Article de méthode

Modèle expérimental d’immunothérapie du mélanome utilisant la vaccination tumorale avec une cytokine hématopoïétique

DOI :

10.3791/64082

⸱

24 février 2023

 ,  ,  , 
1La Jolla Institute for Immunology

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présente un modèle d’immunothérapie du cancer utilisant la vaccination tumorale cellulaire avec le mélanome B16-F10 exprimant Flt3L. Ce protocole démontre les procédures, y compris la préparation de cellules tumorales en culture, l’implantation tumorale, l’irradiation cellulaire, la mesure de la croissance tumorale, l’isolement des cellules immunitaires intratumorales et l’analyse par cytométrie en flux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le ligand tyrosine kinase 3 de type FMS (Flt3L) est une cytokine hématopoïétique qui favorise la survie et la différenciation des cellules dendritiques (DC). Il a été utilisé dans les vaccins contre les tumeurs pour activer l’immunité innée et améliorer les réponses antitumorales. Ce protocole démontre un modèle thérapeutique utilisant un vaccin tumoral à base de cellules composé de cellules de mélanome B16-F10 exprimant Flt3L ainsi qu’une analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral (TME). Les procédures pour la préparation de cellules tumorales en culture, l’implantation tumorale, l’irradiation cellulaire, la mesure de la taille de la tumeur, l’isolement des cellules immunitaires intratumorales et l’analyse de cytométrie en flux sont décrites. L’objectif global de ce protocole est de fournir un modèle préclinique d’immunothérapie des tumeurs solides et une plate-forme de recherche pour étudier la relation entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires infiltrantes. Le protocole d’immunothérapie décrit ici peut être combiné à d’autres modalités thérapeutiques, telles que le blocage des points de contrôle immunitaires (anticorps anti-CTLA-4, anti--1, anti--L1) ou la chimiothérapie afin d’améliorer l’effet thérapeutique cancéreux du mélanome.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’immunothérapie du cancer a été reconnue comme une stratégie thérapeutique prometteuse basée sur ses effets secondaires moins toxiques et ses réponses plus durables. Plusieurs types d’immunothérapies ont été développés, notamment les thérapies virales oncolytiques, les vaccins contre le cancer, les thérapies à base de cytokines, les anticorps monoclonaux, le transfert de cellules adoptives (cellules CAR-T ou CAR-NK) et le blocage des points de contrôle immunitaires1.

Pour les vaccins contre le cancer, il existe différentes formes de vaccins thérapeutiques, tels que les vaccins à base de cellules entières, les vaccins à base de protéines ou de peptides et les vaccins à ARN ou à ADN. La vaccination repose sur la capacité des cellules présentatrices d’antigènes (APC) à traiter les antigènes tumoraux, y compris les antigènes spécifiques de la tumeur, et à les présenter sous une forme immunogène aux lymphocytes T. Les cellules dendritiques (DC) sont connues pour être les APC les plus puissants et joueraient un rôle important dans l’immunité antitumorale 2,3. Ces cellules absorbent et traitent les antigènes tumoraux, puis migrent vers les ganglions lymphatiques drainants (dLN) pour amorcer et activer les cellules effectrices T spécifiques de la tumeur (Teff) par l’engagement du récepteur des cellules T (TCR) et des molécules costimulatrices. Il en résulte une différenciation et une expansion des cellules T cytotoxiques spécifiques à la tumeur (CTL), qui infiltrent la tumeur et tuent les cellules tumorales4. Par conséquent, l’activation et la maturation des DC représentent des stratégies attrayantes pour stimuler l’immunité contre les antigènes tumoraux.

Flt3L est connu pour favoriser la maturation et l’expansion des DC fonctionnellement matures qui expriment les protéines CMH de classe II, CD11c, DEC205 et CD865. Il a été démontré que l’administration intratumorale, mais non intraveineuse, d’un vecteur adénovirus incorporant le gène Flt3L (Adv-Flt3L) favorise l’activité thérapeutique immunitaire contre les tumeurs orthrotopiques6. Flt3L a également été utilisé dans des vaccins à base de cellules tumorales constitués de cellules B16-F10 irradiées exprimant de manière stable Flt3L transduit rétroviralement comme un moyen d’améliorer la présentation croisée des antigènes tumoraux par les DC et, par conséquent, d’augmenter les réponses antitumorales. Le protocole de vaccination contre les tumeurs B16-Flt3L décrit ici est basé sur une étude publiée par le groupe7 du Dr James Allison. Dans cet article, ils ont rapporté qu’un vaccin B16-Flt3L combiné au blocage CTLA-4 induisait de manière synergique le rejet du mélanome établi, entraînant une survie accrue.

