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Traitement médicamenteux par cathéter veineux central dans un modèle murin d’anévrisme de l’aorte abdominale induit par l’angiotensine II et surveillance par échographie 3D

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DOI :

10.3791/64124

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4 août 2022

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1Division of Vascular Surgery, Department of General Surgery, Medical University of Vienna and Vienna General Hospital, 2Leeds Institute for Cardiovascular and Metabolic Medicine, School of Medicine, University of Leeds, 3Leeds Vascular Institute, Leeds General Infirmary, 4Department for Visceral, Thoracic and Vascular Surgery, Technical University of Dresden and University Hospital Carl-Gustav Carus, 5Division of Cardiovascular and Interventional Radiology, Division of Molecular and Gender Imaging, Department of Biomedical Imaging and Image Guided Therapy, Medical University of Vienna and Vienna General Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’implantation consécutive d’une pompe osmotique pour induire un anévrisme de l’aorte abdominale par libération d’angiotensine II chez des souris déficientes en apolipoprotéine E (ApoE) et d’un orifice d’accès vasculaire avec un cathéter de veine jugulaire pour un traitement médicamenteux répété. Le suivi du développement de l’anévrisme par échographie 3D est efficacement réalisé malgré les implants dorsaux.

Résumé

Étant donné que les options de traitement pharmaceutique font défaut dans la prise en charge clinique de l’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA), des modèles animaux, en particulier des modèles murins, sont appliqués pour faire progresser la compréhension de la pathogenèse de la maladie et identifier des cibles thérapeutiques potentielles. L’essai de nouveaux médicaments candidats pour bloquer la croissance de l’AAA dans ces modèles nécessite généralement une administration répétée de médicaments au cours de l’expérience. Ici, nous décrivons un protocole compilé pour l’induction AAA, l’insertion d’un cathéter intraveineux pour faciliter un traitement prolongé et la surveillance AAA en série par échographie 3D. Les anévrismes sont induits chez les souris déficientes en apolipoprotéine E (ApoE) par libération d’angiotensine II pendant 28 jours à partir de mini-pompes osmotiques implantées par voie sous-cutanée dans le dos de la souris. Par la suite, l’intervention chirurgicale pour le cathétérisme de la veine jugulaire externe est effectuée pour permettre un traitement médicamenteux intraveineux quotidien ou des prélèvements sanguins répétés via un bouton d’accès vasculaire sous-cutané. Malgré les deux implants dorsaux, le suivi du développement de l’AAA est facilement facilité par l’échographie 3D séquentielle semi-automatisée, qui fournit des informations complètes sur l’expansion du diamètre et du volume de l’aorte et sur la morphologie de l’anévrisme, comme illustré par des exemples expérimentaux.

Introduction

Un anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) est une dilatation pathologique d’un vaisseau due à des processus inflammatoires et destructeurs tissulaires dans la paroi aortique qui peuvent finalement entraîner une rupture et la mort du patient. Malgré des progrès considérables dans la réparation chirurgicale de l’AAA, il manque à ce jour un traitement médicamenteux conservateur pour bloquer la progression de l’expansion de l’anévrisme et potentiellement réduire le risque de rupture. Des modèles animaux ont été développés pour élucider les déclencheurs et les médiateurs de la maladie et pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Les modèles murins d’AAA sont largement appliqués et couvrent les différentes observations des tissus humains. En raison de leurs différences pathomechanistes, plus d’un modèle est souvent appliqué pour étudier la fonction particulière des molécules/voies ou l’efficacité des médicaments thérapeutiques potentiels 1,2. Parmi les modèles les plus couramment utilisés d’induction de l’AAA figure l’administration d’angiotensine-II (Ang-II) chez des souris déficientes en apolipoprotéine E (ApoE KO)3, qui présente une pathogenèse plus chronique par rapport aux modèles qui reposent sur la formation d’anévrisme à partir d’une agression aiguë de la paroi aortique 4,5. Ainsi, le modèle Ang-II semble particulièrement adapté au suivi de la progression de la maladie et il a récemment été démontré qu’il ressemblait étroitement à la maladie AAA humaine en ce qui concerne les réponses métaboliques et inflammatoires6. Notamment, le modèle Ang-II présente non seulement le développement AAA, mais aussi la formation d’anévrisme thoracique, ainsi que la dissection aortique avec formation de thrombus intra-muros.

Les traitements visant à cibler la progression de l’AAA déjà établi plutôt qu’à prévenir l’initiation de la maladie peuvent avoir une valeur translationnelle plus élevée, car les patients présentent une affection préexistante nécessitant un traitement 7,8. Pour un plan expérimental comparable, la taille de l’aorte doit être surveillée avant et après l’induction de l’AAA afin de définir un seuil de développement de la maladie et de stratifier potentiellement les souris en groupes de traitement.

Le mode d’administration du médicament dépend de l’absorption et de la stabilité de la substance respective. Les injections intrapéritonéales (i.p.) sont le plus souvent utilisées en raison de leur facilité d’application, ne nécessitant pas d’anesthésie, et de l’absence de contraintes de volume d’injection9. La pharmacocinétique doit toutefois être prise en compte lors du choix de la voie d’administration, car les substances administrées par IP sont principalement absorbées par la circulation porte hépatique et peuvent subir un métabolisme hépatique avant d’atteindre la circulation, ce qui pourrait entraîner des concentrations plasmatiques variables en fonction de l’effet de premier passage10. L’injection intraveineuse (i.v.) produit la biodisponibilité la plus élevée des substances, et le défi de l’accès intraveineux répétitif peut être contourné par l’utilisation de cathéters et de ports d’accès vasculaire pour l’administration quotidienne11,12,13. En ce qui concerne le contexte AAA, la distribution de médicaments en circulation facilite l’exposition directe à l’anévrisme à des concentrations définies.

