Article de méthode

Génération d’un modèle reproductible d’activation immunitaire maternelle en milieu de gestation à l’aide de Poly(I:C) pour étudier la susceptibilité et la résilience de la progéniture

DOI :

10.3791/64095

⸱

17 août 2022

 , 
1Center for Neuroscience, UC Davis

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’infection maternelle est un facteur de risque de troubles neurodéveloppementaux. Les modèles murins d’activation immunitaire maternelle (AMI) peuvent élucider l’impact de l’infection sur le développement et le fonctionnement du cerveau. Ici, des lignes directrices générales et une procédure sont fournies pour produire une progéniture résistante et sensible exposée à l’AMI.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’activation immunitaire maternelle (MIA) pendant la grossesse est systématiquement liée à un risque accru de troubles neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques chez la progéniture. Les modèles animaux d’AIM sont utilisés pour tester la causalité, étudier les mécanismes et développer des diagnostics et des traitements pour ces troubles. Malgré leur utilisation répandue, de nombreux modèles MIA souffrent d’un manque de reproductibilité et presque tous ignorent deux aspects importants de ce facteur de risque: (i) de nombreux descendants sont résilients à l’AIM, et (ii) les descendants sensibles peuvent présenter des combinaisons distinctes de phénotypes. Pour augmenter la reproductibilité et modéliser à la fois la susceptibilité et la résilience à l’AIM, l’immunoréactivité de base (BIR) des souris femelles avant la grossesse est utilisée pour prédire quelles grossesses entraîneront une progéniture résiliente ou une progéniture présentant des anomalies comportementales et moléculaires définies après une exposition à l’AIM. Ici, une méthode détaillée d’induction de l’AIM par injection intrapéritonéale (i.p.) du poly(I:C) mimique viral double brin (ARNds) à 12,5 jours de gestation est fournie. Cette méthode induit une réponse inflammatoire aiguë chez la mère, ce qui entraîne des perturbations du développement cérébral chez la souris qui correspondent à des domaines similaires touchés dans les troubles psychiatriques et neurodéveloppementaux humains (NDD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les données épidémiologiques établissent un lien entre l’infection maternelle et un risque accru de troubles psychiatriques et de troubles du spectre autistique (TSA)1,2,3,4,5,6,7. Le modèle murin MIA a été développé pour tester la causalité et le rôle mécaniste de l’IMA dans l’étiologie de ces troubles, ainsi que pour identifier des biomarqueurs moléculaires et développer des outils diagnostiques et thérapeutiques 4,6. Malgré l’utilité de ce modèle et sa popularité croissante, il existe une variabilité considérable dans les protocoles d’induction de l’AIM dans le domaine, ce qui rend difficile la comparaison des résultats entre les études et la répétition des résultats 8,9. En outre, la plupart des itérations du modèle n’étudient pas deux aspects translationnels importants de l’AIM : (i) de nombreux descendants sont résilients à l’AIM, et (ii) les descendants sensibles peuvent présenter des combinaisons distinctes de phénotypes8.

Pour générer un modèle d’AIM reproductible, les chercheurs doivent rapporter au moins une mesure quantitative de l’ampleur de l’AIM induite chez les mères. Pour induire l’AMI pendant la gestation, notre laboratoire effectue des injections intrapéritonéales (i.p.) du polyinositique viral double brin d’ARN mimétique : l’acide polycytidilique [poly(I:C)]. Le poly(I:C) induit une cascade immunitaire semblable aux virus de la grippe lorsqu’il est reconnu par le récepteur de type Toll 3 (TLR3)10. En conséquence, poly(I:C) active la réponse de phase aiguë qui entraîne une élévation rapide des cytokines pro-inflammatoires 8,11,12. Des études antérieures ont démontré que l’élévation des cytokines pro-inflammatoires, y compris l’interleukine-6 (IL-6), est nécessaire pour produire des anomalies comportementales et une neuropathologie chez la progéniture à la suite de MIA11,12,13. Ainsi, le taux d’IL-6 dans le sérum maternel recueilli pendant son pic à 2,5 heures après l’injection de poly(I:C) est une mesure quantitative convaincante de l’AIM qui peut être utilisée pour comparer les résultats entre les laboratoires dans le domaine.

