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Article de méthode

Isolement et culture de trois types de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical

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⸱

DOI :

10.3791/64065

⸱

23 août 2022

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de cellules souches mésenchymateuses à partir des artères du cordon ombilical, des veines et de la gelée de Wharton.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical (CSM-UC) sont une source de cellules importante pour la médecine régénérative. Les CSM-UC peuvent être isolées à partir de la gelée de Wharton du cordon ombilical, ainsi que des artères ombilicales et de la veine ombilicale. Elles sont connues sous le nom de cellules souches périvasculaires obtenues à partir des artères ombilicales (UCA-PSC), de cellules souches périvasculaires obtenues à partir de la veine ombilicale (UCV-PSC) et de cellules souches mésenchymateuses obtenues à partir de la gelée de Wharton (WJ-MSCs). Les CS-UCA et les CSP-UCV sont des péricytes dérivés de régions périvasculaires qui sont les progéniteurs des CSM. L’isolement et la culture des trois types de cellules constituent une source importante pour l’étude de la transplantation et de la réparation des cellules souches. Le protocole actuel se concentre sur l’isolement et la culture des cellules par séparation mécanique, culture adhérente et sortie des cellules. Grâce à cette technique, les trois différents types de cellules souches peuvent être dérivés. Des marqueurs de surface cellulaire ont été détectés par cytométrie en flux. Les cellules souches ont été détectées pour leur potentiel de différenciation multilignée par différenciation adipogénique, ostéogénique et de type neuronal, ce qui est cohérent avec le phénotype des CSM. Ce protocole expérimental élargit la source des UC-MSC. En outre, la méthode d’isolement cellulaire fournit une base pour d’autres études de la médecine régénérative et d’autres applications.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (UC-MSC) sont largement utilisées en médecine régénérative en raison de leur fonctionnement non invasif, de leur faible immunogénicité et de l’absence de contestation éthique1. Dans de nombreuses études, les CSM-UC isolées de la gelée de Wharton (WJ) peuvent se fixer à la paroi, subir une multi-différenciation et exprimer des marqueurs de cellules souches mésenchymateuses (CSM)2. Cependant, presque toutes les CSM proviennent de la région périvasculaire3. Les péricytes, en tant que sous-ensemble des cellules périvasculaires, sont des cellules progénitrices des CSM4. Par conséquent, les CSM-UC peuvent être isolées du cordon ombilical WJ, des artères ombilicales (UCA) et de la veine ombilicale (UCV), connues sous le nom d’UCA-PSC, UCV-PSCs et WJ-MSCs, respectivement5. Cette méthode visait à isoler et à cultiver les trois différents types de cellules souches. L’isolement et la culture des UCA-PSC, des UCV-PSC et des WJ-MSC sont très importants pour fournir davantage de sources de MSC.

La présente étude décrit l’isolement, la culture et l’application future des UCA-PSC, UCV-PSC et WJ-MSC, qui ont une adhésion cellulaire, expriment les marqueurs des MSC et ont une différenciation multidirectionnelle. Les cellules souches isolées ont été observées au microscope et soumises à la culture cellulaire, au passage cellulaire, à la cryoconservation cellulaire et à la récupération cellulaire. La raison de l’utilisation de cette technique était que les cellules sortaient des tissus. Par rapport aux méthodes précédentes, telles que la cytométrie en flux ou les techniques de billes immunomagnétiques, qui étaient complexes et coûteuses6, les US-MSCs peuvent être massivement isolées par la méthode de séparation adhérente et de crawling cellulaire ; Ceux-ci ont été utilisés dans l’étude précédente5. Une analyse par cytométrie en flux a été effectuée sur les cellules souches dérivées afin de détecter si ces cellules expriment des marqueurs MSC. La différenciation multidirectionnelle des cellules souches a été introduite pour détecter si les trois types de cellules ont le potentiel de se différencier en adipocytes, ostéoblastes et neuroblastes. L’isolement et la culture de trois types de cellules souches à partir du cordon ombilical ont été importants pour l’utilisation clinique et utiles pour les chercheurs pour diverses applications futures.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche clinique du troisième hôpital affilié de l’Université Soochow. Un consentement écrit éclairé a été obtenu des sujets humains. Des personnes ayant accouché à terme par voie vaginale ou par césarienne ont été incluses dans la présente étude pour obtenir le cordon ombilical. Le cordon ombilical provient de nouveau-nés en bonne santé sans préjugés sexistes. Le nouveau-né avait un score d’Apgar de 8-10. Le score d’Apgar est un test rapide pour les nouveau-nés administré peu de temps après leur naissance. Ce test vérifie le tonus musculaire, la fréquence cardiaque et d’autres signes d’un bébé pour voir si des soins médicaux ou d’urgence supplémentaires sont nécessaires7. D’autre part, les patients atteints de maladies majeures, telles que le cœur, le foie, les reins ou d’autres maladies infectieuses, ont été exclus de la présente étude.

