Utilisation de la bisection pour réduire l’ADN mitochondrial dans l’ovocyte bovin

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour réduire significativement le nombre de copies d’ADN mitochondrial dans un ovocyte bovin (P < 0,0001). Cette méthode utilise la centrifugation et la bisection pour réduire considérablement les mitochondries des ovocytes et peut permettre d’augmenter les chances de développement dans les embryons de transfert nucléaire de cellules somatiques interespèces reconstruits.

Résumé

Le transfert nucléaire de cellules somatiques interespèces (iSCNT) peut être utilisé pour sauver des espèces menacées, mais deux populations distinctes d’ADN mitochondrial (ADNmt) existent dans l’embryon reconstruit : une dans l’ooplasme receveur et une dans la cellule somatique donneuse. Cette hétéroplasmie mitochondriale peut entraîner des problèmes de développement chez l’embryon et le fœtus. Les protocoles de clonage faits à la main comprennent la bisection ovocytaire, qui peut être utilisée pour diminuer le nombre de copies d’ADNmt, réduisant ainsi le degré d’hétéroplasmie mitochondriale dans un embryon reconstruit. La centrifugation d’ovocytes bovins matures et dénudés a produit une fraction visible dense en mitochondries à un pôle de l’ovocyte. Les pellucidés de la zone des ovocytes ont été éliminés par exposition à une solution de pronase. La bisection a été réalisée à l’aide d’une microlame pour éliminer la fraction visible des mitochondries. La qPCR a été utilisée pour quantifier l’ADNmt présent dans les échantillons d’ADN extraits d’ovocytes entiers et d’ooplastes coupés en deux, fournissant une comparaison des nombres de copies d’ADNmt avant et après la bisection. Les nombres de copies ont été calculés à l’aide de valeurs seuils de cycle, de la formule de la ligne de régression d’une courbe standard et d’un ratio qui comprenait les tailles respectives des produits de PCR d’ADNmt et des produits de PCR génomique. Un ovocyte bovin avait un nombre moyen de copies d’ADNmt (± écart-type) de 137 904 ± 94 768 (n = 38). Un ooplast appauvri en mitochondries avait un nombre moyen de copies d’ADNmt de 8 442 ± 13 806 (n = 33). Les copies moyennes d’ADNmt présentes dans un ooplast riche en mitochondries étaient de 79 390 ± de 58 526 copies d’ADNmt (n = 28). Les différences entre ces moyennes calculées indiquent que la centrifugation et la bisection subséquente peuvent diminuer considérablement le nombre de copies d’ADNmt présent dans l’ooplaste appauvri en mitochondries par rapport à l’ovocyte d’origine (P < 0,0001, déterminé par une ANOVA unidirectionnelle). La réduction de l’ADNmt devrait diminuer le degré d’hétéroplasmie mitochondriale dans un embryon reconstruit, favorisant éventuellement le développement embryonnaire et fœtal standard. La supplémentation en extrait mitochondrial de la cellule donneuse somatique peut également être essentielle pour réussir le développement embryonnaire.

Introduction

Le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) comprend la fusion d’un ovocyte énucléé d’un animal et d’une cellule somatique d’un animal de la même espèce. Dans la plupart des cas, l’ovocyte et la cellule somatique proviennent de la même espèce et les taux de naissances vivantes sont inférieurs à 6 %¹. Certaines recherches impliquent l’utilisation de SCNT interespèces (iSCNT), qui comprend la fusion d’une cellule somatique et d’un ovocyte provenant de deux espèces différentes. Dans ces études, les taux de naissances vivantes sont encore plus bas que dans le SCNT - généralement inférieur à 1%¹. Cependant, l’iSCNT a....

Protocole

Le protocole suivant suit les directives en matière de soins aux animaux et d’éthique fournies par l’Université d’État de l’Utah.

1. Préparation des médias

1. Avant la manipulation des ovocytes, préparer les solutions suivantes, comme décrit dans le tableau 1 : 400 μL de solution de hyaluronidase, 500 μL de milieu T2, 1 020 μL de milieu T20 et 800 μL de milieu T10.
2. Divisez le milieu T10 en deux puits d’une plaque de quatre puits, 400 μL par puits. Étiquetez un puits avec « M » et le second puits avec « MR ». Placer dans un incubateur à 5% de CO₂ jusqu’après la bisection.

Résultats

Les résultats quantitatifs de la PCR (qPCR) sont utilisés pour déterminer les quantités relatives d’ADNmt présentes dans chaque ooplaste. La réaction décrite est conçue pour amplifier la région 12S de l’ADNmt bovin.

Si la bisection a réussi, les échantillons d’ovocytes entiers et d’ooplastes denses en mitochondries auront des valeurs C_t similaires. Les échantillons d’ooplastes réduits aux mitochondries auront des valeurs de C_t plus élevées que les échantillons des deux au.......

Discussion

Les méthodes précédemment utilisées pour diminuer le nombre de copies d’ADNmt dans les ovocytes ont leurs inconvénients respectifs. L’élimination des mitochondries des ovocytes par micromanipulation diminue le nombre de copies d’ADNmt de 64 % en ^moyenne27. Une méthode unique, précédemment utilisée pour l’énucléation, implique l’utilisation de pipettes Pasteur de petit diamètre et la division d’un ovocyte sans zone pellucide à la frontière entre une microgoutte de milieu et l’huile minérale environ.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes à centrifuger de 1,5 mL	Fisher Scientific	5408129
Boîte de 60 mm	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifugeuse	Eppendorf	5424
Cytochalasine B	Sigma-Aldrich	C6762
Sérum de veau fœtal	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Média	Sigma-Aldrich	M4530
Huile minérale	Sigma-Aldrich	M8410
Mini centrifugeuse	SCILOGEX	D1008
mtDNA Amorce : Avant (12S)			GGGCTACATTCTCTCACCAAG
MtDNA Amorce : Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotomètre	Thermo Scientific	ND2000
Scalpel ophtalmique avec manche en aluminium	PFM Medical	207300633	Microblade pour bissection
Protéase/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio&trade ; 3 - 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Plaque de recherche	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR Master mix
Fluide oviductal synthétique avec HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Étape de chauffage