Afin de générer un modèle MIA qui aborde les éléments translationnellement essentiels de la résilience et de la susceptibilité avec un seul protocole d’induction 8,14, les chercheurs peuvent combiner des approches d’induction typiques avec la caractérisation de l’immunoréactivité de base (BIR) de la mère avant la grossesse8. Récemment, on a découvert que les souris C57BL/6 femelles vierges présentent un large éventail de réponses IL-6 à une faible dose d’exposition au poly(I:C) avant la grossesse8. Ce n’est qu’un sous-ensemble de ces femelles qui produisent une progéniture sensible, et seulement à certaines amplitudes d’activation immunitaire dictées par la combinaison du BIR et dela dose 8 de poly(I:C). MIA induit des phénotypes dans un motif en U inversé; La progéniture présente les plus grandes aberrations comportementales et moléculaires lorsque les mères sont modérément immunoréactives et que l’ampleur de l’inflammation maternelle atteint, mais ne dépasse pas, une plage critique8. Ici, une méthode détaillée sur la façon de créer de manière fiable une progéniture résiliente et sensible avec des phénotypes comportementaux divergents à la suite d’une injection de poly(I: C) en milieu de gestation est fournie.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les protocoles sont effectués sous l’approbation du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie-Davis.

1. Préparation des animaux

  1. Lors de l’acquisition d’animaux, gardez les paramètres suivants cohérents pour assurer une reproductibilité maximale.
    1. Fournisseur et emplacement du fournisseur : comme indiqué précédemment, les souris sauvages de type C57BL/6J présentent des réponses différentes à la même dose de poly(I:C) selon le fournisseur8. Choisissez un fournisseur et une souche de souris qui montrent une réponse cohérente. Pour les expériences ici, les souris C57BL / 6 obtenues de Charles River ont montré des changements constants de comportement après exposition à l’AMI en milieu de gestation, tandis que celles achetées à Taconic montrent une réponse de plus grande ampleur, avec quelques différences entre les groupes de traitement par rapport aux souris Charles River8.
    2. Souche : Les souris C57BL/6J sont les plus couramment utilisées, mais les souris BTBR et d’autres souches présentent des réponses différentielles au MIA9 en milieu de gestation. Notez ces réponses différentielles, car elles améliorent la reproductibilité de la méthode et peuvent être une variable potentielle contribuant aux résultats différentiels chez la progéniture.
    3. Pour assurer une variabilité minimale, n’utiliser que des femelles vierges pour les études MIA8 et noter clairement les détails dans les méthodes.
    4. Âge à l’expédition et période d’acclimatation: les souris expédiées avant 7 semaines présentent un système endocrinien dérégulé15. Laisser les animaux s’acclimater pendant un minimum de 48 h16,17. Commandez des souris à expédier à 7 semaines (± 2 jours) et injectez pour le BIR à 8 semaines (± 2 jours).
    5. Âge au moment de l’accouplement : le système immunitaire des animaux est dynamique tout au long de leur vie. Prenez soin de minimiser la variabilité en gardant l’âge à l’accouplement/injection aussi constant que possible18,19,20. Accoupler les souris femelles à 9 semaines (± 2 jours). N’utilisez pas de mâles de plus de 6 mois pour l’accouplement.

