Un modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la nébulisation nasale de la bléomycine

Résumé

Divers modèles animaux de fibrose pulmonaire ont été établis à l’aide de la bléomycine pour clarifier la pathogenèse de la fibrose pulmonaire et trouver de nouvelles cibles médicamenteuses. Cependant, la plupart des modèles de fibrose pulmonaire ciblant le tissu pulmonaire ont une administration inégale des médicaments. Ici, nous proposons un modèle de fibrose pulmonaire uniforme induite par la nébulisation nasale de la bléomycine.

Résumé

La fibrose pulmonaire est caractéristique de plusieurs maladies pulmonaires humaines qui découlent de diverses causes. Étant donné que les options de traitement sont assez limitées, les modèles murins continuent d’être un outil important pour développer de nouvelles stratégies anti-fibrotiques. Dans cette étude, l’administration intrapulmonaire de bléomycine (BLM) est réalisée par nébulisation nasale pour créer un modèle murin de fibrose pulmonaire qui imite étroitement les caractéristiques cliniques de la maladie. Les souris C57BL/6 ont reçu une MLB (7 U/mL, 30 min/jour) par nébulisation nasale pendant 3 jours consécutifs et ont été sacrifiées les jours 9, 16 ou 23 pour observer des changements inflammatoires et fibrotiques dans le tissu pulmonaire. Le BLM nasal en aérosol ciblait directement les poumons, entraînant une inflammation et une fibrose pulmonaires généralisées et uniformes. Ainsi, nous avons réussi à générer un modèle murin expérimental de fibrose pulmonaire humaine typique. Cette méthode pourrait facilement être utilisée pour étudier les effets de l’administration de divers aérosols nasaux sur la physiopathologie pulmonaire et valider de nouveaux traitements anti-inflammatoires et anti-fibrotiques.

Introduction

La fibrose pulmonaire est un processus pathologique progressif dans lequel un dépôt excessif de composants de la matrice extracellulaire, principalement du collagène de type I, dans l’interstitium des poumons entraîne une altération de la fonction pulmonaire¹. La physiopathologie de la fibrose pulmonaire est complexe et les options de traitement sont actuellement assez limitées. Les modèles murins restent un outil important pour étudier les mécanismes pathogènes qui contribuent à l’émergence et à la progression de la maladie, ainsi que de nouvelles stratégies de développement de médicaments.

Une variété de modèles animaux de fibrose pulmonaire reposent sur l’instillation intratrachéale de BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Cependant, la distribution des changements fibrotiques provoqués par le BLM dans les poumons n’est pas uniforme et les animaux risquent d’être asphyxiés pendant le processus d’instillation. Bien que l’injection intrapéritonéale de BLM induise des changements fibrotiques relativement uniformes dans les poumons, elle nécessite plusieurs doses en raison d’un ciblage médicamenteux insuffisant. L’administration intratrachéale d’aérosol via un laryngoscope ne nécessite pas de trachéotomie ou de ponction, et la distribution du médicament qui en résulte dans le poumon est optimale. Cependant, les particules aérosolisées sont grosses (5-40 μm) et ne peuvent donc pas atteindre la zone sous-pleurale du tissu pulmonaire.

Dans cette étude, l’administration intrapulmonaire de BLM est réalisée par nébulisation nasale. Pendant la nébulisation, les souris respiraient spontanément et inhalaient les particules de médicament. Les particules aérosolisées avaient une taille de 2,5 à 4 μm, ce qui leur permettait non seulement de se répartir uniformément dans tout le poumon, mais aussi d’atteindre la zone sous-pleurale. Sous faible grossissement, les caractéristiques histopathologiques pulmonaires les plus significatives des patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) sont la gravité variable des lésions, une distribution incohérente, une distribution alternée des différentes lésions de phase et la présence d’une inflammation interstitielle, de lésions fibrotiques et de modifications pulmonaires en nid d’abeille, alternant avec du tissu pulmonaire normal. Ces modifications pathologiques impliquent principalement le parenchyme sous-pleural périphérique ou le septum lobulaire autour des bronchioles. Ainsi, étant donné que cette approche permet aux particules BLM d’atteindre la zone sous-pleurale des poumons, ce modèle simule étroitement les caractéristiques cliniques de la maladie chez l’homme.