Nous décrivons ici un workflow pour induire l’AAA dans le modèle murin Ang-II via l’implantation sous-cutanée d’une pompe osmotique, pour un traitement médicamenteux intraveineux quotidien via un orifice d’accès vasculaire relié à un cathéter inséré dans la veine jugulaire externe, ainsi que pour le suivi de la taille de l’anévrisme par échographie 3D14 malgré la présence de deux implants dorsaux.

Protocole

Les expérimentations sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique local et le ministère autrichien des Sciences (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), conformément à la directive européenne 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et à la loi autrichienne de 2012 sur l’expérimentation animale. Les critères d’évaluation sans cruauté ont été fixés comme suit : perte de ≥15 % du poids corporel, éviter la consommation de nourriture et/ou d’eau, activité réduite (hypokinésie) ou dyskinésie, ou tremblements prolongés, grattage, respiration laborieuse ou posture voûtée malgré la gestion de la douleur et des symptômes. Si nécessaire, un animal est euthanasié sous anesthésie profonde, c’est-à-dire un cocktail de surdosage de kétamine (environ 100 mg/kg) et de xylazine (environ 5 mg/kg), ou par luxation cervicale. Pour les interventions chirurgicales, une technique aseptique et des gants stériles / propres sont utilisés partout.

1. Implantation de pompe

  1. Anesthésie
    1. Maintenir les souris déficientes en ApoE (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) avec un régime alimentaire normal et inclure de préférence des animaux mâles âgés de 12 à 14 semaines dans les expériences pour représenter la prédominance masculine dans la maladie humaine3.
    2. 1 jour avant la chirurgie (j-1, pré-OP), préparer et remplir les pompes osmotiques avec la concentration souhaitée d’angiotensine II en fonction du poids de la souris en suivant le protocole du fabricant et incuber les pompes dans une solution saline à 37 °C pendant la nuit15.
      Exemple : Pour une souris de 25 g, à l’aide de pompes osmotiques (voir le tableau des matériaux) avec un débit de 1000 ng/kg/min et un débit de pompe de 0,25 μL/h pendant 28 jours, dissoudre 1,8 mg d’Ang-II dans 300 μL de solution saline (concentration de 6000 ng/μL pour délivrer 1500 ng/h d’Ang-II). Chargez la solution avec l’aiguille de remplissage émoussée dans la pompe, puis insérez le modérateur de débit pour fermer la pompe.
    3. Placez la souris dans la chambre d’anesthésie à 3%-4% d’isoflurane mélangé avec 2 L/minO2 jusqu’à ce qu’elle perde connaissance. Déplacez la souris sur une table chauffée (37 °C) en position couchée sur le ventre et maintenez l’anesthésie à l’isoflurane à 1,8%-2% par un cône nasal.
    4. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.
    5. Injectez à la souris 2,5% de buprénorphine dans une solution saline à 10 μL / g de souris par voie sous-cutanée et vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement d’orteil.
    6. Rasez une petite zone sur le côté supérieur gauche de la souris au-dessus de l’omoplate. Appliquer une solution de povidone iodée à 10 % (p/v) pour désinfecter la zone rasée.
  2. Insertion de la pompe (5-7 min, réalisée sans microscope)
    1. Vérifiez que la souris est complètement anesthésiée par pincement des orteils et faites une incision transversale de 1 cm dans la peau du haut du dos avec un scalpel entre la ligne scapulaire médiane et gauche.
    2. Tenez la peau avec une pince et utilisez des ciseaux émoussés et incurvés pour créer une poche sous-cutanée en poussant vers le membre postérieur gauche. Ouvrez les ciseaux, retirez les ciseaux ouverts de la coupe et répétez pour élargir la poche.
    3. Insérez doucement la pompe dans la poche avec le modérateur de débit vers la queue (pour minimiser l’interférence potentielle de la libération d’Ang-II par le site d’incision).
      REMARQUE: La poche doit non seulement être assez large pour l’insertion de la pompe, mais aussi pour que la peau ne soit pas serrée autour de la pompe, et il doit y avoir au moins 5 mm entre la pompe et le site d’incision pour permettre une cicatrisation optimale de la plaie.
    4. Fermez la plaie avec des sutures interrompues résorbables 4-0.
    5. Injectez à la souris 10% de glucose dans une solution saline à 10 μL / g de souris par voie sous-cutanée.
    6. Appliquez un vaporisateur de povidone iodée sur la plaie fermée et laissez la souris reprendre conscience sous une lampe chauffante, puis remettez-la dans la cage avec 7,5 mg de piritramide (pour une gestion prolongée de la douleur) et 20 ml de glucose à 5% dans 200 ml d’eau potable pendant 3 jours après l’opération.
    7. Vérifiez les souris plusieurs fois par jour pour des signes de douleur ou de détresse.
      REMARQUE : Étant donné que les ruptures aortiques se produisent à un taux de 20 % à 40 % et principalement dans les 3 à 10 premiers jours suivant l’opération, le risque de douleur ou de détresse intense prolongée doit être minimisé par une surveillance fréquente des animaux. Les principaux signes de rupture imminente sont : séparation du groupe, posture voûtée, diminution de la mobilité (jusqu’à la paralysie des membres postérieurs) et diminution ou absence de réponse lors de la manipulation.