2. Essais et préparation des lots Poly(I:C)

  1. Préparer le poly(I:C) de haut poids moléculaire comme décrit ci-dessous.
    1. Autoclave 1,5 mL tubes microcentrifugeuses pour le stockage. Le poly(I:C) remis en suspension peut être conservé à -20 °C, mais les dégels répétés peuvent avoir une incidence sur la puissance. Chauffer le bain-marie à 70 °C.
    2. En utilisant une technique stérile, ajouter 10 mL de solution saline physiologique stérile (NaCl 0,9%) au poly(I:C) lyophilisé à l’aide d’une seringue. Chauffer au bain-marie à 70 °C pendant 15 min pour permettre un recuit complet. Retirer et laisser refroidir à température ambiante.
    3. Dans une hotte stérile, ajouter 40 ml supplémentaires de solution saline physiologique au flacon et retourner plusieurs fois pour mélanger. Retirez le dessus du flacon en poly(I:C) ou utilisez une seringue pour l’aliquoter dans des tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL. Conserver à -20 °C.
  2. Préparer le poly(I:C) de poids moléculaire mixte comme décrit ci-dessous.
    1. Autoclave 1,5 mL tubes microcentrifugeuses pour le stockage. Le poly(I:C) remis en suspension peut être conservé à -20 °C, mais des gels répétés peuvent avoir une incidence sur la puissance. Réglez le bain-marie à 50 °C.
    2. En utilisant une technique stérile, ajouter 10 mL de NaCl stérile à 0,9% au poly(I:C) lyophilisé et fixer le couvercle. Chauffer au bain-marie à 50 °C pendant 25 min pour permettre un recuit complet. Retirer et laisser refroidir à température ambiante.
    3. À l’aide d’une technique stérile, extraire la partie aliquote dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL et conserver à -20 °C.
  3. Administrer poly(I:C) par injections intrapéritonéales (i.p.) comme décrit ci-dessous.
    1. Pesez la souris pour déterminer le dosage précis. À l’aide d’une aiguille à insuline de 0,5 cc, dessinez du poly(I:C) remis en suspension. Frottez la souris et retournez pour que l’abdomen soit exposé.
    2. À l’aide de l’autre main, insérez l’aiguille à une profondeur d’environ 0,5 cm entre les deux mamelons antérieurs à un angle d’environ 45°.
    3. Tirez pour déterminer qu’aucun sang ou urine ne pénètre dans la seringue avant l’injection. Si l’un ou l’autre se produit, repositionnez l’aiguille et réessayez. Injectez lentement. Si le poly(I:C) bouillonne, l’injection était probablement sous-cutanée. Un placement d’injection réussi n’entraînera rien à dessiner une fois l’aiguille insérée, et aucune fuite une fois qu’elle est retirée.
  4. Testez la puissance du lot poly(I:C) MMW comme décrit ci-dessous8.
    1. Obtenir la forme désirée de poly(I:C). Certains fabricants permettront aux chercheurs de mettre en attente un lot complet ou partiel pendant que la puissance est testée afin que plusieurs bouteilles puissent être obtenues plus tard simultanément. En règle générale, ceux-ci peuvent être conservés lyophilisés à -20 ° C pendant plusieurs années si le gel-dégel est évité.
    2. Obtenir ou élever 30 mères gravides pour les tests. À E12.5, effectuer des injections i.p. de 20, 30 et 40 mg / kg dans un minimum de 10 souris par dose.
    3. 2,5 h après l’injection, prélever du sang par saignement de queue. Notez que le sang périphérique et le sang du tronc peuvent différer dans les niveaux de cytokines, alors gardez la méthode de collecte cohérente dans une étude.
    4. Laissez le sang coaguler pendant la nuit à température ambiante. Après 12-24 h, faire tourner les échantillons de sang à 3 768 x g à 4 °C pendant 8 min. Prélever le sérum et conserver à -80 °C jusqu’à analyse.
    5. Isoler le sérum et mesurer les taux d’IL-6 via ELISA ou Luminex. Gardez les outils de mesure cohérents car il existe une variabilité significative de la concentration totale mesurée selon les modalités et les fabricants. Déterminer l’ampleur de la réponse IL-6 nécessaire pour induire des phénotypes à l’aide d’une cohorte pilote.

3. Test d’immunoréactivité de base (BIR)

Remarque : La figure 1 montre le schéma des étapes. Utiliser un poly(I:C) de poids moléculaire différent pour les tests BIR par rapport à la gestation afin de réduire la probabilité de réponses immunitaires adaptatives au composé.