1. Prélèvement du cordon ombilical humain

  1. Placez le cordon ombilical du nouveau-né dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et transportez-le à 4 °C.
    REMARQUE : Trois cordons ombilicaux provenant de trois donneurs ont été utilisés dans la présente étude.
  2. Prélever immédiatement le sang du cordon ombilical dans des conditions stériles et couper le long de l’axe long des vaisseaux sanguins dans 20 cm du cordon ombilical. Séparez les 20 cm appropriés des artères et de la veine ombilicales et retirez soigneusement la gelée de Wharton sur la surface.
    REMARQUE : Des cultures d’explants ont été obtenues dans chaque région, hachées en petits morceaux (1-2 mm3) pour éviter la contamination croisée entre les trois types de cellules souches.
  3. Coupez les artères ombilicales, la veine et la gelée de Wharton à une taille de 1 à 2 mm3 et inocunez-les dans des boîtes de culture cellulaire de 100 mm. Effectuer l’inoculation des artères ombilicales, de la veine et de la gelée de Wharton à l’aide d’une pince à épiler conformément à un rapport précédemment publié5. Ne pré-enduisez pas les plaques de culture de 100 mm.
    REMARQUE : L’intervalle entre les artères ombilicales, la veine ou la gelée de Wharton était d’environ 1 cm. Un temps de collecte trop long avant de séparer les cellules peut affecter la viabilité et la quantité de cellules. Il est recommandé de séparer immédiatement les artères et la veine du cordon ombilical. Le temps de collecte était de 4 h.

2. Isolement et culture des UCA-PSC, UCV-PSC et WJ-MSCs

  1. Placez les boîtes de culture cellulaire à l’envers pendant 3 h dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pour vous assurer que les artères ombilicales, la veine et le tissu gélatineux de Wharton se fixent fermement aux boîtes de culture cellulaire avant d’ajouter le milieu de culture.
    1. Après 3 h, remettez les boîtes de culture cellulaire à leur position normale. Ajouter 5 mL de milieu de culture cellulaire (LG-DMEM, 10 % FBS, 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine, voir le tableau des matériaux) dans la boîte de culture cellulaire.
  2. Ajouter 3 ml et 2 ml du milieu de culture dans la boîte de culture cellulaire le 3e et le 7e jour de la première semaine, respectivement. Veillez à ne pas toucher les blocs tissulaires des artères du cordon ombilical, des veines et de la gelée de Wharton.
  3. Changez la moitié du milieu liquide deux fois au cours de la deuxième semaine et l’ensemble du milieu liquide deux fois au cours de la troisième semaine.
  4. Observez les cellules sortir des blocs de tissu environ 7 jours après la culture, puis jetez les blocs de tissu lorsque les cellules sont fusionnées à 80 % à ~2 semaines.
    1. Lorsque les cellules sont fusionnées à 100 %, faites-les passer dans un rapport de 1:3 avec 2 mL de trypsine à 0,05 % après centrifugation à 600 x g pendant 4 min à température ambiante.
      REMARQUE : Les cellules primaires isolées à partir d’un cordon ombilical étaient d’environ 2 x 106 UCA-PSC, 1 x 106 UCV-PSC et 2 x 106 WJ-MSC. Les 2 x 106 UCA-PSC, 1 x 106 UCV-PSC et 2 x 106 WJ-MSC ont été isolés à partir de 20 cm de cordon ombilical. Les cellules ont rampé dans les trois cordons ombilicaux, ce qui indiquait que les résultats entre les isolements étaient reproductibles.
    2. Ensemencez les cellules en maintenant une concentration de 5 x 105/100 cm2 dans la boîte de culture. Conservez les 5 x 105 cellules dans 1 mL de solution de cryoconservation (90 % FBS, 10 % DMSO). Des cellules du troisième au cinquième passage ont été utilisées dans la présente étude.