2. Cathétérisme de la veine jugulaire

REMARQUE: Cette intervention chirurgicale nécessite un microscope avec un grossissement de 8x-10x.

  1. À l’aide du système d’accès vasculaire (voir Tableau des matériaux), préparer le cathéter en coupant le côté 3Fr à la longueur désirée (~5-7 mm avant l’ancrage en silicone) et en poussant le cathéter sur le connecteur métallique 22 G du système d’accès vasculaire (SAV) avec un chevauchement d’au moins 3 mm. Placez le capuchon en aluminium sur le bouton pour protéger le port.
  2. Préparez des ligatures de soie 6-0 de 1-1,5 cm de long.
  3. Placez la souris dans la chambre d’anesthésie à 3%-4% d’isoflurane mélangé avec 2 L/minO2 jusqu’à ce qu’elle perde connaissance.
  4. Déplacez la souris vers une table chauffée (37 °C) en décubitus dorsal et maintenez l’anesthésie à l’isoflurane à 1,8%-2% par un cône nasal.
  5. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.
  6. Injecter à la souris 2,5% de buprénorphine dans une solution saline à 10 μL / g de souris par voie sous-cutanée.
  7. Rasez la fourrure du côté droit du cou sur le côté ventral et sur le côté droit du haut du dos (le côté gauche aura la pompe osmotique implantée).
  8. Appliquez la solution povidone-iode pour désinfecter la zone rasée.
  9. Vérifiez que la souris est complètement anesthésiée par pincement des orteils.
  10. Préparation de la veine jugulaire (5-10 min, réalisée au microscope)
    1. Faites une incision cutanée supraclaviculaire transversale de 0,5 cm sur le côté droit du cou sur la clavicule droite.
    2. Utilisez une pince à épiler microchirurgicale émoussée pour séparer le tissu conjonctif et la graisse, exposant ainsi la veine jugulaire externe. Évitez de déchirer les petits vaisseaux sanguins dans la graisse.
    3. Isoler au moins 5 mm du vaisseau, près des muscles pectoraux.
    4. Disséquer le tissu contondant sous la veine à l’aide de micro-pincettes pliées et passer à travers 2-3 des ligatures 6-0.
      REMARQUE: Si des branches latérales sont identifiées dans la zone d’intérêt, soit la ligature doit être insérée pour être caudale à la branche latérale, soit la branche latérale doit être ligaturée de façon permanente en isolant et en attachant avec une ligature 6-0.
    5. Rentrez les ligatures et ajoutez une goutte de solution saline au site.
  11. Implantation de boutons (5-7 min, réalisée sans microscope)
    1. Retournez la souris et placez-la en position couchée; Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement d’orteil et appliquez la solution de povidone iodée pour désinfecter la zone rasée.
    2. Faites une incision sagittale de 1 cm sur le haut du dos avec un scalpel entre les lignes scapulaires médiane et droite.
    3. Utilisez des ciseaux incurvés émoussés pour créer une poche circulaire légèrement plus grande que la taille du SVA autour du site d’incision par dissection contondante.
    4. Utilisez les ciseaux incurvés émoussés pour creuser un tunnel crânien, sur l’épaule droite, vers l’incision ventrale au niveau du cou, en ouvrant légèrement les ciseaux, puis en tirant les ciseaux ouverts et en répétant l’action au fur et à mesure qu’elle est enfoncée.
      REMARQUE: La souris peut être tournée sur son côté gauche pour cette étape.
    5. Une fois que le tunnel a atteint l’incision ventrale, passez à travers des pinces chirurgicales de l’incision ventrale à l’incision dorsale.
    6. Fixez l’extrémité 3Fr du cathéter à la pince et tirez le cathéter à travers le tunnel afin qu’il soit hors de l’incision du col ventral et que le SVA soit en place à l’incision dorsale.
    7. Insérez le disque de feutre chirurgical du VA par voie sous-cutanée à l’incision à l’arrière.
    8. Détachez le cathéter et rincez avec une solution saline ou une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (PBS-/-), vérifiez la perméabilité en utilisant l’extrémité de la fourche de l’outil de manipulation pour retirer le capuchon protecteur en aluminium, puis utilisez l’extrémité magnétique pour maintenir le bouton et injecter avec une seringue de 1 mL fixée à l’injecteur correspondant jusqu’à ce que le liquide fuie de l’extrémité 1Fr.
      NOTE: Le rinçage du cathéter peut également être effectué à l’étape 2.1.
    9. Appuyez sur le bouton caudale dans la poche et fermez la peau sur le disque feutre du SAV, sous la bride du SAV, avec au moins deux sutures interrompues 4-0 crâniennement.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de tension sur la peau autour du bouton.
  12. Cathétérisme veineux (7-10 min, réalisé au microscope)
    1. Retournez la souris en décubitus dorsal, vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement d’orteil et ajoutez une goutte de solution saline au site de coupe.
    2. Attachez la première ligature autour du cathéter et de la veine jugulaire avec 2-3 nœuds aussi loin que possible crânienne pour ligaturer la veine et ancrer le cathéter à l’extérieur. Déplacez la deuxième ligature aussi près que possible des muscles pectoraux.
    3. Raccourcissez le cathéter à la longueur requise de sorte que ~3-5 mm du cathéter soit dans la veine en coupant avec des micro-ciseaux à un angle diagonal pour créer une extrémité tranchante.
    4. Percez un trou dans la veine à l’aide d’une aiguille de 27 G fixée à une seringue de 1 ml remplie de solution saline en tirant sur la ligature crânienne sécurisée et en poussant l’aiguille parallèlement à la veine.
      REMARQUE: Si le sang de refoulement fuit de la veine, utilisez un coton-tige pour appliquer une pression jusqu’à ce que le saignement cesse.
    5. Insérez le cathéter dans la veine de la même manière en tirant sur la ligature crânienne sécurisée et en glissant le cathéter dans la veine à l’aide de la pince à épiler pliée. Poussez le cathéter jusqu’à ce qu’il soit aligné avec la veine.
    6. Attachez la deuxième ligature sur la région où le cathéter est inséré dans la veine avec 2-3 nœuds et vérifiez qu’il n’y a pas de fuite de sang. Une troisième ligature et une partie du tissu adipeux local peuvent être utilisées pour sécuriser le cathéter.
    7. Coupez l’extrémité excédentaire des deux ligatures avec des micro-ciseaux et ajoutez une goutte de solution saline.
    8. Fermez la peau avec des sutures interrompues résorbables 4-0.
    9. Injectez à la souris 10% de glucose dans une solution saline à 10 μL / g de souris par voie sous-cutanée.
    10. Injectez à la souris le volume désiré d’inhibiteur ou de PBS/solution saline en utilisant l’extrémité de la fourche de l’outil de manipulation pour retirer le capuchon protecteur en aluminium, puis l’extrémité magnétique pour maintenir le bouton et injecter avec une seringue de 1 mL fixée à l’injecteur.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas d’air ou de bulles d’air dans la seringue d’injection en appuyant sur le piston jusqu’à ce qu’une goutte de liquide sorte avant l’injection. Maintenez une pression positive sur le piston tout en déconnectant la seringue avec l’injecteur du SAV pour éviter d’aspirer du sang dans l’extrémité du cathéter et de provoquer un blocage du cathéter.
    11. Appliquez un vaporisateur de povidone iodée sur la plaie fermée et laissez la souris reprendre conscience sous une lampe chauffante, puis remettez-la dans la cage avec 7,5 mg de piritramide (pour une gestion prolongée de la douleur) et 20 ml de glucose à 5% dans 200 ml d’eau potable pendant 3 jours après l’opération.
    12. Vérifiez les souris plusieurs fois par jour pour des signes de douleur ou de détresse.
  13. Injections quotidiennes (<5 min)
    1. Pour l’injection quotidienne, placer la souris dans la chambre d’anesthésie à 3%-4% d’isoflurane mélangé à 2 L/min O2 jusqu’à ce qu’elle soit inconsciente et que son rythme respiratoire soit ralenti, puis injecter comme à l’étape 2.12.10. Vérifiez le cou pour détecter tout signe d’enflure après l’injection, ce qui indiquerait que le cathéter n’est plus inséré dans la veine. Notez également que l’injection ne sera pas possible si le cathéter est obstrué.
      REMARQUE: Une injection de 10 μL / g de poids de souris 1x par jour est bien tolérée par les souris.