  1. Commandez des souris femelles vierges à expédier à l’âge de 7 semaines. À l’arrivée, groupez et hébergez quatre à cinq souris dans une cage et gardez le groupe logé jusqu’à ce qu’elles s’accouplent. Utilisez une encoche auriculaire ou tout autre système d’identification.
  2. Injecter aux femelles par voie intrapéritonéale 5 mg/kg de poly(I:C) 1 semaine après l’arrivée. À 2,5 heures après l’injection, lorsque l’IL-6 circulante est la plus élevée6, prélever du sang total sur les animaux injectés par coupure de queue.
  3. Laissez le sang coaguler pendant la nuit à température ambiante. Après 12-24 h, faire tourner les échantillons de sang à 3 768 x g à 4 °C pendant 8 min.
  4. Prélever un minimum de 32 μL de sérum dans chaque échantillon. Congeler à -80 °C jusqu’à ce que vous soyez prêt à tester les cytokines. Pour mesurer les niveaux d’IL-6 de manière plus cohérente, utilisez un test multiplex tel que Luminex. Gardez les outils de mesure cohérents car il existe une variabilité significative de la concentration totale mesurée selon les modalités et les fabricants.
    1. Pour le protocole d’essai de Luminex, voir Bruce et coll.21.
  5. À l’aide des niveaux relatifs d’IL-6, diviser les animaux en groupes BIR faible (quartile inférieur), moyen (deux quartiles du milieu) et élevé (quartile supérieur).

4. Méthode de purge de la queue pour la collecte de sang

REMARQUE: Pour éviter l’utilisation de sédatifs potentiellement immunomodulateurs, utilisez la méthode de prélèvement sanguin de saignement de queue.

  1. Pour l’installer, placez un support de soudure et une tasse de retenue sur une surface du côté de la main non dominante. Dans une boîte de Pétri de 35 mm, ajouter 1 à 2 ml d’huile comestible de qualité alimentaire. Retirez le capuchon du bouchon sanguin rapide et placez-le près de l’installation.
  2. Placez quelques couches de papier essuie-tout sur le support de soudure et le premier tube capillaire dans un clip, en le positionnant près de l’endroit où le bout de la queue de la souris sera tenu et maintenu parallèle à la surface de la table. Ayez une lame de rasoir à portée de main.
  3. Pour prélever le sang, procédez comme suit.
    1. Au moment requis, retirez la souris de la cage et placez-la sous la tasse avec sa queue sortant de l’encoche à la base. À l’aide d’une lame de rasoir fraîche, coupez l’extrémité (1-2 mm) de la queue et recueillez la première goutte de sang dans le tube capillaire attaché au support de soudure.
    2. Trempez les doigts de la main dominante dans l’huile comestible et utilisez-les pour presser de la base de la queue à la pointe, guidant l’extrémité de la queue vers le tube capillaire pour recueillir les gouttes de sang résultantes. Continuez jusqu’à ce que ~200 μL de sang aient été recueillis.
    3. Placez un petit capuchon d’extrémité sur l’extrémité effilée du tube capillaire avant le capuchon supérieur. Si le capuchon supérieur est mis en premier, l’échantillon sera expulsé de l’extrémité conique du tube. Placez le tube dans la coque extérieure de protection.
    4. Laisser coaguler pendant la nuit à température ambiante. Refroidir une microcentrifugeuse à 4 °C et faire tourner le sang vers le bas comme indiqué à l’étape 3.3.

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Graphique 1. Le calendrier pour tester l’immunoréactivité de base et l’accouplement des femelles vierges. Commandez aux souris d’arriver à l’âge de 7 semaines et laissez-les s’acclimater à l’installation pendant 1 semaine. Injecter aux animaux 5 mg/kg de poly(I:C) et prélever du sang 2,5 heures plus tard. Laisser coaguler le sang pendant la nuit, puis centrifuger à 3 768 x g, 4 °C pendant 8 min. Recueillir le sérum et évaluer les taux relatifs d’IL-6 via ELISA ou Multiplex. À l’âge de 9 semaines, mettez en place des couples d’accouplement. Créé à l’aide de BioRender.com Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Méthode basée sur le poids pour l’accouplement et l’injection gestationnelle de E12.5

Remarque : La figure 2 montre le schéma des étapes. Deux méthodes peuvent être utilisées pour configurer les couples d’accouplement et déterminer le point temporel E12.5. Le premier, l’accouplement chronométré, est décrit ailleurs22. Les calculs basés sur le poids peuvent également être utilisés pour évaluer une grossesse E12.523. L’avantage de cette approche est qu’elle permet de verrouiller l’âge de la mère au moment de l’accouplement, ce qui diminue la variabilité de la réponse immunitaire. Cette procédure est utilisée ici.

