Préparation standardisée de l’anneau coronaire de rat et enregistrement en temps réel des changements de tension dynamiques le long du diamètre du vaisseau

La maladie coronarienne (CORONA) a été largement reconnue et préoccupante comme une maladie cardiovasculaire typique et représentative, étant la principale cause de décès dans les pays développés et en développement ^1,2. En tant que voie d’approvisionnement en sang et en oxygène pour une fonction physiologique cardiaque normale, le sang circulant pénètre et nourrit le cœur par deux artères coronaires principales et un réseau vasculaire sanguin à la surface du myocarde ^3,4. Les dépôts de cholestérol et de graisse dans les artères coronaires coupent l’approvisionnement en sang du cœur et la réponse inflammatoire violente du système vasculaire, provoquant une athérosclérose, une angine stable, une angine instable, un infarctus du myocarde ou une mort cardiaque subite ^5,6. En réponse à la sténose pathologique des artères coronaires, le rythme cardiaque physiologique accéléré compensatoire satisfait l’apport sanguin du cœur lui-même ou des organes vitaux du corps en augmentant la sortie du ventricule gauche⁷. Si la sténose coronaire prolongée n’est pas soulagée à temps, de nouveaux vaisseaux sanguins étendus peuvent se développer dans certaines zones du cœur⁸. À l’heure actuelle, le traitement clinique de la coronaropathie adopte souvent une thrombolyse médicamenteuse ou une thrombolyse mécanique chirurgicale et un pontage vasculaire bionique exogène avec des médicaments fréquents et une grande invalidité chirurgicale⁹. Par conséquent, l’étude fonctionnelle de l’activité physiologique de l’artère coronaire est toujours une percée urgente pour les maladies cardiovasculaires¹⁰.

Il n’existe aucun moyen technique disponible pour détecter l’activité physiologique coronaire, à l’exception des systèmes de télémétrie sans fil, qui peuvent enregistrer dynamiquement la pression coronaire in vivo , la tension vasculaire, la saturation en oxygène du sang et les valeurs de pH¹¹. Par conséquent, compte tenu du secret et de la complexité de la texture des artères coronaires, l’identification précise et l’isolement des artères coronaires sont sans aucun doute les meilleurs choix pour explorer de multiples mécanismes de la coronaropathie in vitro⁴.

Un système multimyographique en série, en particulier un détecteur de tension microvasculaire à micrographie filaire (voir Tableau des matériaux), est un dispositif commercialisable très mature pour enregistrer les changements de tension tissulaire in vitro de petites trompes vasculaires, lymphatiques et bronchiques avec les caractéristiques d’enregistrement dynamique continu et de haute précision¹². Ledit système a été largement utilisé pour enregistrer les caractéristiques de tension tissulaire in vitro des structures de cavités d’un diamètre de 60 μm à 10 mm. Les caractéristiques de chauffage continu de la plate-forme de la micrographie filaire compensent largement la stimulation de l’environnement extérieur défavorable. Pendant ce temps, les entrées constantes du mélange gazeux et les valeurs de pH nous permettent d’obtenir des données de tension vasculaire plus précises dans un état physiologique similaire¹³. Cependant, compte tenu de la complexité de la localisation anatomique des artères coronaires du rat (Figure 1), son isolement a laissé perplexe et limité l’exploration par le mécanisme de maladies cardiovasculaires diversifiées et de développement de médicaments. Par conséquent, le présent protocole présente en détail la localisation anatomique et le processus de séparation de l’artère coronaire du rat, suivis d’une mesure de tension sur la plate-forme de la micrographie^{filaire 14}.

Le protocole animal a été examiné et approuvé par le comité de gestion de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (dossier n° 2021-11). Des rats mâles Sprague Dawley (SD) (260-300 g, âgés de 8 à 10 semaines) ont été utilisés pour la présente étude. Les rats ont été gardés dans une chambre à animaux et étaient libres de boire et de manger pendant l’expérience.