3.3D échographie

  1. Préparez le système d’imagerie par ultrasons, la table chauffante et le chauffe-gel, fixez le transducteur au système et installez-le au-dessus de la scène en position transversale (c.-à-d. perpendiculaire à la colonne vertébrale de la souris).
  2. À l’aide du logiciel d’échographie, réglez les paramètres pour un gain de 30 dB, une profondeur d’image de 9,0 mm et une largeur d’image de 8,08 mm.
  3. Placez la souris dans la chambre d’anesthésie à 3%-4% d’isoflurane mélangé avec 2 L/minO2 jusqu’à ce qu’elle perde connaissance. Déplacez la souris sur une table chauffée (37 °C) en décubitus dorsal et maintenez l’anesthésie à l’isoflurane à 1,8%-2% à travers un cône nasal.
  4. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.
  5. Rasez la fourrure sur l’abdomen de la souris. Appliquez la crème dépilatoire pendant 1 min si nécessaire, puis essuyez et nettoyez avec de la gaze humide.
  6. Ajoutez une goutte de gel d’électrode à chacune des quatre électrodes d’électrocardiogramme (ECG) sur la scène et collez-y les extrémités de la souris.
  7. Étalez du gel à ultrasons chauds sur l’abdomen de la souris et abaissez l’émetteur pour le mettre en contact avec l’animal.
  8. Identifiez l’aorte comme un vaisseau circulaire à pulsations rapides.
    REMARQUE: La veine cave inférieure (IVC) sera située à côté de l’aorte, et si la sonde est fermement enfoncée, l’IVC sera comprimée tandis que l’aorte reste stable. La confirmation que le vaisseau analysé est l’aorte plutôt que l’IVC peut être obtenue en utilisant l’onde de pouls Doppler (mode PW), avec un angle de 65°. L’aorte aura une vitesse d’onde de pouls élevée.
  9. Localisez l’artère rénale gauche et surveillez manuellement la zone jusqu’à 12 mm crânienne pour vous assurer qu’il n’y a pas d’interférence dans la zone d’intérêt (c.-à-d. aorte suprarénale). Retournez à l’artère rénale gauche puis réglez la sonde à 6 mm crânienne de l’artère rénale gauche.
    REMARQUE: L’échographie 3D enregistrera la longueur spécifiée (c.-à-d. 12 mm) à partir de la moitié (6 mm) caudale du point d’origine et jusqu’à la longueur spécifiée (12 mm) crâniennement. Les étapes de dépannage pour les interférences comprennent une légère pression avec le transducteur, le soulèvement puis l’abaissement à nouveau, l’application de plus de gel à ultrasons et l’inclinaison de l’angle de la scène.
  10. Acquisition d’ultrasons 3D
    1. Réglez le déclenchement respiratoire sur un délai de 25% et une fenêtre de 50% et le déclencheur ECG (T1) sur 50 ms (pour enregistrer la dilatation systolique maximale de l’aorte).
      REMARQUE : Les contrôles respiratoires peuvent être optimisés pour chaque animal en fonction de la fréquence respiratoire et de l’effort nécessaire pour s’assurer que les artefacts de mouvement sont éliminés.
    2. À partir des options 3D, définissez la distance de numérisation sur 11,96 mm avec une taille de pas de 0,076 mm, ce qui donne 157 images.
    3. Le programme acquerra automatiquement les 157 images en environ 1-2 min. Faites défiler pour vérifier la qualité de l’image, répétez si la qualité de l’image est inférieure, puis enregistrez l’image.
  11. Acquisition de diamètre 2D
    1. Désactivez le déclenchement respiratoire et l’ECG, et localisez manuellement la zone ayant le plus grand diamètre dans l’étirement de 12 mm de l’aorte suprarénale.
    2. Acquérir une image en mode B16.
    3. De plus, sans déplacer le transducteur, obtenez une image de visualisation kilohertz dépendante par ECG (EKV) avec les paramètres standard du système sur le même site.
  12. Fin de l’analyse
    1. Essuyez le gel à ultrasons de l’abdomen et remettez la souris dans sa cage. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement.