L’objectif de ce protocole est de fournir un modèle d’immunothérapie préclinique pour le mélanome. Ici, des procédures détaillées sur la façon de préparer et d’implanter des vaccins tumoraux, et comment analyser la composition et la fonction des cellules immunitaires intratumorales à partir de tumeurs solides sont décrites.

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Protocole

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Toutes les souris utilisées dans l’étude ont été maintenues et logées dans le vivarium de l’Institut d’immunologie La Jolla (LJI) dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes avec une température et une humidité contrôlées. Des expériences sur des animaux ont été réalisées sur des souris C57BL/6 femelles âgées de 8 à 14 semaines conformément aux lignes directrices et aux protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux de l’INJ.

1. Préparation de cellules tumorales en culture pour l’implantation

  1. Culture de cellules de mélanome B16-F10 dans le milieu modifié de Dulbecco (IMDM) d’Iscove contenant 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 2 mM de glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 1 mM d’acides aminés non essentiels MEM et 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine. Maintenir la lignée cellulaire à 37 °C sous 5% CO2.
  2. Semer 1,5-2 x 106 cellules B16-F10 dans une fiole de 175T et les cultiver pendant 2 jours. Récoltez les cellules lorsqu’elles sont confluentes à 75 % à 80 %.
  3. Retirer le milieu de culture et laver la fiole une fois avec du PBS. Aspirer le PBS et ajouter 5 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % puis tapoter durement le bord du ballon de culture.
  4. Ajouter 15 mL de milieu de culture pour neutraliser la trypsine-EDTA et verser le contenu de la fiole dans un tube à centrifuger de 50 mL. Lavez la surface de la vaisselle avec 10 ml de PBS et versez-la dans le même tube de 50 ml.
  5. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 200 x g. Jetez le surnageant et cassez la pastille de cellule en tapotant le fond du tube.
  6. Ajouter 10 ml de PBS à froid et pipeter doucement la suspension cellulaire; Ensuite, comptez manuellement les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Gardez les cellules sur la glace avant l’injection.

2. Implantation tumorale

  1. Anesthésier au gaz des souris avec 5 % d’isoflurane à un débit de gaz de 1,0 L par minute dans la hotte. Changer le débit à la dose d’entretien de 2% d’isoflurane une fois que les souris sont complètement anesthésiées. Pour ce protocole, l’anesthésie a été effectuée par le vétérinaire conformément aux lignes directrices de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux.
  2. Rasez les poils sur le flanc gauche des souris et stérilisez le site d’injection à l’aide de lingettes alcoolisées. Implanter par voie intradermique (i.d.) des cellules tumorales B16-F10 à 5 x 105 cellules dans 50 μL de PBS froid dans le flanc gauche à l’aide d’une aiguille de 30 G.
    REMARQUE: La dose de cellules tumorales B16-F10 implantées peut devoir être ajustée dans la plage de 0,5-5 x 105 cellules pour un développement tumoral réussi.
  3. Après l’implantation, mesurez la longueur et la largeur de la tumeur trois fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse numérique électronique. Calculez le volume tumoral (mm3) en utilisant la formule:
    Volume tumoral (mm3) = largeur2 × longueur × 0,5
    Traiter les souris avec un vaccin contre les tumeurs lorsque les tumeurs ont atteint une taille de ≥2 mm.
    REMARQUE: Les tumeurs peuvent généralement être mesurées le jour 3 après l’implantation de 5 x 105 cellules tumorales. Un taux de croissance tumorale B16-F10 plus rapide a été observé chez les souris mâles C57BL/6, Rag1-/- ou Rag2-/-γc-/-. Une observation similaire a été décrite dans d’autres études8. Il est recommandé de garder le sexe des souris cohérent. Cependant, notez que les NIH mettent l’accent sur le sexe en tant que variable biologique importante dans la recherche biomédicale.

