Ce protocole illustre un test in vitro de transcytose des cellules endothéliales comme modèle pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne en mesurant la capacité des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines à transporter la peroxydase de raifort à travers les cellules dans les processus de transport transcellulaire médiés par les cavéoles.
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Article de méthode
Essai de transcytose cellulaire endothéliale comme modèle in vitro pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le dysfonctionnement de la barrière hémato-rétinienne (BRB) contribue à la physiopathologie de plusieurs maladies oculaires vasculaires, entraînant souvent un œdème rétinien et une perte de vision subséquente. La barrière interne hémato-rétinienne (BRB) est principalement composée d’endothélium vasculaire rétinien à faible perméabilité dans des conditions physiologiques. Cette caractéristique de faible perméabilité est étroitement régulée et maintenue par de faibles taux de transport paracellulaire entre les cellules endothéliales microvasculaires de la rétine adjacentes, ainsi que par le transport transcellulaire (transcytose) à travers elles. L’évaluation de la perméabilité de la barrière transcellulaire rétinienne peut fournir des informations fondamentales sur l’intégrité de l’IBB dans la santé et la maladie. Dans cette étude, nous décrivons un test de transcytose sur cellules endothéliales (CE), comme un modèle in vitro pour évaluer la perméabilité iBRB, en utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC). Ce test évalue la capacité des HRMECs à transporter la transferrine et la peroxydase de raifort (HRP) dans les processus de transport transcellulaire médiés par les récepteurs et les cavéoles, respectivement. Des HRMECs entièrement confluents cultivés sur membrane poreuse ont été incubés avec de la transferrine marquée par fluorescence (transcytose dépendante de la clathrine) ou HRP (transcytose médiée par les cavéoles) pour mesurer les niveaux de transferrine ou HRP transférés dans la chambre inférieure, indiquant les niveaux de transcytose à travers la monocouche EC. La signalisation Wnt, une voie connue régulant l’iBRB, a été modulée pour démontrer la méthode de dosage de transcytose basée sur HRP médiée par les cavéoles. Le test de transcytose EC décrit ici peut fournir un outil utile pour étudier les régulateurs moléculaires de la perméabilité EC et de l’intégrité iBRB dans les pathologies vasculaires et pour le dépistage des systèmes d’administration de médicaments.
Introduction
La rétine humaine est l’un des tissus les plus exigeants en énergie du corps. Le bon fonctionnement de la rétine neurale nécessite un apport efficace d’oxygène et de nutriments ainsi qu’un flux restreint d’autres molécules potentiellement nocives pour protéger l’environnement rétinien, qui est médié par la barrière hémato-rétinienne (BRB)1. Semblable à la barrière hémato-encéphalique (BHE) dans le système nerveux central, le BRB agit comme une barrière sélective dans l’œil, régulant le mouvement des ions, de l’eau, des acides aminés et du sucre dans et hors de la rétine. Le BRB maintient également l’homéostasie rétinienne et son privilège immun....
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Boston Children’s Hospital pour la génération d’images de microscopie optique et EM (Figure 3). Les protocoles pour les études in vivo peuvent être obtenus auprès de Wang et al.24. Toutes les expériences impliquant des cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC) ont été approuvées par le Comité institutionnel de biosécurité (IBC) du Boston Children’s Hospital.
1. Préparation des réactifs
- Soluti....
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Résultats
Les images EM de l’endothélium vasculaire rétinien montrent le transport vésiculaire transcytotique et les vésicules cavéolaires dans les cellules endothéliales in vivo.
La transcytose EC peut être visualisée in vivo dans des coupes transversales rétiniennes avec un précipité brun foncé reflétant des vaisseaux sanguins contenant HRP au microscope optique (Figure 3A) et sous forme de précipité dense en électrons indiquant des vésicules transcytotiques.......
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Discussion
Le BRB joue un rôle essentiel dans la santé et la maladie de la rétine. Les techniques in vitro évaluant la perméabilité vasculaire se sont avérées être des outils cruciaux dans les études concernant le développement et la fonction des barrières (BRB/BBB). La procédure décrite ici pourrait être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transcytose EC ou évaluer les modulateurs moléculaires connexes affectant la perméabilité BRB. In vitro Les tests de transcytose EC présentent d.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts ou intérêts financiers à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH (R01 EY028100, EY024963 et EY031765) à JC. ZW a été soutenu par une subvention de démarrage de carrière de la Knights Templar Eye Foundation.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Enceinte de sécurité biologique ; | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Pétridish de culture cellulaire ; | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifugeuse ; | Eppendorf | 5702 | |
| Tubes à centrifuger (15 mL) | Corning Inc. | ||
| Tubes à centrifuger (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-humain Transferrine ; | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovin Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gélatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hémocytomètre (2 puces) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Raifort peroxydase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubateur | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cellules (pour milieu conditionné par contrôle) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Cellules Wnt-3A (pour milieu conditionné par Wnt3A) | ATCC | CRL-2647 | |
| Microscope optique | Leica | DMi1 | |
| Lecteur de plaques multimode | EnSight, PerkinElmer | ||
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) tampon (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Kit de substrat de peroxydase fluorogénique | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Norrin humain recombinant (rhNorrin) | R& D Systems | 3014-NR | |
| Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain recombinant (rhVEGF) | R& Filtre à seringue D Systems | 293-VE | |
| (0,22 & micro ; m) | Inserts Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell (6,5 mm transwell, 0,4 & micro ; insert de membrane en polyester à pores m) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsine-EDTA (0,25 %) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Bain-marie | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Inhibiteur de Wnt/&beta ;-caténine) | Selleckchem | S1180 |
Références
- Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
- Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. <....
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