4. Analyse échographique

  1. Analyse des volumes
    1. Dans le logiciel d’analyse, ouvrez l’image du mode 3D et, sous le menu Traitement de l’image, appuyez sur Charger en 3D, qui compilera les 157 images 2D en une image 3D (cube).
    2. Dans le menu Mesure du volume , choisissez Méthodes parallèles et rotationnelles, puis le logiciel affichera l’image 3D dans un seul volet.
    3. Sous Volume, appuyez sur Démarrer et dessinez le premier contour autour de la paroi interne de l’aorte en cliquant pour ajouter le premier point, en déplaçant le curseur autour de l’aorte, puis en cliquant avec le bouton droit pour terminer le contour.
    4. Sautez 9-10 images (0,75-1 mm), puis dessinez un autre contour de la même manière. Répétez ces étapes jusqu’à ce que la dernière image soit atteinte. Cela devrait se traduire par 16-17 contours.
      REMARQUE: Les première et dernière images doivent avoir des contours dessinés pour que le volume correct sur 12 mm puisse être calculé.
    5. Sélectionnez le premier contour dans le menu et choisissez Affiner. Cela lancera l’algorithme de détection des bords pour ajuster étroitement la ligne à la paroi du navire. Déplacez les points sur le contour en les faisant glisser vers une nouvelle position afin que le contour aligne avec précision le bord de la paroi interne de l’aorte.
      REMARQUE: Dans le modèle Ang-II, un thrombus intra-muros peut être présent. Comme il s’agit d’une caractéristique commune de ce modèle, la mesure du volume devrait inclure le thrombus.
    6. Affinez tous les contours et appuyez sur Terminer pour enregistrer l’analyse. Le volume calculé sera affiché dans le coin inférieur gauche.
  2. Analyse du diamètre
    REMARQUE : Les mesures de diamètre peuvent être effectuées de l’intérieur à l’intérieur, de la paroi extérieure à la paroi extérieure ou de la paroi intérieure à la paroi extérieure, mais elles doivent être cohérentes pour toutes les mesures. Cependant, dans le modèle Ang-II, un thrombus intra-muros pourrait être présent, ce qui devrait être inclus dans l’analyse.
    1. À partir de l’image en mode 3D : Évaluez les 157 images pour identifier le diamètre maximal par inspection visuelle. Ensuite, dans le menu Mesure , choisissez Linéaire et tracez plusieurs lignes sur l’aorte pour déterminer le plus grand diamètre.
    2. À partir de l’image en mode B ou EKV (visualisation kilohertz ECG-gated : Dans la boucle ciné, identifier l’expansion maximale de l’aorte (au niveau de la systole) par inspection visuelle. Ensuite, dans le menu Mesure , choisissez Linéaire et tracez plusieurs lignes sur l’aorte pour déterminer le plus grand diamètre.
      REMARQUE: L’ECG peut être utilisé pour déterminer le cycle cardiaque, mais l’identification visuelle donne des résultats précis.

Résultats

Des résultats représentatifs montrent le développement et la progression des anévrismes suprarénaux tels que surveillés par échographie au départ, au jour 8 et au jour 27 (Figure 1A). Une coloration trichrome (Figure 1B) de l’aorte du jour 27 sur la Figure 1A illustre davantage la morphologie de l’anévrisme formé avec dissection de la paroi et thrombus intra-muros. Le volume aortique (mm3) a été déterminé sur une période de 12 mm14, et le diamètre aortique maximal a également été mesuré à partir des images EKV. Un seuil de croissance volumique de 125 % entre le début de l’étude et le jour 8 a été fixé pour définir le développement initial de l’anévrisme. Sur la base des données recueillies sur 2 ans (2020-2021, n = 157), seulement 9% des animaux n’ont pas réussi à former un AAA selon ce seuil. Cependant, 35 % des souris ont subi des ruptures aortiques (thoraciques ou abdominales) avant l’implantation du cathéter au jour 9, ce qui a donné lieu à un total de 56 % des animaux restants atteints d’une maladie AAA établie susceptibles d’être stratifiés en groupes de traitement (figure 1C). Il convient de noter que parmi nos témoins PBS historiques (n = 21), les anévrismes se sont développés à des degrés divers (intervalle: 128% -314%, croissance moyenne de 199% ± 55% du volume aortique SD au jour 8). Il est important de noter qu’une relation inverse a été observée entre l’expansion initiale et la progression ultérieure de la maladie, c’est-à-dire que 55% des anévrismes à progression rapide (>200% de croissance du volume au jour 8) n’ont pas progressé avant le jour 27, tandis que 80% des autres anévrismes (>125% et <200% de croissance du volume au jour 8) ont continué à se développer jusqu’à la fin de l’expérience (Figure 1D).

