Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

Summary

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

Abstract

La plupart des cellules peuvent sentir et changer leur forme pour effectuer des processus cellulaires fondamentaux. Chez de nombreux eucaryotes, le cytosquelette septine fait partie intégrante de la coordination des changements de forme tels que la cytocinèse, la croissance polarisée et la migration. Les septines sont des protéines formant des filaments qui s’assemblent pour former diverses structures d’ordre supérieur et, dans de nombreux cas, se trouvent dans différentes zones de la membrane plasmique, notamment dans les régions de courbure positive à l’échelle du micron. La surveillance du processus d’assemblage de la septine in vivo est entravée par les limites de la microscopie optique dans les cellules, ainsi que par la complexité des interactions avec les membranes et les éléments cytosquelettiques, ce qui rend difficile la quantification de la dynamique de la septine dans les systèmes vivants. Heureusement, il y a eu des progrès substantiels au cours de la dernière décennie dans la reconstitution du cytosquelette de septine dans un système sans cellule pour disséquer les mécanismes contrôlant l’assemblage de la septine à des résolutions spatiales et temporelles élevées. Les principales étapes de l’assemblage de la septine comprennent l’association et la dissociation de l’hétérooligomère de septine avec la membrane, la polymérisation en filaments et la formation de structures d’ordre supérieur par le biais d’interactions entre filaments. Ici, nous présentons trois méthodes pour observer l’assemblage de septine dans différents contextes: les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tige. Ces méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les paramètres biophysiques des septines à différents stades d’assemblage: en tant qu’octamères simples liant la membrane, en tant que filaments et en tant qu’assemblages de filaments. Nous utilisons ces paramètres associés à des mesures d’échantillonnage de courbure et d’adsorption préférentielle pour comprendre comment la détection de courbure fonctionne à diverses échelles de longueur et de temps.

Introduction

Les formes des cellules et beaucoup de leurs compartiments internes dépendent des membranes lipidiques qui les entourent. Les membranes sont des structures viscoélastiques qui peuvent être déformées par des interactions avec les protéines, le tri des lipides et l’action des forces internes et externes pour générer une variété de formes 1,2,3,4. Ces formes sont souvent décrites en termes de courbure de la membrane. Les cellules utilisent une suite diversifiée de protéines capables de s’assembler préférentiellement sur des courbures membranai....

Protocol

REMARQUE: La formation de bicouches lipidiques supportées nécessite la préparation de petites vésicules unilamellaires monodispersées (VUS). Veuillez vous référer à un protocole²⁴ publié précédemment sur la formation de SUV. En bref, tous les VUS sont formés par sonication par sonde pendant 12 min au total à 70% d’amplitude via des périodes de sonication de 4 min suivies de périodes de repos de 2 min dans l’eau glacée. Les solutions SUV doivent être bien clarifiées et monodispersées en taille. Les distributions de taille des VUS peuvent être mesurées, par exemple, par diffusion dynamique de la lumière²⁵.

Results

Après la préparation de chaque SLB, les septines ou la protéine d’intérêt peuvent être incubées avec le support souhaité et imagées via TIRFM, microscopie confocale ou SEM. Les résultats présentés ici utilisent des septines exprimées de manière recombinante et purifiées à partir d’E. coli¹⁷. En utilisant TIRFM sur des SLB planaires, il est possible de déterminer la longueur des filaments et leur flexibilité, de mesurer les coefficients de diffusion et d’observer l’assemblage dans le temps.......

Discussion

Les membranes cellulaires prennent de nombreuses formes, courbures et propriétés physico-chimiques différentes. Afin d’étudier la machinerie à l’échelle nanométrique à travers laquelle les cellules construisent des assemblages à l’échelle micrométrique, il est nécessaire de concevoir des systèmes de reconstitution minimaux de mimétiques membranaires. Ce protocole présente des techniques qui contrôlent avec précision à la fois la courbure et la composition de la membrane tout en permettant à l’utilisateur de prendre facil.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes PCR de 0,2 mL avec capuchon plat, Natural	Watson	137-211C(EX)
Tubes à faible adhérence de 0,5 mL	USA Scientific	1405-2600
Bêta-mercaptoéthanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Coverglass pour la fabrication de lamelles PEGylées	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Egg Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS Glutaraldehyde Aqueux 25 %, EM Grade	VWR	16220
EMS Tampon de cacodylate de sodium	VWR	11652
Éthanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191
Chlorure de magnésium	VWR	7791-18-6
Méthylcellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Lambeaux en microverre pour bicouches planes	Matsunami	Discontinué	22x22
Mini centrifugeuse
Microsphères de silice non fonctionnalisées	Bangs Laboratories, Inc.	Dépend de la taille : SS0200*-SS0500*	Silice en suspension aqueuse
Adhésif optique	Norland Thorlabs	NOA 68	Adhésif flexible pour verre ou plastiques
Tétroxyde d’osmium	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm	VWR	52858-000
Nettoyeur plasma	Plasma	Etch PE-25	Tension : 120V, 60Hz. Courant : 15 AMPÈRES
Chlorure de potassium	VWR	0395-1kg
Verre de protection rond, #1.5 12mm  ;   ;	VWR	64-0712
Bain sonicateur	Branson	1510R-MT	Nettoyeur à ultrasons Bransonic. 50-60 Hz. Sortie : 70W
Soy PI	Avanti Polar Lipids	840044
Centrifugeuse de table	Eppendorf	22331
Lampe UV	Spectroline	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Papier filtre en microfibre	VWR	28455-030	42,5 mm de diamètre, grade GF/C