1. Préparation de la solution

1. Préparer une solution saline physiologique (PSS) en dissolvant 118 mM de NaCl, 4,7 mM de K⁺, 2,5 mM de_CaCl2, 1,2 mM de KH₂PO₄, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glucose et 5 mM de HEPES (voir tableau des matériaux).
2. Préparer une solution saline à haute teneur en K⁺ en dissolvant 58 mM de NaCl, 60 mM de K⁺, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO4, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glucose et 5 mM de HEPES.
3. Saturer les deux solutions ci-dessus et faire une bulle avec un gaz mélangé de 95% O₂ et 5% de CO₂. Pendant ce temps, maintenez les valeurs de pH de la solution entre 7,38 et 7,42 avec 2 mM de NaOH.
   REMARQUE: Pour plus d’informations sur la préparation de la solution, veuillez consulter la référence¹⁵.

2. Dissection de l’artère coronaire du rat

1. Anesthésier le rat par inhalation de 2% d’isoflurane. Confirmez l’anesthésie profonde par pincement des orteils et, si nécessaire, administrez des anesthésiques supplémentaires. Ensuite, ouvrez immédiatement la cavité thoracique pour exposer le cœur sur la table d’opération portable à la suite d’un rapport précédemment publié¹².
2. Après avoir dissocié et retiré le cœur, drainez le sang résiduel de toutes les cavités cardiaques en serrant légèrement avec des pinces en plastique médical. Placez rapidement le cœur prétraité dans une boîte de Petri contenant 95% O₂ + 5% de CO₂ saturé PSS à 4 °C, ayant une valeur de pH de 7,40.
3. Pour identifier avec précision la position anatomique des artères coronaires, ajustez la posture du cœur isolé au microscope optique selon le schéma schématique (Figure 2A).
   REMARQUE: Sur la vue frontale, l’oreillette droite et l’artère pulmonaire étaient respectivement en haut à gauche et en haut à droite.
   1. Couper les cavités ventriculaires gauche et droite le long du septum interventriculaire à partir de la racine de l’artère pulmonaire à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler (figure 2B).
4. Pour dissocier les artères coronaires gauche et droite du tissu myocardique, disséquez le ventricule droit sous un microscope anatomique optique pour exposer complètement la branche de l’artère coronaire droite. Identifiez ensuite la position de l’artère coronaire gauche en faisant pivoter le tissu cardiaque de 45° dans le sens des aiguilles d’une montre (Figure 2D).
5. Après avoir retiré le tissu myocardique collant environnant, discernez explicitement les artères coronaires gauche (environ 5 mm) et droite (environ 5 mm). Séparez immédiatement les artères coronaires au milieu et immergez-les complètement dans le PSS à 4 °C. Acquérir un anneau artériel d’environ 2 mm en coupant verticalement l’artère détachée avec des ciseaux anatomiques pour enregistrer la tension vasculaire sous différents stimuli (Figure 2E).

3. Suspension et fixation de l’anneau artériel

REMARQUE : Pour plus de détails sur cette étape, veuillez consulter la référence¹⁴.

1. Préparer deux fils en acier inoxydable de 2 cm (voir tableau des matériaux) et pré-tremper dans une solution PSS à 4 °C saturée de 95 % O₂ + 5 % de CO₂. Passez les deux fils parallèlement à travers l’anneau artériel avec la direction du vaisseau sous un microscope anatomique optique et avec des fils de longueur égale exposés aux deux extrémités de la cavité vasculaire.
2. Fixez l’anneau artériel avec le fil d’acier à l’avant et à l’arrière dans le bain de la micrographie de fil remplie de PSS bouillonnant avec 95% O₂ + 5% CO₂. Faites pivoter le bouton de vis horizontal pour un espacement approprié entre l’avant et l’arrière afin que les deux fils soient horizontaux et que l’anneau artériel soit dans un état naturel de relaxation.
3. Après avoir installé le bain DMT sur l’appareil thermostatique, ouvrez le logiciel d’acquisition de données (voir tableau des matériaux) pour vous assurer que le signal de chemin correspondant a été enregistré. Réglez les paramètres suivants : étalonnage de l’oculaire (mm/div) : 0,36 ; pression cible (kPa) : 13,3 ; IC1/IC100 : 0,9; temps moyen en ligne: 2 s; temps de retard: 60 s. Les étapes de la fixation de l’anneau artériel sont illustrées à la figure 3.