Comme récemment rapporté 14,17, les méthodes décrites ont été établies, validées et mises en œuvre avec succès, par exemple pour documenter l’effet thérapeutique d’un inhibiteur de la citrullination des histones (GSK484, pour l’inhibition de la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles) pour bloquer la progression de l’AAA établi. Des souris déficientes en ApoE ont reçu de l’Ang-II à 1000 ng / kg / min par des pompes osmotiques implantées par voie sous-cutanée pendant 28 jours. Les animaux ont été stratifiés 1:1 à GSK484 (0,2 μg/g/jour) ou un traitement PBS basé sur le volume aortique mesuré le jour 8 et ont subi la procédure de cathétérisme de la veine jugulaire le jour 9. Des injections de médicaments ont été effectuées quotidiennement dans un volume de 10 μL / g de poids de souris jusqu’à la fin de l’étude17. La figure 2 montre des résultats échographiques exemplaires (n = 2/groupe) (évolution temporelle de l’expansion absolue et relative du volume ou du diamètre), révélant que le traitement par GSK484 inhibait la progression de l’AAA, tandis que les anévrismes continuaient à s’agrandir chez les souris témoins.

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Figure 1 : Formation et progression de l’AAA dans le modèle murin Ang-II détecté par échographie 3D. (A) L’aorte suprarénale a été surveillée par échographie 3D au départ (BL), au jour 8 (d8) et au jour 27 (d27) après l’implantation de la pompe Ang-II. Le volume a été mesuré sur un tronçon de 12 mm de l’aorte surrénale (157 images) sur la base d’une image reconstruite en 3D. Le diamètre aortique maximal a été déterminé à partir d’images EKV. (B) Coloration trichrome d’une coupe transversale de l’aorte du jour 27 après sacrifice de souris et prélèvement d’organes. La présence d’une dissection de l’aorte est indiquée par L1/L2 (lumen 1 et lumen 2), et le thrombus intramural est noté * en A et B. (C) Taux d’incidence de l’AAA (croissance du volume aortique de >125 % à partir de la LB) au jour 8 et des ruptures aortiques au cours des 9 premiers jours (thoracique ou abdominale) à partir d’un ensemble de données recueillies sur 2 ans (n = 157). (D) Fréquence de progression du jour 8 au jour 27 de la formation initiale rapide (croissance du volume aortique de >200% de la BL au jour 8) par rapport aux anévrismes à croissance modérée (>125% et <200% du volume aortique de BL au jour 8) chez les souris contrôlées par PBS (n = 21). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Résultats exemplaires de l’inhibition de la citrullination des histones pour bloquer la progression de l’AAA dans le modèle Ang-II par injection intraveineuse de GSK484 ou de PBS via un bouton d’accès vasculaire. (A) Volume aortique (mm3) mesuré sur un étirement de 12 mm de l’aorte surrénale. (B) Croissance du volume aortique calculée par rapport à la valeur initiale (BL = 100%). (C) Diamètre aortique maximal déterminé à partir des images EKV. (D) Croissance du diamètre aortique calculée à partir de BL. Les données GSK484 ont été extraites d’une étude publiée précédemment17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le modèle Ang-II est l’un des modèles murins d’AAA les plus couramment utilisés en raison de ses faibles exigences techniques et de ses caractéristiques particulières ressemblant à la maladie humaine 3,6. Le temps de chirurgie est d’environ 10 minutes par animal, et l’implantation de la pompe sous-cutanée est bien tolérée par les souris si la poche sous-cutanée est suffisamment large et placée bas sur le dos de l’animal, loin du site d’incision, afin de ne pas interférer avec la cicatrisation de la plaie. Lorsque la peau est serrée autour de la pompe, une irritation des tissus peut survenir, ce qui peut provoquer une inflammation et une croûte et potentiellement perturber le mécanisme de libération de la pompe par pression osmotique. La mesure du volume d’Ang-II restant dans la pompe au moment du sacrifice d’animaux permet de savoir si l’Ang-II a été libéré avec succès au cours des 28 jours.