3. Préparation vaccinale et injection de cellules B16-F10 (B16-Flt3L) exprimant Flt3L

  1. Maintenir les cellules B16-Flt3L dans le DMEM contenant 8 % de FBS inactivé par la chaleur, 2 mM de glutamine et 100 U/mL chacun de pénicilline et de streptomycine à 37 °C sous 5 % de CO2.
  2. Semer 1 x 106 cellules B16-Flt3L dans une fiole de 175T et cultiver pendant 2 jours. Récolter les cellules lorsqu’elles sont confluentes à 75 % à 80 % comme décrit aux étapes 1.3 à 1.6 et les suspendre dans 1 mL de PBS froid.
  3. Irradier les cellules à une dose de 150 Gy de rayons gamma à l’aide d’un irradiateur à rayons X avec réglage des paramètres de 160 kV et 25 mA. Compter et vérifier la viabilité cellulaire par coloration au bleu de trypan avant l’injection.
  4. Anesthésier les souris au gaz comme décrit précédemment et stériliser le site d’injection à l’aide de lingettes alcoolisées. Injecter par voie intradermique aux souris 1 x 10 6 cellules B16-Flt3L irradiées dans 50 μL de PBS froid sur le même flanc que l’implantation tumorale d’origine, à ~1 cm du site de la tumeur primaire les jours 3,6 et 9 après l’implantation cellulaire initiale.
  5. Marquez les sites d’injection du vaccin avec un stylo coloré pour le distinguer de la tumeur primaire.
    REMARQUE: Si 0,5 x 105 cellules B16-F10 sont initialement implantées, il est recommandé d’effectuer un traitement vaccinal aux jours 8, 11 et 14.

4. Isolement des cellules immunitaires intratumorales

  1. Sacrifier des souris en utilisant du CO2 et une luxation cervicale dans la hotte à la fin de l’expérience (le jour 15 après l’implantation de la tumeur; Graphique 1).
  2. Retirez chirurgicalement la tumeur avec la peau de chaque souris et placez-la dans une plaque de 24 puits avec 1 ml 10% FBS / RPMI-1640 milieu. Sécher les tumeurs à l’aide d’une serviette en papier avant de la peser.
  3. Couper les tumeurs en petits morceaux. Ajouter 2 mL de tampon de digestion (100 μg/mL TL Liberase et 200 μg/mL DNase I en milieu RPMI-1640) et incuber pendant 25 min à 37 °C.
  4. Ajouter 10 mL de milieu FBS/RPMI-1640 à 10 % pour arrêter la digestion. Transférer les cellules à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL et utiliser le piston d’une seringue de 1 mL pour broyer le tissu sur une crépine cellulaire de 40 μm.
  5. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Resuspendre la pastille dans 5 mL de milieu spécifique au gradient de densité à 40 % dans du PBS, dilué à une concentration de 1x).
  6. Ajouter lentement la suspension cellulaire sur 5 ml de milieu spécifique au gradient de densité à 80 % contenant du PBS. Centrifuger les cellules à 325 x g avec un faible réglage des freins pendant 23 min à température ambiante (RT).
  7. Après centrifugation, prélever soigneusement la couche de leucocytes à l’interface entre 40% et 80% du milieu spécifique du gradient de densité et la faire passer à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  8. Incuber la pastille dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR) pendant 5 min à TA. Après l’incubation, ajouter 10 mL de milieu FBS/RPMI-1640 à 10 % pour étancher le tampon de lyse des globules rouges.
  9. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez les cellules en suspension dans 0,5 mL de milieu FBS/RPMI-1640 à 10 % et comptez le nombre total de cellules avant utilisation pour une analyse plus approfondie.
    REMARQUE: Recueillir la rate ou la dLN comme témoins pour la stratégie de déclenchement des sous-ensembles de cellules immunitaires par analyse de cytométrie en flux. Suivez la méthode d’isolement cellulaire décrite ci-dessus avec les modifications suivantes : Utilisez le piston d’une seringue de 1 mL pour broyer le tissu sur un filtre à mailles de 70 μm. Lavez le tissu avec 10% FBS / RPMI-1640 milieu pour obtenir des suspensions unicellulaires. Lyse le RBC tel que décrit.