  1. Placez les mâles dans des cages propres et laissez-les s’acclimater pendant au moins 2 h. Cela diminue la probabilité d’agression féminine car les mâles formeront déjà une odeur dominante dans la cage.
  2. Mettez en place des couples reproducteurs mâles célibataires, femelles simples en ajoutant la femelle à la cage du mâle. Avant de la placer dans la cage, pesez-la et notez le poids. Ajoutez une petite poignée de graines de tournesol à chaque cage pour augmenter l’efficacité de l’accouplement.
  3. Pour déterminer l’étendue du gain de poids, procédez comme suit.
    1. Obtenez un groupe test de femelles et mettez en place des couples d’accouplement, en enregistrant le poids au moment de l’accouplement.
    2. Lorsque les femelles commencent à paraître visiblement enceintes, pesez-les et divisez-les en sous-ensembles de 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g et 11,5 g de gain de poids. Les fœtus à E12.5 viennent de commencer à développer des doigts distincts dans leurs pattes. Utilisez la morphologie fœtale pour déterminer le gain de poids moyen pour atteindre E12.5.
  4. À 12 jours après l’accouplement, pesez les femelles et déterminez le gain de poids. Dans une installation d’essai, les femelles gagnent constamment de 9,5 à 10,5 g entre le moment de l’accouplement et E12,5. Injecter par voie intraveineuse la dose de poly(I:C) solubilisée déterminée à l’étape 2.3.2 lorsque la prise de poids de la femelle se situe dans la plage prédéterminée.
  5. Observez la réponse à l’AMI dans les barrages à l’aide des paramètres suivants.
    1. Comportement de maladie: Recueillir des scores subjectifs sur une échelle de 1 à 3 pour déterminer comment les barrages deviennent actifs en réponse à la manipulation, où 1 est peu ou pas de mouvement en réponse à la manipulation et 3 est une réponse normale à la capture et à la retenue. Les animaux ayant une plus grande réponse immunitaire montreront moins de résistance à la manipulation8.
    2. Réponse fébrile : À l’aide d’un thermomètre IR, recueillir les températures pré-injection et 2,5 h après l’injection. Les animaux présentant des réponses immunitaires de plus grande ampleur présentent souvent une hypothermie en réponse à une activité immunitaire plus importante8.
    3. Changement de poids : Peser les animaux 24 h après l’injection. Les animaux ayant des réponses immunitaires de plus grande ampleur perdent généralement plus de poids8.
    4. Mesurer les niveaux d’IL-6 gestationnelle comme suit8.
      1. À 2,5 heures après l’injection, prélever du sang avec la méthode préférée. Laissez le sang coaguler pendant la nuit à température ambiante. Après 12-24 h, faire tourner les échantillons de sang à 3 768 x g à 4 °C pendant 8 min.
      2. Prélever le sérum et conserver à -80 °C jusqu’à analyse. Isoler le sérum et mesurer les taux d’IL-6 via ELISA ou Luminex. Gardez les outils de mesure cohérents car il existe une variabilité significative de la concentration totale mesurée selon les modalités et les fabricants.
      3. Abriter individuellement le barrage après l’injection avec un enrichissement approprié comme des nids et des dispositifs d’enrichissement. Gardez tout enrichissement cohérent car les modifications de l’enrichissement peuvent avoir des impacts significatifs sur le comportement des rongeurs 24,25,26,27,28,29.
  6. Le temps de gestation pour les souris C57 varie de 18,5 à 20,5 jours. Effectuer des vérifications de la portée pour déterminer si les animaux sont nés dans cette plage afin de s’assurer que l’injection a été effectuée au bon moment. Lorsque vous vérifiez la présence de portées, dérangez le moins possible la cage. Le stress immédiatement après la naissance de la portée peut augmenter le risque de cannibalisation.