4. Normalisation de la tension vasculaire dans l’anneau artériel du rat

REMARQUE: Pour différents échantillons de cavité, une tension initiale optimale était nécessaire pour que les vaisseaux maintiennent une activité exceptionnelle in vitro. Pour plus de détails, veuillez consulter la référence¹⁵.

1. Atteindre la tension initiale optimale de l’anneau artériel en appliquant une tension raisonnable le long du diamètre du vaisseau.
   NOTE: Sur la base de l’étude précédente¹⁶, la tension maximale induite par l’agoniste a été atteinte à la valeur du facteur k de 0,90 avec la tension d’étirement initiale de 1,16 ± 0,04 mN / mm (valeurs de référence pour différents échantillons de récipients: valeur k, 0,90-0,95; tension initiale, 1,16-1,52 mN / mm).
2. À ce stade, réglez la valeur de tension vasculaire affichée sur zéro. Ensuite, appliquez un stimulus de traction de 3 mN sur l’anneau artériel en faisant pivoter l’axe en spirale du bain.
3. Après incubation pendant 1 h dans un tampon PSS saturé d’oxygène à 37 °C, pH 7,40, réglez à nouveau la valeur de tension sur 0 mN sur le panneau de commande de tension de la micrographie filaire. Le processus de prise de la tension initiale de l’anneau artériel est illustré à la figure 4.

5. Détection de la réactivité de l’anneau de l’artère coronaire

1. Effectuer l’activité contractile de l’anneau artériel coronaire avec la technique du myographe^{filaire 14}, et valider en trois opérations distinctes en stimulant avec 60 mM de solution K⁺ pendant 10 min chacune.
2. Après chaque stimulation, rincez le bain avec du PSS saturé d’oxygène jusqu’à ce que le tonus vasculaire revienne à son état initial.
   NOTE: Ce n’est que lorsque la fluctuation de tension des trois mesures parallèles était inférieure à 10% et que l’amplitude de chaque contraction était supérieure à 1 mN / mm, que des anneaux artériels qualifiés et hautement actifs pouvaient être utilisés pour d’autres expériences. La vérification de l’activité de l’anneau coronaire du rat est illustrée à la figure 5.

6. Traitement post-chirurgical

1. Après la chirurgie, euthanasier les animaux en suivant des protocoles approuvés par l’établissement.
   NOTE: Pour la présente étude, les animaux ont été euthanasiés en inhalant un excès d’isoflurane.

Anatomiquement positionnées, les artères coronaires de rat réparties et cachées profondément dans le tissu myocardique n’étaient pas facilement reconnaissables. En comparant les artères coronaires des humains (figure 1A) et des rats (figure 1B), une séparation rapide et précise des artères coronaires de rat a été effectuée selon le processus d’échantillonnage de la figure 2. Après avoir localisé avec précision l’oreillette droite, l’artère pulmonaire et l’apex de l’avant sous un microscope optique, le myocarde a été disséqué le long de la ligne noire continue illustrée à la figure 2A. Environ 5 mm de la branche interventriculaire de l’artère coronaire étaient clairement exposés à notre vue. Après une séparation fine du myocarde collant entourant l’artère septale ventriculaire, un fil de 2 cm a été utilisé pour traverser une boucle de 2 mm de l’artère coronaire dans le sens de l’alignement vasculaire. Instantanément, l’anneau coronaire détaché de 2 mm a ensuite été solidement fixé dans le bain de DMT, comme le montre la figure 3. Après l’application d’une tension initiale de 3 mN sur l’anneau artériel (figure 4), sa tension a dépassé plus de 2 mN en appliquant 60 mM K+ en parallèle trois fois (figure 5). Ainsi, les procédures ci-dessus avaient abouti à un anneau coronaire isolé avec une excellente activité physiologique.

