturant
HDfleXUniversité d’ExeterN/Ahttps://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KClSigma AldrichP3911Sel pour tampons HDX
LEAP HDX-2 CTC Robot d’échantillonnage PALWaters Corporation725000637Robot passeur d’échantillons
Leucine enkephalin WatersCorporation186006013Pour l’étalonnage par spectrométrie de masse.
MassLynxWaters Corporation667004007Logiciel contrôlant les méthodes d’entrée et le spectromètre
de masse Flacons de récupération maximaleWaters Corporation600000670CV100 pack avec bouchons - utilisé pour le plateau de trempe dans LEAP HDX-2
MgCl2Sigma AldrichM8266Sel pour tampons HDX
Millipore 0.22 µ ; Filtres pour seringues mpourseringuesMillipore
ms2minApplied Photophysics LtdN/AInstrument hdx hdx milliseconde à mélange rapide
NaClSigma AldrichS9888Sel pour tampons HDX
Régulateur de température PeltierLEAP Technologies Inc.HP115-COOL/Dpour régler avec précision la température des chambres dans le robot LEAP.
ProteinLynx Global Server 3.0Waters Corporation715001030logiciel d’identification de peptides. D’autres logiciels sont disponibles auprès d’autres fournisseurs.
Bouchons de pots de réactifsWaters Corporation186004632paquet de 100
Pots de réactifs pour LEAP HDX-2Waters Corporation186001420paquet de 100 sans bouchons - utilisés pour les tampons dans LEAP HDX-2
Deutéroxyde de sodium (99,5 % dans le D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-57Pour tampons d’étiquetage HDX
Filtres de spin Tubes à microcentrifugeuse (3 kDa MWCO)Amicon (Merck Sigma Aldrich)UFC5003Micro tubes à centrifuger pour concentrer les protéines. Cela facilite l’échange de tampons et le chargement précis des échantillons pour les expériences HDX-MS.
Spectromètre de masse Synapt G2-SiWaters Corporation176850035Spectromètre
de masse Flacons de récupération totaleWaters Corporation600000671CV100 pack avec bouchons - utilisé pour l’étiquetage du plateau dans LEAP HDX-2
Tris-HClSigma AldrichT3253-250GTampon
Trizma baseSigma AldrichT60040-B2005
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Références

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 1 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820(2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712(2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424(2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. New York. 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

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