3. Détection de marqueurs de surface MSC par cytométrie en flux

  1. Digérer les cellules de troisième génération avec 0,05 % de trypsine pour obtenir une suspension unicellulaire. Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 4 min à température ambiante et jeter le surnageant cellulaire à l’aide d’une pipette Pasteur. Ensuite, remettre en suspension 1 x 105 cellules dans 100 μL de PBS (1 % FBS). Évalue le nombre de cellules en comptant les cellules à l’aide d’un hémocytomètre conformément à un rapport publié précédemment8.
  2. Incuber les cellules 1 x 105 avec divers anticorps anti-phycoérythrine contre les CD13 (FITC, 0,1 mg/mL), CD34 (FITC, 0,1 mg/mL), CD45 (FITC, 0,1 mg/mL), CD73 (FITC, 0,1 mg/mL) et HLA-DR (FITC, 0,1 mg/mL) dans l’obscurité pendant 30 min. Pour les témoins, incuber 1 x 105 cellules avec des FITC-IgG (FITC Mouse Anti-Human IgG, 0,1 mg/mL) (voir le tableau des matériaux).
  3. Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 4 min à température ambiante, puis jeter le surnageant cellulaire à l’aide d’une pipette Pasteur. Remettre en suspension 1 x 105 cellules dans 500 μL de PBS (1 % FBS), détecter par cytométrie en flux, et analyser par FlowJo2 (voir Tableau des matériaux).

4. Différenciation des UCA-PSC, UCV-PSCs et WJ-MSCs en adipocytes

  1. Inoculer les cellules de troisième génération dans des plaques à 24 puits à une densité de 6 x 104 cellules/cm2 avec 500 μL de milieu cellulaire (LG-DMEM, 10 % FBS, 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine, voir le tableau des matériaux) par puits dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
  2. Changer le milieu cellulaire après 24 h et changer le groupe témoin pour le milieu cellulaire (LG-DMEM, 10 % FBS, 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Réalisez les expériences après que les cellules ont fusionné à 80 % dans des plaques à 24 puits.
    REMARQUE : Les cellules des groupes qui ont induit l’adipogenèse ont été transformées en un milieu d’induction adipogénique (kit de différenciation adipogénique, voir Tableau des matériaux). Le milieu des cellules dans les deux groupes a été changé tous les 3 jours.
  3. Observer les gouttelettes lipidiques dans les cellules environ 21 jours après l’induction dans le groupe d’induction adipogénique, puis mettre fin à l’induction adipogénique.
    REMARQUE : Le milieu adipogénique a été remplacé par un milieu de culture cellulaire pour terminer l’induction adipogénique 2,5. De plus, les cellules du groupe témoin n’ont montré aucun changement significatif.
  4. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 minutes, puis fixez avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
  5. Jetez le PBS et séchez les cellules à température ambiante pendant environ 20 min. Ensuite, ajouter 500 μL de solution d’huile rouge O (0,5 %) (voir le tableau des matériaux) dans le puits pendant 10 min.
  6. Retirez la solution de O rouge d’huile et lavez les cellules avec du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune. Observez les cellules au microscope.

5. Différenciation des cellules souches en ostéoblastes

  1. Placer 500 μL de gélatine à 0,1 % (voir le tableau des matériaux) par puits dans des plaques de culture à 24 puits et les jeter après 30 min.
  2. Inoculer 6 x 104/cm2 de cellules de troisième génération dans des plaques de culture à 24 puits, et ajouter 500 μL de milieu de culture cellulaire ou de milieu d’induction ostéogénique (kit de différenciation ostéogénique, voir tableau des matériaux) dans chaque puits dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Dans le groupe témoin, changez le milieu de culture cellulaire tous les 3 jours, tout en remplaçant le milieu d’induction ostéogénique dans le groupe de différenciation ostéogénique tous les 3 jours.
  3. Après 3-4 semaines, vérifiez le dépôt de calcium noir dans les cellules. Lavez le puits avec du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune.
  4. Fixez les cellules à température ambiante avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min et lavez-les trois fois avec du PBS pendant 5 min chacune. Ajoutez la solution de coloration au rouge d’alizarine (1 %) dans le puits pendant 20 minutes à température ambiante, puis jetez-la.
  5. Après un séchage de 30 minutes à température ambiante, observez les cellules au microscope.