5. Analyse de cytométrie en flux

REMARQUE: Les cellules prélevées dans la couche de leucocytes contiennent des cellules immunitaires et des cellules tumorales. Deux panneaux de coloration indépendants sont recommandés.

  1. Coloration de surface
    1. Transférer les cellules dans une plaque inférieure en forme de V à 96 puits. Lavez les cellules avec du PBS et colorez-les avec un colorant de viabilité cellulaire (50-100 μL/puits) pendant 15 min à TA.
    2. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Colorer les marqueurs de surface avec des anticorps mixtes (la dilution détaillée est fournie dans le tableau des matériaux) dans le tampon FACS (1 % FBS et 0,05 % NaN3 dans PBS) pendant 30 minutes sur glace (50-100 μL/ puits).
    3. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min et les laver deux fois avec un tampon FACS.
    4. Fixez les cellules avec un tampon de fixation cellulaire (50-100 μL / puits) pendant 35 minutes sur de la glace. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min et les laver deux fois avec un tampon FACS.
    5. Conserver les échantillons dans un tampon FACS (150-200 μL/tube) à 4 °C et les protéger de la lumière. Acquérir les échantillons sur un cytomètre en flux. Pour la population de DC et de lymphocytes T, suivez les stratégies de contrôle fournies à la figure 2B et à la figure 3A.
      REMARQUE : Pour la coloration des CD myéloïdes, il est recommandé d’incuber le bloquant FC (CD16/CD32 anti-souris chez le rat) pendant 15 minutes sur de la glace avant l’incubation des anticorps de surface (étape 5.1.2).
  2. Analyse des cytokines lors d’une restimulation ex vivo
    1. Plaquer les cellules dans un milieu complet (RPMI-1640 supplémenté avec 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM d’acide aminé non essentiel, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine, 50 μM de 2-mercaptoéthanol et 2 mM de L-glutamine) et stimuler avec 50 ng/mL de PMA plus 1 μM d’ionomycine en présence d’inhibiteur de transport protéique pendant 4 h à 37 °C sous 5% de CO2.
    2. Effectuer la coloration de surface des marqueurs de surface comme décrit ci-dessus à l’étape 5.1.
    3. Ajouter la solution de perméabilisation (50-100 μL/puits) et incuber pendant 5 min à TA pour la coloration intracellulaire. Incuber les cellules avec des anticorps spécifiques aux cytokines ou aux protéines nucléaires dans une solution de perméabilisation (50-100 μL/puits) pendant 60 min sur glace ou toute la nuit à 4 °C.
    4. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min et les laver deux fois avec un tampon FACS. Conservez les échantillons à 4 °C et à l’abri de la lumière. Acquérir les échantillons sur un cytomètre en flux.
      REMARQUE: La dilution des anticorps peut devoir être ajustée au besoin pour obtenir une coloration optimale.