Protocole

Le Comité d’études animales de l’Hôpital de l’amitié sino-japonaise (Pékin, Chine) a approuvé toutes les procédures impliquant des souris qui ont été effectuées dans le cadre de cette étude (NO.190108). Les souris ont été gardées dans la salle des animaux stériles de l’Institut de recherche médicale clinique de l’amitié Chine-Japon, avec une température ambiante de 20-25 °C, une humidité relative de 40 à 70 %, une intensité de lumière animale de 15-20 LX et une alternance de lumière et d’obscurité pendant 12 h/12 h. Les animaux avaient libre accès à la nourriture et à l’eau.

1. Souris

1. Assurez-vous que tous les animaux sont acclimatés à l’hébergement pendant 7 jours avant la nébulisation.
2. Utiliser des souris mâles C57BL/6, âgées de 8 à 10 semaines, pour la nébulisation.

2. Nébulisation nasale de la bléomycine

1. Préparation de la bléomycine
   ATTENTION : BLM est un poison chimique, qui tue les tumeurs mais peut également endommager les cellules normales et les tissus normaux.
   1. Préparez la solution BLM sur un banc propre.
      1. Pour obtenir la concentration de travail (7 U/mL), remettre en suspension 15 U de chlorhydrate BLM dans 2,14 mL de solution saline normale. Mélangez soigneusement le BLM remis en suspension jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.
   2. Conservez la solution de travail à 4 °C ou sur de la glace et utilisez-la dans un délai de 1 jour. Avant la nébulisation, amenez la solution BLM à température ambiante.
2. Anesthésie
   1. Préparez-vous à l’anesthésie en dissolvant 0,1 g de pentobarbital sodique dans 10 ml de solution saline normale. Conservez la solution d’anesthésie de travail dans un endroit sombre à 4 °C et utilisez-la dans les 3 jours.
   2. Anesthésier les souris en injectant le pentobarbital sodique dans l’abdomen, à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 26 G, à une dose finale de 75 mg/kg de poids corporel.
      REMARQUE : Dans cette étude, les souris n’ont pas répondu à cette dose pendant au moins 30 min. Si nécessaire, ajustez la dose en concertation avec le vétérinaire en fonction de la réponse de la souris.
   3. Après quelques minutes, appuyez sur les orteils de la souris anesthésiée avec l’index et le pouce pour vous assurer que le réflexe de retrait du membre a disparu.
3. Préparation du système de nébulisation
   1. Après avoir calibré l’instrument, fixez la souris anesthésiée à l’aide d’un couvercle à mailles souples (Figure 1A), ajoutez la solution BLM fonctionnelle à la tête de pulvérisation supérieure de la tour d’exposition à l’aide d’une pipette (Figure 1B) et faites fonctionner le nébuliseur pendant 30 minutes pour obtenir une atomisation stable.
      REMARQUE : Le flux de travail est illustré à la Figure 1C,D. Pour connaître les étapes détaillées de fonctionnement du logiciel, reportez-vous à la figure supplémentaire S1 et à la figure supplémentaire S2, qui illustrent les étapes 2.3.1.1 à 2.3.1.9.
      1. Double-cliquez sur l’icône flexiWare 8 (Figure supplémentaire S1A), cliquez sur Session d’expérimentation (Figure supplémentaire S1B) et cliquez sur le bouton Nouvelle étude (Figure supplémentaire S1C).
      2. Modifiez le nom de l’expérience (figure supplémentaire S1D) et modifiez le titre et le propriétaire (figure supplémentaire S1E).
      3. Choisissez le modèle IX-4DIO (figure supplémentaire S1F), saisissez l’opérateur (figure supplémentaire S1G), cliquez sur le bouton Confirmer (figure supplémentaire S1H) | Bouton suivant (figure supplémentaire S1I).
      4. Choisissez la pompe et cliquez sur suivant (Figure supplémentaire S1J) | Bouton suivant (Figure supplémentaire S2A) | Bouton suivant (Figure supplémentaire S2B) | Bouton Terminer (figure supplémentaire S2C).
      5. Cliquez sur les paramètres pour Continuous-1Lmin (trois points, figure supplémentaire S2D) | DIO1, réglez le rapport cyclique (%) sur 25 %, puis cliquez sur OK (figure supplémentaire S2E).
      6. Cliquez sur DIO2, réglez le rapport cyclique (%) sur 25 %, puis cliquez sur OK (figure supplémentaire S2F).
      7. Cliquez sur DIO3, réglez le cycle d’utilisation (%) sur 25 %, puis cliquez sur OK (figure supplémentaire S2G).
      8. Cliquez sur DIO4, réglez le rapport cyclique (%) sur 25 %, puis cliquez sur OK (figure supplémentaire S2H).
      9. Cliquez sur le bouton vert supérieur (à gauche) pour commencer à fonctionner, puis cliquez sur le bouton rouge (à droite) pour arrêter le travail. Cliquez sur le x dans le coin supérieur droit pour quitter (Figure supplémentaire S2I).
   2. Dans le groupe BLM, atomisez 12 souris à la fois, quatre fois au total, jusqu’à un total de 48 souris. Atomisez six souris à la fois dans le groupe témoin normal avec une solution saline normale.
4. Récupération d’animaux
   1. Après un traitement dans le nébuliseur pendant 30 min, déplacez la souris dans une cage de récupération équipée d’un coussin chauffant.
   2. Observez les souris jusqu’à ce qu’elles soient pleinement conscientes.
   3. Une fois que la souris est confirmée en bon état, ce qui signifie qu’elle peut se déplacer librement, remettez-la dans sa cage d’origine. Ne le placez pas avec d’autres animaux tant qu’il n’est pas complètement rétabli.
   4. Vérifiez les indices physiologiques, y compris la fréquence respiratoire, la survie et tout symptôme, deux fois au cours des 24 heures suivant le traitement par BLM.

