Détection de Candidatus liberibacter asiaticus déployable sur le terrain à l’aide de l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a

Summary

Dans ce travail, une méthode de détection rapide, sensible et portable pour Candidatus Liberibacter asiaticus basée sur l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a a été développée.

Abstract

La détection précoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) par les producteurs d’agrumes facilite l’intervention précoce et prévient la propagation de la maladie. Une méthode simple pour le diagnostic rapide et portable de Huanglongbing (HLB) est présentée ici qui combine l’amplification de la polymérase recombinase et un rapporteur fluorescent utilisant l’activité nucléase du système grappé régulièrement espacé de courtes répétitions palindromiques / 12a associé à CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilité de cette technique est beaucoup plus élevée que la PCR. De plus, cette méthode a donné des résultats similaires à la qPCR lorsque des échantillons de feuilles ont été utilisés. Par rapport aux méthodes de détection CLas conventionnelles, la méthode de détection présentée ici peut être complétée en 90 minutes et fonctionne dans un état isotherme qui ne nécessite pas l’utilisation de machines PCR. De plus, les résultats peuvent être visualisés à l’aide d’un dispositif portatif de détection fluorescente sur le terrain.

Introduction

Huanglongbing (HLB) est l’une des maladies d’agrumes les plus problématiques au monde¹. Le HLB est causé par les bactéries fastidieuses et colonisatrices du phloème Candidatus Liberibacter spp., y compris Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus et Ca. L. americanus² . L’espèce associée au HLB la plus répandue en Chine et aux États-Unis est CLas, qui est transmise par les psylles asiatiques des agrumes (Diaphorina citri) ou par greffe³. Après avoir été infectés par CLas, les agrumes montrent un déclin de croissance jusqu’à la mort

Protocol

1. Construction du CLas-DETECTR

REMARQUE: La construction de CLas-DETECTR est un processus en quatre étapes: préparation de la solution, isolement de l’ADN total des agrumes, amplification isotherme de l’ADN et visualisation des résultats. Le schéma du test CLas-DETECTR est illustré à la figure 1A.

1. Préparation de la solution
   1. Préparer le tampon A : 20 mM de NaOH dans du PEG 200 à 6 %. Pour 100 mL, ajouter 113 mg de NaOH et 6 g de PEG 200 dans 80 mL de_H2Odans une bouteille. Incuber la bouteille au bain-marie à 60 °C jusqu’à dissolution de tout le PEG 200. Ensuite, ajoutez H₂....

Results

Ici, nous avons décrit une plate-forme portable, CLas-DETECTR, combinant les systèmes RPA et CRISPR-Cas12a pour diagnostiquer HLB sur le terrain. Le schéma de CLas-DETECTR est illustré à la figure 1A.

Lorsque des échantillons de feuilles provenant d’arbres de Newhall infectés et non infectés par HLB (figure 1B), pour lesquels la présence de CLas a été confirmée par PCR (figure 1C), ont été soumis au test CLas-DETECTR, un signal de fluorescence vert a été observé d.......

Discussion

Cette étude présente une méthode rapide et portable de détection des CLas nommée CLas-DETECTR, qui combine les systèmes RPA et CRISPR-Cas12a. Le flux de travail est illustré à la figure 1. CLas-DETECTR détecte les CLas avec spécificité et sensibilité (Figure 2 et Figure 3). De plus, en utilisant des échantillons de feuilles de Newhall, CLas-DETECTR détecte les CLas avec la même sensibilité que la qPCR (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit d’extraction de gel d’ADN AxyPrep	Corning	09319KE1	Chine
Kit d’extraction d’ADN génomique bactérien	Solarbio	D1600	Chine
EnGen LbCas12a  ;	TOLOBIO	32104-01	Chine
Ex Taq Version 2.0 plus colorant	TaKaRa	RR902A	Chine
Appareil de détection fluorescent portable  ;	LUYOR	3415RG	Chine
Perforateur  ;	Deli	114	Chine
Acétate de magnésium, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718	Chine
Tampon NEB 3.1  ;	NEB	B7203	USA
Tubes de bandelettes PCR	LABSELECT	PST-0208-FT-C	Chine
PEG 200  ;	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	Chine
Quick-Load Purple 1 kb Plus Échelle d’ADN  ;	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	UK