Des K+ cumulatifs (20, 28, 39, 55, 77 et 108 mM) ou de l’U46619 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 et 1 μM) ont été ajoutés au bain de DMT 620M, entraînant une augmentation dépendante de la concentration du tonus vasculaire in vitro . La concentration suivante de K+ ou U46619 (un agoniste du récepteur du thromboxane A2 (TP)15 a été ajoutée lorsque l’effet de vasoconstriction a atteint un plateau. Les résultats expérimentaux sont présentés à la figure 6A, B. Pour les anneaux coronaires isolés rétrécis par K+ (60 mM) et U46619 (0,3 μM), l’apigénine (1, 3, 10, 30 et 100 μM), médicament d’essai, a provoqué une vasodilatation d’une manière étonnamment dépendante de la concentration (figure 6C).

Figure 1: Dessins à main levée des artères coronaires humaines et de rats. (A) présente les caractéristiques de la distribution superficielle des artères coronaires gauche et droite à partir de la vue de face du cœur humain et est facilement reconnaissable à l’œil nu. (B) montre les artères coronaires gauche et droite du rat profondément dans le myocarde et leur septum interventriculaire ramifié. Abréviations : RCA = artère coronaire droite; ACV = artère coronaire gauche; ISB = branche du septum interventriculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Diagramme de la séparation des artères coronaires chez le rat. (A) L’oreillette droite, l’artère pulmonaire, l’apex et la ligne anatomique du cœur du rat ont été observés de face sous un microscope optique. (B) Les lumens ventriculaires gauche et droit ont été incisées le long du septum à partir de la racine de l’artère pulmonaire. (C) Localisation anatomique des artères coronaires gauche et droite et de leur branche septale interventriculaire. (D) Un anneau de 2 mm de l’artère. (E) L’anneau artériel est fixé par fil le long de la direction du vaisseau. Abréviations: RA = oreillette droite; PA = artère pulmonaire; RCA = artère coronaire droite; ISB = branche du septum interventriculaire; ACV = artère coronaire gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Schéma de la procédure de montage artériel. L’anneau artériel avec fil a été transféré à (A) et serré sur le bain de DMT (B).. Le fil d’acier a été fixé et vissé dans le sens des aiguilles d’une montre en haut à gauche (C) et en bas à gauche (D). (E) Les mâchoires écartées ont été vissées pour permettre au deuxième fil de passer à travers l’anneau artériel. (F) Le deuxième fil était parallèle à travers l’anneau artériel. Le fil d’acier a été fixé et vissé dans le sens des aiguilles d’une montre en haut à droite (G) et en bas à droite (H). (I) Les mâchoires écartées ont été vissées lâchement pour laisser l’anneau artériel à l’état naturel. Les lignes vertes représentent les fils et les cylindres orange représentent un anneau artériel isolé de 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Procédure de normalisation de l’anneau artériel. Après que la tension de l’anneau artériel isolé fixe soit revenue à 0 mN, une force de traction de 3 mN a été appliquée à l’anneau artériel à un moment donné. Après 5 min, la tension vasculaire a diminué à 2,5 mN. En augmentant la tension à 3 mN et en la maintenant stable pendant 5 min, la tension de l’anneau coronarien a été initialisée à 0 mN et reposée pendant 1 h pour des études ultérieures sur la tension vasculaire de différents stimuli. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Le test de réactivité vasculaire. Trois applications de 60 mM K+ ont stimulé la tension de l’anneau coronarien isolé à plus de 2 mN et les trois mesures étaient inférieures à 10%, suggérant une activité vasculaire supérieure. Après chaque stimulation, le bain a été doucement rincé avec une solution PSS saturée en oxygène à 37 °C jusqu’à ce que la tension soit de 0 mN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Traceur représentatif de la contraction cumulative de la dose de l’artère coronaire du rat via K+ ou U46619. À mesure que la dose de K+(A) et d’U46619 (B) augmentait, la force augmentait en fonction de la dose. (C) fait référence à l’effet relaxant de l’apigénine sur un cycle artériel contracté de 60 mM K+ et 0,3 μM u46619 en fonction de la concentration. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Les auteurs n’ont rien à divulguer.