6. Différenciation des cellules souches en neurones

  1. Inoculer les cellules de troisième génération 6 x 104/cm2 dans des plaques de culture à 24 puits, où les lames de couverture stériles traitées à la L-polylysine ont été remplacées. Placez les feuilles d’escalade cellulaire (voir Tableau des matériaux) dans les plaques à 24 puits pour différencier les cellules en neurones. Cultivez les cellules sur les feuilles d’escalade cellulaire.
  2. Ensuite, ajoutez 500 μL de milieu de culture cellulaire dans le puits et remplacez le milieu de culture cellulaire par 500 μL de milieu d’induction neurogène9 (voir le tableau des matériaux) après 24 h.
  3. Après induction pendant 24 h, ajouter 10-7 mol/L d’ATRA et 10 ng/mL de bFGF (voir Tableau des matériaux) à la solution pour maintenir la différenciation induite des neurones.
  4. Mettre fin à l’induction lorsque des synapses cellulaires évidentes se forment. Vérifiez les synapses cellulaires évidentes à l’aide de la technique de microscopie (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE : La coloration par immunofluorescence a été utilisée pour identifier les marqueurs spécifiques aux neurones de l’énolase spécifique des neurones (NSE, voir le tableau des matériaux), qui est un marqueur des neurones2.
  5. Effectuer une imagerie confocale sur les feuilles d’escalade cellulaire.

7. Coloration par immunofluorescence

  1. Après avoir jeté la solution de culture cellulaire, lavez les cellules avec 500 μL de PBS trois fois pendant 5 minutes chacune.
  2. Ensuite, ajoutez 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans le puits et fixez les cellules à température ambiante pendant 45 min.
  3. Lavez les cellules avec du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune.
  4. Perméabiliser les cellules avec 100 μL de Triton-X à 0,5 % à température ambiante pendant 5 min.
  5. Lavez les cellules avec 500 μL de PBS avec 1 % de BSA trois fois pendant 5 minutes chacune.
  6. Incuber les cellules avec 500 μL de PBS avec 3 % de BSA et 0,1 % de Triton X-100 par puits à 37 °C pendant 45 min pour bloquer le site de liaison non spécifique.
  7. Diluez l’anticorps primaire contre le NSE (1:100, voir le tableau des matières) avec du PBS (1:100) contenant 1 % de BSA et 0,1 % de Triton X-100, et incubez les cellules avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C.
  8. Après avoir éliminé l’anticorps primaire, lavez les cellules avec 500 μL de PBS contenant 1 % de BSA trois fois pendant 5 minutes chacune.
  9. Diluer l’anticorps secondaire fluorescent (IgG H&L ANTI-SOURIS de chèvre, Alexa Fluor 488, voir Tableau des matériaux) avec du PBS (1:200) contenant 1 % de BSA et 0,1 % de Triton X-100 à 1:200, et incuber les cellules avec l’anticorps secondaire à 37 °C dans l’obscurité pendant 60 min.
  10. Lavez les cellules avec 500 μL de PBST (PBS contenant 0,1 % de Tween-20) par puits trois fois dans l’obscurité pendant 5 minutes chacune.
  11. Ensuite, ajoutez 200 μL de coloration DAPI (PBST dilué, 0,1 μg/mL) dans le puits pour colorer le noyau à température ambiante sans lumière pendant 5 min.
  12. Lavez les cellules avec 500 μL de PBST trois fois dans l’obscurité pendant 5 minutes chacune.
  13. Ajoutez l’agent d’extinction anti-fluorescence sur la lame, puis couvrez doucement la lame avec un verre de protection. Ajoutez des gouttes de vernis à ongles autour du verre de protection pour le fixer.
  14. Observez le verre à l’aide d’un microscope confocal laser. Utilisez les paramètres de microscopie suivants : canal vert avec laser 488 nm et canal DAPI avec 405 nm.

8. Essai de prolifération

  1. Grainez 2 x 103 cellules par puits dans des plaques de 96 puits. Ajouter 100 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits.
  2. Ajoutez 10 μL de kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8, voir Tableau des matériaux) dans chaque puits.
  3. Après 2 jours d’incubation, mesurer la valeur de DO à 450 nm sur un lecteur de microplaques les jours 1 à 7.
  4. Analyser les valeurs de DO des différents types de cellules souches à l’aide d’un logiciel statistique (voir Tableau des matériaux) et les présenter comme des moyens ± SD. Effectuer une analyse de variance à un facteur (ANOVA). Considérez que la valeur P < 0,05 est statistiquement significative.