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Résultats

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Un point noir visible des cellules B16-F10 implantées est généralement observé à la surface de la peau ~ 3 jours après l’implantation de la tumeur. Les souris sont traitées avec le vaccin tumoral 3, 6 et 9 jours après que le nodule tumoral a atteint une taille de ≥2 mm. Nous avons observé une réduction significative de la croissance tumorale dans le groupe de souris vaccinées ~2 semaines après l’implantation de la tumeur (Figure 1). À la fin de l’expérience, nous avons isolé les cellules imm...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit ici est basé sur l’étude du groupe d’Allison. Ils ont démontré que la combinaison du vaccin B16-Flt3L avec le blocage CTLA-4 a montré un effet synergique sur le taux de survie et la croissance tumorale, alors qu’aucune réduction de la croissance tumorale n’a été observée chez les souris recevant le vaccin B16-Flt3L ou le traitement par anticorps anti-CTLA-4 seul7. Des études récentes ont révélé une nouvelle voie de signalisation CTLA4-PKCη intrinsèque à Treg qui joue un rôle ob...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Stephen Schoenberger d’avoir fourni des cellules B16-Flt3L et le personnel des installations de cytométrie animale et de cytométrie en flux de l’INLJ pour un excellent soutien.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % trypsine-EDTA  ;Gibco25200-056
Omega ScientificFB-02inactivé à 10 %Lot # 209018
Aiguille 30GBD Biosciences305106
96 puits en forme de V-plaque inférieureSARSTEDT83.3926.500
Lignée cellulaire B16 exprimant Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)Don du Dr Stephen Schoenberger, LJI  ;Les ADNc Flt3L ont été clonés dans le vecteur rétroviral pMG-Lyt2, comme dans la référence 5, Figure supplémentaire 1
Lignées cellulaires B16-F10ATCCCRL-6475
Centrifuge 5810REppendorf
Cytofix tampon de fixation  ;BD BiosciencesBDB554655Tampon de fixation cellulaire (4,2 % de PFA)
Kit Cytofix/Cytoperm  ;BD Biosciences554714Kit de solutions de fixation/perméabilisation
DNase ISigma11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  ; (DMEM)  ;Corning10013CV
Pied à coulisse électronique numériqueFisherbrand14-648-17
Logiciel FlowJo  ;données du cytomètre en fluxTree Star
GolgiStop (inhibiteur du transport des protéines)BD Biosciences554724dilution 1:1500
HEPES (1M)Gibco15630-080
IonomycinSigmaI0634
Iscove' s modifié Dulbecco' s medium (IMDM)Thermo Fisher12440053
cytomètres LSR-II  ;BD BiosciencesCytomètre en flux
MEM acides aminés non essentielsGibco11140-050
pénicilline et streptomycine  ;Gibco15140-122
Percoll  ;GE Healthcare Life SciencesGE17-0891-02gradient de densité moyen spécifique
PMASigmaP1585
Tampon de lyse des globules rouges Hybri-Max liquideSigmaR7757-100ML
RPMI 1640 moyenCorning10-040-CV
RS2000 Irradiateur à rayons XRad Source Technologies
pyruvatede sodiumGibco11360-070
Filtre à cellules stériles 40 &mu ; mFisherbrand22-363-547
Passoire à cellules stériles 70 &mu ; mFisherbrand22-363-548
TL LiberaseRoche477530
Zombie Aqua kit de viabilité fixableBioLegend423101
Anticorps
Anti-mCD45BioLegend103135Clone : 30-F11
Fluorophore : BV570
Dilution : 1:200
Anti-mCD3&epsilon ;BioLegend100327Clone : 145-2C11
Fluorophore : PerCP-Cy5.5
Dilution : 1:200
Anti-mCD8BioLegend100730
100724		Clone : 53-6.7
Fluorophore : Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647
Dilution : 1:200
Anti-mCD4BioLegend100414Clone : GK1.5
Fluorophore : APC-Cy7
Dilution : 1:200
Anti-mFoxp3Thermo Fisher Scientific11577382Clone : FJK-16S
Fluorophore : FITC
Dilution : 1:100
Anti-m/hGzmBBioLegend372208Clone : QA16A02
Fluorophore : PE
Dilution : 1:100
Anti-mIFNgBioLegend505826Clone : XMG1.2
Fluorophore : PE-Cy7
Dilution : 1:100
Anti-mCD19BioLegend115543Clone : 6D5
Fluorophore : BV785
Dilution : 1:100
Anti-mGr1BioLegend108423Clone : RB6-8C5
Fluorophore : APC/Cy7
Dilution : 1:200
Anti-mCD11bBioLegend101223Clone : M1/70
Fluorophore : Pacific blue
Dilution : 1:100
Anti-mF4/80BioLegend123114Clone : BM8
Fluorophore : PECy7
Dilution : 1:100
Anti-mCD11cBioLegend117328Clone : N418
Fluorophore : PerCP Cy5.5
Dilution : 1:100
Anti-mMHCIIBioLegend107622Clone : M5/114.15.2
Fluorophore : AF700
Dilution : 1:400
Anti-mCD103BioLegend121410Clone : 2E7
Fluorophore : Alexa Fluor 647
Dilution : 1:200
Anti-mCD86BioLegend105007Clone : GL-1
Fluorophore : PE
Dilution : 1:200
FC-bloquant (anti-souris chez le rat CD16/CD32)BD Biosciences553141Clone : 2.4G2
Dilution : 1:200
FBS Analyse des

Références

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Mots-clés

Vaccin tumoral Flt3LM lanome B16 F10Cellules dendritiquesMicroenvironnement tumoralCytom trie en fluxIsolement de cellules immunitairesBlocage des points de contr le

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