3. Traitement des tissus pulmonaires

1. À 9, 16 et 23 jours après l’administration de BLM, sacrifiez six souris en leur injectant dans l’abdomen du pentobarbital sodique (dose finale de 100 mg / kg de poids corporel).
2. Retirez la trachée et les poumons et rincez immédiatement avec une solution saline tamponnée au phosphate froid.
3. Fixez le poumon gauche dans un tampon de formol neutre à 10 % pendant 24 h avant l’intégration de la paraffine.
4. Coloration à l’hématoxyline-éosine (coloration H&E)
   1. Déshydratez le tissu pulmonaire fixe dans un déshydrateur.
   2. Placez le bloc de tissu pulmonaire déshydraté dans une boîte de dissolution de cire à 56 °C pendant 1 h.
   3. Pour l’enrobage, versez la paraffine fondue dans la boîte du moule, puis placez rapidement le bloc de tissu imprégné de paraffine au fond de la boîte du moule, refroidissez et solidifiez.
   4. Fixez le bloc de cire incrusté sur le microtome, ajustez la table de tranchage de haut en bas jusqu’à une position appropriée, poussez la lame, ajustez l’échelle et coupez une tranche d’une épaisseur de 4 μm. À l’aide d’une pince à épiler, placez la tranche dans une boîte de présentation remplie d’eau pour la dérouler (face avant vers le haut).
   5. Rapiécez et faites cuire les tranches. Une fois que la tranche de cire s’est complètement déroulée, placez la lame de verre contre la tranche de cire à un angle de 135°, utilisez une pince à épiler pour déplacer la tranche de cire sur la lame de verre, soulevez la lame de verre et ajustez la position de la tranche de cire si nécessaire. Placez les lames avec les tranches de cire montées sur une table à température constante à 47 °C pendant 1 min pour permettre à nouveau aux tranches de se dérouler ; une fois que les tranches sont complètement plates, placez les lames dans un incubateur à 62 °C pendant 1 h.
   6. Pour le déparaffinage, placez les lames cuites dans du xylène pendant 20 minutes deux fois.
   7. Pour la réhydratation, placez les lames dans une série d’alcool gradué pour réhydrater les tranches de tissu pulmonaire : 100 % d’alcool pendant 2 min, 95 % d’alcool pendant 1 min, 90 % d’alcool pendant 1 min, 85 % d’alcool pendant 1 min, 75 % d’alcool pendant 1 min et de l’eau distillée pendant 3 min.
   8. Teindre les sections à l’hématoxyline pendant 5 min. Laver deux fois pendant 1 min, puis placer dans une solution de différenciation d’alcool à 0,5 % d’acide chlorhydrique pendant 5 s, laver à l’eau pendant 1 min deux fois, placer dans une solution de coloration bleue pendant 8 à 10 s, rincer deux fois à l’eau du robinet et teindre avec de l’eosin pendant 30 s.
   9. Pour la déshydratation et la décoloration, placez les sections tachées dans de l’alcool à 75 % pendant 1 min, de l’alcool à 85 % pendant 1 min, de l’alcool à 90 % pendant 1 min, de l’alcool à 95 % pendant 1 min, de l’alcool à 100 % pendant 1 min, puis du xylène pendant 1 min deux fois, et retirez tout le liquide restant avec du papier absorbant.
   10. Pour le montage, placez une goutte de solution d’étanchéité à la gomme neutre au milieu de la tranche et montez une lamelle.
5. Norme de classification morphologique du tissu pulmonaire de souris
   1. À l’aide de la méthode décrite par Ashcroft et coll., demander à un chercheur en aveugle du groupe expérimental de sélectionner au hasard trois champs microscopiques dans chaque échantillon et d’observer le degré de fibrose pulmonaire à un grossissement de 100x : grade 0, poumon normal ; grade 1, alvéoles légèrement enflées, fibrose légère localisée ; Fibrose marquée de grade 2 (épaisseur de la paroi alvéolaire supérieure à trois fois la normale), avec foyers fibreux ; grade 3, zones continues de fibrose (épaisseur de la paroi alvéolaire trois fois supérieure à la normale) ; grade 4, fusion des foyers fibreux, la zone fibreuse représentant moins de 10 % du tissu pulmonaire ; grade 5, les foyers fibreux sont fusionnés, la zone de fibrose est de 10% à 50% et la structure alvéolaire est considérablement endommagée ; grade 6, grands foyers fibreux continus (plus de 50 % du tissu pulmonaire) ; grade 7, l’espace alvéolaire est rempli de tissu fibreux, des bulles pulmonaires sont présentes ; grade 8, fibrose complète.
   2. Attribuez une note correspondant à la note à chaque champ de vision (p. ex., la note 4 équivaut à quatre points) et notez chaque groupe de six échantillons séparément.