Le modèle Ang-II a récemment été proposé pour être bien adapté à l’étude de l’anévrisme aortique et de la progression de la dissection, car il présente une ressemblance avec les caractéristiques humaines des deux6. Il est important de noter que tester des médicaments candidats pour bloquer l’expansion aortique et influencer le remodelage correspondrait à la demande clinique actuelle. Dans notre cadre expérimental, un seuil pour la formation d’anévrisme a été défini avant le début du traitement sur la base d’une croissance volumique de 125% au jour 8 par rapport à la ligne de base, ce qui explique la variation naturelle de la taille absolue de l’aorte chez la souris. Le seuil et le point temporel ont été dérivés d’une évolution temporelle initiale qui a confirmé la destruction de la paroi de l’aorte en histologie (données non présentées) et a entraîné 35% des ruptures et 56% ont observé des AAA avant l’implantation du cathéter. Bien qu’un seuil minimal de maladie établie ait été appliqué pour l’inclusion dans l’étude, il a été observé par la suite qu’une forte expansion initiale de l’aorte peut également limiter l’applicabilité expérimentale. Les anévrismes qui ont progressé rapidement pour atteindre >200 % de volume au jour 8 n’ont pas dépassé cette taille dans 55 % des cas (Figure 1D). Cela doit être pris en compte lors de la conception expérimentale et du calcul de la taille de l’échantillon, car cela pourrait masquer le véritable effet d’un traitement. Une autre facette de ce modèle est les ruptures aortiques fréquentes (thoracique ou abdominale), survenant à des taux de 20% à 40% et principalement dans les 10 premiers jours suivant l’implantation de la pompe Ang-II 3,18,19. Ainsi, en choisissant le début du traitement au jour 9, un taux élevé d’anévrismes établis a été atteint, et le cathétérisme de la veine jugulaire a été essentiellement effectué sur des souris qui devaient survivre jusqu’à la fin de l’expérience (seulement 3/24 souris de notre groupe témoin historique se sont rompues après le jour 9), économisant ainsi du temps, des efforts, et le coût.

En dehors des ruptures de l’aorte, qui constituent une affection grave, l’implantation concomitante du cathéter avec bouton d’accès vasculaire et pompe osmotique a été bien tolérée par les souris, sans effet notable sur la mobilité ou le comportement après la récupération de la chirurgie. La procédure de cathétérisme de la veine jugulaire devrait prendre environ 30 minutes pour les chercheurs formés. La durée d’exposition à l’anesthésie (isoflurane) doit être réduite au minimum, et le rythme respiratoire de l’animal doit être étroitement surveillé pour prévenir la dépression respiratoire, qui peut entraîner une issue fatale si elle n’est pas résolue20. La perte de sang après perforation de la veine jugulaire pour l’insertion du cathéter - entraînant la mort de l’animal si elle est majeure - pourrait potentiellement se produire lorsque la veine jugulaire n’est pas correctement ligaturée crânienne ou qu’une branche latérale alimentant la zone isolée du vaisseau n’est pas fermée. Dans ce cas, une pression avec un coton-tige doit être appliquée sur le site de ponction jusqu’à ce que les fuites de sang ralentissent ou cessent, puis l’insertion et la ligature du cathéter doivent être effectuées le plus rapidement possible; Un petit morceau du pansement de collagène peut être utilisé temporairement pour aider à l’hémostase.

La perméabilité du cathéter est l’un des facteurs les plus importants, car la déconnexion du cathéter de la veine ou du bouton d’accès entraîne une administration incorrecte du médicament où le médicament fuit dans l’espace sous-cutané. Suite à la recommandation du fabricant d’un chevauchement minimum de 3 mm entre le cathéter et le raccord métallique, un seul cas de déconnexion du cathéter du côté du bouton (indiqué par le liquide injecté fuyant du site d’incision au niveau du bouton) a été enregistré sur 3 ans dans ce modèle (2020-2021, n = 73), qui a été fixé en ouvrant la plaie et en rétablissant la connexion en chirurgie. De plus, un taux d’échec de perméabilité du cathéter d’environ 10% dans notre groupe témoin PBS historique (2/21) a été observé en raison de l’occlusion du cathéter (rendant impossible l’injection), de la déconnexion du cathéter de la veine (indiquée par un gonflement apparent du cou pendant l’injection) ou des complications de cicatrisation des plaies. Ces problèmes peuvent être liés à des blessures auto-infligées, c’est-à-dire des égratignures ou des morsures de souris. Notamment, les traitements médicamenteux qui interfèrent avec la cicatrisation des plaies peuvent augmenter les taux d’échec. Les étapes de dépannage pour améliorer le taux de perméabilité comprennent l’augmentation de la longueur du cathéter inséré dans la veine, l’assurance que les ligatures sont bien nouées autour du cathéter et de la veine, et l’application de la technique de pression positive suivant les recommandations du fabricant, comme décrit à l’étape 2.12.10., lors de l’injection. La perméabilité du cathéter doit en outre être vérifiée au moment du sacrifice d’animaux par dissection et inspection visuelle au microscope. Il convient de noter que le volume quotidien de solution injectable doit être soigneusement pris en compte. Comme le volume plasmatique régule la pression artérielle, le volume d’injection peut affecter l’expansion de l’AAA et, par conséquent, les animaux témoins doivent recevoir la procédure fictive avec le volume du porteur. D’après notre expérience (et des observations non publiées), une quantité quotidienne allant jusqu’à 250 μL de PBS semble être bien tolérée. Enfin, comme pour l’implantation de la pompe, une irritation cutanée peut survenir autour du bouton d’accès vasculaire implanté. Si une inflammation accompagnée de tissu dévitalisé ou nécrotique est observée, le débridement de la plaie doit être effectué en enlevant le tissu non viable (le tissu nécrotique se sépare souvent naturellement de la plaie) et la peau doit être suturée si nécessaire; Si l’inflammation et la nécrose sont étendues, le bien-être de l’animal et les paramètres sans cruauté doivent être pris en compte conformément aux lignes directrices.