figure-protocol-2
Graphique 2. Induction MIA. L’induction de l’AMI nécessite une évaluation de la grossesse, une injection intraveineuse de poly(I:C) et des contrôles de la portée pour assurer le bon moment de l’inflammation maternelle. Après avoir évalué le jour gestationnel par accouplement chronométré ou par la méthode de gain de poids, administrer une injection intraveineuse de poly(I:C) à E12.5. Prélever un échantillon de sang 2,5 heures après l’injection pour confirmer l’activation immunitaire et déterminer le niveau d’activation de l’IL-6. Les portées naîtront à environ E18.5-E20.5. Créé à l’aide de BioRender.com Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Enquête sur les altérations du comportement chez l’adulte MIA et la progéniture témoin (facultatif)

  1. À partir de P60 et avant d’effectuer des tests comportementaux, acclimater les animaux au contact humain avec une manipulation douce pendant 1 min par jour pendant 3 jours consécutifs. Assurez-vous que les jours de changement de cage ne se produisent pas le même jour que les tests comportementaux.
  2. Laissez toujours les souris s’acclimater à la salle de test pendant 30 à 60 minutes avant de commencer les tests comportementaux. Utilisez des pièces faiblement éclairées (15-20 lux) pour minimiser l’anxiété.
  3. Pour le toilettage répétitif, placez les souris seules dans des cages propres et sans litière avec des couvercles. À l’aide d’une caméra, enregistrez les souris dans ces cages pendant 20 minutes. Les 10 premières minutes fonctionnent comme une période d’acclimatation, les 10 dernières minutes sont la période d’essai.
  4. À l’aide de vidéos enregistrées et d’un chronomètre, notez le temps de toilettage cumulé pour chaque souris pendant la période de test de 10 minutes. D’autres comportements qui peuvent être notés à partir de ces vidéos incluent l’élevage (debout sur les pattes arrière), le gel et le saut8.
  5. Utilisez d’autres tests courants pour le modèle MIA tels que l’inhibition prépulsée (PPI) 14,30,31,32, champ ouvert12,33,34, approche sociale à 3 chambres 13,35,36, reconnaissance d’objets nouveaux 37, labyrinthe y 30, labyrinthe élevé plus labyrinthe33 et conditionnement de la peurcontextuelle / cued 38.
  6. Immunoblot postnatal8 (facultatif)
    1. À P0, décapiter rapidement et disséquer le tissu cérébral fœtal dans le HBSS, congeler dans de l’azote liquide et stocker à −80 °C.
    2. Perturber les échantillons à l’aide d’un sonde d’amplitude de 20% pendant 5 s dans 2x tampon Laemmli, puis dénaturer à 85 °C pendant 5 min. Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Collecter le surnageant et conserver à -80 °C.
    3. Mesurer la teneur totale en protéines à l’aide d’une trousse commerciale d’analyse des protéines BCA, en suivant les instructions du fabricant, et utiliser l’albumine sérique bovine comme étalon.
    4. Ajouter le dithiothréitol comme agent réducteur aux échantillons à une concentration finale de 100 mM. Chauffer à 85 °C pendant 2 min avant de charger sur un gel.
    5. Exécutez 5 μg/voie de protéines dans des conditions réductrices sur des gels TGS à 7,5 % et transférez-les électrophorètiquement sur des membranes PVDF. Bloquer les membranes avec un tampon de blocage et incuber avec les anticorps choisis.
    6. Laver trois fois avec TBS + 0,05% Tween 20 et incuber les membranes pendant 45 min avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence.