Résultats

Des lésions pulmonaires ont été induites par la nébulisation du BLM, et les animaux témoins ont été nébulisés avec le même volume de solution saline normale. Les souris ont été nébulisées une fois par jour pendant 3 jours, 30 minutes par jour, en utilisant une concentration de BLM de 7 U/mL. Les souris ont été sacrifiées aux jours 9, 16 et 23 après l’administration de BLM pour la coloration H&E (Figure 2B). Des lésions pneumoniques diffuses avec perte de l’architecture alvéolaire normale, épaississem...

Discussion

L’injection intratrachéale de bléomycine entraîne une réponse inflammatoire et fibrotique aiguë dans les deux poumons et peut être considérée comme une approche efficace pour établir un modèle murin expérimental de maladie pulmonaire interstitielle humaine. L’administration intratrachéale est la voie d’administration la plus couramment utilisée 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	; DP721	Fibrosis modèle
médicaments 0,9 % solution saline pour injection	Baxter Healthcare (Tianjin) Co., Ltd.		Préparation de la bléomycine
1 mL seringue	BD	300481	Anesthésier les animaux
10 % tampon de formol neutre	TechaLab Biotech Company		Fixer le tissu pulmonaire
15 mL tube de centrifugation	430790	Se préparer à l’anesthésie
20 ° ; C réfrigérateur	Groupe New-fly	BCD-213K	Stocker les médicaments
4 ° ; C réfrigérateur	New-fly group	BCD-213K	Stocker les médicaments
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
bleu dos liquide	Beijing Chemical Works		tissu coloration
banc propre	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co., Ltd.		Bléomycine préparation
fluide de différenciation	Beijing Chemical Works		coloration des tissus
Balance électronique	METTLER TOLEDO	AA-160	Préparer pour l’anesthésie
coloration à l’éosine	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		coloration des tissus
Coussin chauffant	HIDOM		Incubation de souris
coloration à l’hématoxyline	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		coloration tissulaire
saline tamponnée au phosphate (PBS)	Hyclone	SH30256.01	Tissu pulmonaire propre
logiciel de dessin	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Appareil d’atomisation
Microscope à fluorescence vertical	Olympus	BX53	Observer la tranche

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