L’implantation dorsale simple et double de la pompe osmotique et/ou du SVA n’a pas interféré avec le signal ultrasonore ni avec le maintien de la souris dans une position appropriée sur la scène échographique. L’acquisition automatisée de 157 images de plus de 12 mm pour rendre une image 3D de l’aorte pour la mesure de volume est une procédure simple et rapide14, qui nécessite seulement de s’assurer que l’aorte est exempte d’interférences sur la zone d’intérêt. Un piège dans ce contexte est d’appliquer trop de pression avec le transducteur tout en essayant d’effacer l’image des interférences, ce qui peut interrompre la mesure automatisée si le rythme respiratoire est affecté par la compression des côtes lorsque des images de l’extrémité crânienne de l’aorte abdominale sont enregistrées. Le diamètre est traditionnellement mesuré en images acquises en mode B par l’opérateur recherchant manuellement la zone de diamètre maximal lors de l’analyse échographique. Une avancée sur les images en mode B est les images EKV, qui peuvent résoudre de petits mouvements aortiques pour produire une image ralentie de haute qualité de l’aorte pulsée. De plus, le diamètre aortique maximal peut être déterminé à partir des images 3D acquises, où les 157 images offrent un aperçu complet de l’aorte prise à systole (grâce au déclencheur ECG défini).

En conclusion, le protocole compilé présenté fournit un flux de travail fiable et reproductible pour l’administration de médicaments par voie intraveineuse dans un modèle murin d’AAA induit par Ang-II et pour la surveillance de la taille de l’aorte par échographie 3D. Les points temporels de surveillance et de fonctionnement peuvent être ajustés aux besoins spécifiques, et le cathétérisme de la veine jugulaire peut être effectué séparément pour toute installation expérimentale nécessitant l’administration de substances spécifiques par injections intraveineuses. Le SVA peut également être utilisé pour des prélèvements sanguins répétés si une solution de verrouillage du cathéter est utilisée pour empêcher la coagulation. La procédure d’échographie 3D décrite peut être adaptée pour mesurer l’aorte infrarénale, où les anévrismes se développent lors d’une agression aiguë dans des modèles murins à base d’élastase ou de CaCl2 de AAA. Bien que l’acquisition par ultrasons 3D présente l’avantage de donner une vue d’ensemble de la région de l’aorte affectée et de la morphologie de l’anévrisme, l’acquisition d’images prend plus de temps et, par conséquent, peut être plus coûteuse. Une autre limite du protocole qui devrait être reconnue est la nécessité d’anesthésier brièvement les animaux pour les injections intraveineuses, tandis que l’administration intrapéritonéale est généralement effectuée sur des souris conscientes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Remerciements

Nous tenons à remercier les équipes du professeur Podesser et du professeur Ellmeier (département de recherche biomédicale et installation principale pour l’élevage et l’élevage d’animaux de laboratoire, Université médicale de Vienne) pour leur aide dans les expériences sur les animaux. La coloration trichrome AAA a été aimablement réalisée par Monika Weiss et le professeur Peter Petzelbauer (Département de dermatologie, Université de médecine de Vienne). Ce travail a été soutenu par le Fonds autrichien pour la science [projet SFB F 5409-B21]. Marc Bailey est personnellement soutenu par la British Heart Foundation [FS/18/12/33270].

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4-0 Sutures PolysorbCovidienGL-46-MGSuture résorbable tressée CV-23 Taper
6-0 Sutures en soieEthicon639HPERMA-HAND Silk
ALZET 2004 pompes osmotiquesDURECT Corp298Mini pompes osmotiques
Angiotensine-IIBachem4006473.0100Acétate d’angiotensine II
Aquasonic Clear Gel de transmission d’ultrasonsParker LabsPUSG-0308Gel à ultrasons
Betadona Wound SprayMundipharmaSpray désinfectant pour les plaies (spray à la povidone iodée)
Betaisodona SolutionMundipharma15973Solution désinfectante pour les plaies (solution de povidone iodée)
Cathéter pour veine/artère fémorale de sourisInstech Laboratories IncC10PU-MFV13011 à 3Fr, 10,5 cm, collier @1,2 cm. Convient à 22 G
dépilatoire
Outil de manipulationInstech Laboratories IncVABMGOutil de manipulation pour souris magnétique Boutons d’accès vasculaire HYLO
NIGHT Pommade pour les yeuxURSAPHARM538922Crème lubrifiante pour les yeux
Aiguilles et seringues de différentes taillesSeringues de 1 mL et 5 mL, aiguilles de 27 g et 30 g
Olympus SZ51 Stereo microscopeOlympus CorporationMicroscope de dissection et d’inspection
Injecteurs PinPortInstech Laboratories IncPNP3M-50Injecteur pour bouton d’accès vasculaire
Capuchon de protection en aluminiumInstech Laboratories IncVABM1CCapuchon de protection en aluminium pour souris magnétique 1 canal VAB
Signa Électrode à ultrasonsParker LabsPE-1560Électrode gel
Petit rasoir
Appareil de suralimentation et de
Suprasorb CLohmann & Rauscher20482Pansement au collagène
Bouton d’accès vasculaire (VAB)Instech Laboratories IncVABM1B/22Bouton d’accès vasculaire pour souris, magnétique, 1 canal 22 G, injecteur
Vevo 3100 Système d’imagerieFUJIFILM VisualSonics Inc51073-51Système d’échographie
Vevo Lab 5.6.1 LogicielFUJIFILM VisualSonics IncLogiciel d’analyse d’échographie
Sonde Vevo MX550DFUJIFILM VisualSonics IncSonde à réseau linéaire pour système Vevo 3100
Table de manipulation de souris VevoFUJIFILM VisualSonics Inc11436Chauffage de la souris, capture de la température centrale de la souris et coussinets ECG pour la surveillance physiologique
Crème électriquemicrochirurgie

Références

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