    7. Lavez quatre fois de plus dans TBS/Tween 20 et les résultats de l’image. Normaliser les résultats à l’aide de β-tubuline, détectée à l’aide d’anti-β-tubuline.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les animaux exposés à 30 mg/kg de poly(I:C) à E12.5 ne produisent pas de progéniture avec des anomalies comportementales constantes 8,31. Bien que 30 mg/kg et 40 mg/kg de poly(I:C) produisent de manière fiable des comportements de maladie chez les mères, y compris une diminution des niveaux d’activité, des réponses hypothermiques et une perte de poids, et provoquent également des élévations significatives de l’IL-6, seul un sous-ensemble de portées exposées ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’infection maternelle modifie le cours du développement du cerveau chez l’homme et chez les rongeurs et les primates non humains 4,5,7. Ici, une procédure pour induire l’AMI chez les souris à un point temporel de mi-gestation en utilisant poly(I: C) est décrite. Cette méthode intègre l’évaluation du BIR avant la grossesse, ce qui augmente la reproductibilité et offre la possibilité d’étudier mécaniquement les mécanismes qui con...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions la Dre Myka Estes pour sa persévérance à aborder la variabilité dans le modèle d’AIM chez la souris et tous les contributeurs d’Estes et al.8 pour leur travail qui a mené à l’élaboration du protocole méthodologique décrit ici. La recherche rapportée ici a été soutenue par NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) et NIMH T32MH112507 (K.P.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % NaCl sérum physiologique sans endotoxineSigma-Aldrich7647-14-5Contrôle et véhicule pour boîte de Pétri Poly(I :C)
35mmThomas Scientific1219Z45Utilisé pour retenir l’huile pendant le saignement de la queue
7,5 % Gels TGXBio-rad4561084En option
Ancare NestletsFisher ScientificNC9365966En option
anti-& bêta ;-tubulineMilliporeMAB3408en option
Bio-Plex Pro Souris Cytokines Standards Groupe IBio-rad171I50001
Bio-Plex Pro Kit de réactifs avec plaque plateBio-rad171304070M
Albumine sérique bovineThermoFisher23209En option
CentrifugeuseEppendorf5810Ren option
Seringue à insuline Covidien Monoject 1/2 mL avec 28G x 1/2 po. Spectre d’aiguille552-58457-083
DithiothreitolSigma-AldrichD9779-10G
Enrichissement de l’environnementen option Bio-servK3327 et K3322En option
EthovisionNoldusEthovisionEn option
Fluorscent-agged seondary ntibodiesLi-cor925-32213 et 925-68072En option
Huile comestible de qualité alimentaire (comme l’olive, le canola ou les pépins de raisin)Divers fournisseursUtilisé pour lubrifier la queue pendant les saignements de la queue
HBSSThermoFisher14060040Facultatif
Polyinositique de haut poids moléculaire : acide polycytidiliqueInvivogen#tlrl-pic-5Utilisé pour établir le BIR
Humane Mouse Restrainerdes femelles AIMS1000Utilisé pour retenir la souris pendant la queue bleeds
Image Studio SoftwareLicor5.2Tampon
LaemmliBio-rad1610737EDU
Luminex200ThermoFisherAPX10031
Microvette CB300 300&mu ; l Tube capillaire sériqueSarstedt16.440.100
Poids moléculaire mixte polyinositique :acide polycytidiliqueSigma-Aldrich#P0913Induction gestationnelle de MIA
monoclonal anti-MEF2AAbCamab76063
Monoclonal anti-STAT3Facultatif Signalisation cellulaire12640SObservateur facultatif
NoldusObservateur
Tampon de blocage Odyssey (TBS)Li-cor927-50003en option
Système d’imagerie Odyssey CLxLi-cor9140en option Omnipure
PBSMillipore65054Len option Kit
dosage des protéines Pierce BCAen option ThermoFisher23227
anti_TH polyclonalen option Pel-FreezP4101-150en option
Membrane PVDFBio-rad162-0177En option
Qsonica Sonicator Q500Fisher Scientific15-338-282En option
Bouchon de sang rapidePetco17140
Seal-Rite 1,5 ml Tube à microcentrifuger, naturel non stérileUSA Scientific1615-5500
Support à souderAmazonB08Y12QC73Utilisé pour maintenir le tube capillaire pendant les saignements de la queue Graines
tournesolBio-servS5137-1Utiliser pour augmenter l’efficacité de la reproduction
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Références

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