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Résultats

Isolement et culture des UCA-PSC, UCV-PSCs et WJ-MSCs à partir du cordon ombilical
Les artères ombilicales, la veine ombilicale et la gelée de Wharton ont été séparées mécaniquement du cordon ombilical et coupées en morceaux de 2 à 3 cm. La distance entre les artères, les veines ou les blocs de tissu gélatineux de Wharton était d’environ 1 cm, disposés en forme de quinconce (figure 1A-C). Les trois types de cellules souches ont...

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Discussion

Cette étude a isolé trois types différents de cellules dans les artères du cordon ombilical, la veine et la gelée de Wharton. Le cordon ombilical était un déchet d’accouchement, et son utilisation était simple, sûre et sans contestation éthique5. Les UC-MSC sont originaux et ont une forte capacité de différenciation1. Des études antérieures ont montré que la quantité de CSM-UC isolées des cordons ombilicaux par la méthode de digestion de la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à souligner le soutien du Projet de recherche fondamentale du Bureau des sciences et de la technologie de Changzhou sous la subvention numéro CJ20200110 (à YJY), de la Fondation nationale des sciences de la nature de Chine (82001629, XQS), du Programme pour les jeunes de la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (BK20200116, XQS) et du Financement de la recherche postdoctorale de la province du Jiangsu (2021K277B, XQS).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de différenciation adipogéniqueGibcoA1007001Différenciation multidirectionnelle
Solution de coloration au rouge d’alizarineSigmaA5533Différenciation multidirectionnelle
Anticorps contre CD13Thermo Fisher ScientificMA1-12034Analyse de flux
Anticorps contre CD34BD BiosciencesAnalyse de flux 560942
Anticorps contre CD45BD BiosciencesAnalyse deflux
Anticorps contre CD73BD BiosciencesAnalyse de flux 940294
Anticorps contre HLA-DRBD Biosciences555560Analyse
de flux Agent d’extinction anti-fluorescenceAbcamAB103748Immunofluorescence
Anti-IgG de souris H& L (Alexa Fluor 488)abcamab150113Différenciation multidirectionnelle
ATRASTEMCELL Technologies302-79-4culture cellulaire
bFGFGibco13256029Différenciation multidirectionnelle
BSASigma V900933Immunofluorescence
Incubateur cellulaireThermo Fisher ScientificHERAcell 240iculture cellulaire
Kit de comptage cellulaire-8DojindoCK04Centrifugeuse de prolifération cellulaire
Thermo Fisher ScientificSorvall&trade ; MTX-150Culture cellulaire
DAPISigma10236276001Immunofluorescence
DMSOSigmaD1435Culture cellulaire
FBSGibco10099141culture cellulaire
FITC Souris Anti-Human IgGBD BiosciencesAnalyse de flux 560952
Cytomètre de flux ThermoFisher ScientificA24864Analyse de flux
Microscope à fluorescenceThermo Fisher ScientificIM-5analyse de flux
GelatinSigma48722Différenciation multidirectionnelle
Leica MicroscopeLeicaDM500Différenciation multidirectionnelle
LG-DMEM mediumGibco11-885-084culture cellulaire
Lecteur de microplaquesThermo Fisher ScientificA51119500Cprolifération cellulaire
Induction neurogèneGibcoA1647801Différenciation multidirectionnelle
Oil red O solutionSigmaO1516Différenciation multidirectionnelle
Induction ostéogéniqueCyagenHUXXC-90021Différenciation multidirectionnelle
ParaformaldéhydeSangon Biotech30525-89-4Immunofluorescence
Pipette PasteurBiosharpBS-XG-03Lculture cellulaire
PBS (phosphate tamponné salinHycloneSH30256.LSculture cellulaire
Pénicilline streptomycineHycloneSV30010culture cellulaire
Anticorps primaire contre NSESanta Cruz Biotechnologysc-292097Différenciation multidirectionnelle
SPSS 22.0IBMSPSS 22.0Analyse statistique
Les feuilles d’escalade cellulaireCITOTEST Scientific80346-0910Différenciation multidirectionnelle
TritonX-100Sangon Biotech9002-93-1Immunofluorescence
TrypsineGibco25300120culture cellulaire
561865)

Références

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