Method Article

Isolement et traitement d’adipocytes blancs murins pour l’analyse du transcriptome et de l’épigénome

DOI:

10.3791/64128

⸱

June 16th, 2022

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1Van Andel Institute, 2Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 3Department of General and Visceral Surgery, Medical Center-University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole résume une méthode universelle d’isolement, de purification et de traitement en amont des adipocytes blancs murins, optimisée pour le séquençage de l’ARN total en aval, l’extraction de noyaux par SONication (NEXSON) et le ChIP-seq.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’obésité est une maladie complexe influencée par la génétique, l’épigénétique, l’environnement et leurs interactions. Les adipocytes matures représentent le principal type de cellule du tissu adipeux blanc. Comprendre comment les adipocytes fonctionnent et répondent aux signaux (épi)génétiques et environnementaux est essentiel pour identifier la ou les causes de l’obésité. L’ARN et la chromatine ont déjà été isolés à partir d’adipocytes par digestion enzymatique. De plus, des protocoles ont été développés pour l’isolement nucléaire, où la purification est réalisée par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de rapporteurs transgéniques spécifiques des adipocytes. L’un des plus grands défis pour obtenir un rendement et une qualité élevés au cours de tels protocoles est la quantité substantielle de lipides contenue dans le tissu adipeux. Le présent protocole décrit une procédure optimisée d’isolement des adipocytes matures qui exploite l’heptane pour séparer les lipides des cibles d’intérêt (ARN/chromatine). L’ARN résultant a une grande intégrité et génère des résultats de séquençage d’ARN de haute qualité. De même, la procédure améliore le taux de rendement des noyaux et génère des résultats ChIP-seq reproductibles sur tous les échantillons. Par conséquent, l’étude actuelle fournit un protocole fiable et universel d’isolement des adipocytes murins adapté aux études du transcriptome et de l’épigénome du génome entier.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’obésité est généralement considérée comme une maladie due à une accumulation excessive de graisse qui contribue à un risque accru de diabète de type 2, de maladie cardiométabolique et de plusieurs formes de cancer1,2,3. Alors que la compréhension actuelle de l’obésité est fortement enracinée dans la génétique (à partir d’études sur l’homme et sur les rongeurs), environ 30 % à 70 % des prédispositions aux maladies métaboliques sont d’origine non génétique 4,5,6,7,8 et restent mal définies.

Le tissu adipeux joue un rôle essentiel dans l’obésité et d’autres maladies métaboliques 9,10. Le tissu adipeux comprend les adipocytes matures et la fraction vasculaire stromale, y compris les préadipocytes, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires. On ne sait toujours pas comment chaque type de cellule contribue à l’obésité et comment la dérégulation des adipocytes contribue à l’obésité. Des protocoles d’isolement et de purification reproductibles et efficaces pour l’étude des épigénomes adipocytaires matures présentent un intérêt pour le domaine.

Les adipocytes matures ont longtemps été isolés pour les analyses d’expression génique11 et les études épigénomiques12,13. Il existe deux stratégies principales pour isoler les adipocytes. La première consiste à utiliser la digestion enzymatique pour séparer les adipocytes matures du reste des types cellulaires de la fraction vasculaire stromale 11,14. La seconde consiste à dénoncer le tissu adipeux pour libérer des noyaux intacts, puis à récupérer les noyaux sur la base d’un rapporteur fluorescent par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)12,13, ce qui nécessite des modèles de rapporteurs transgéniques spécialisés. Le défi technique dans chaque cas est que les adipocytes matures contiennent de fortes concentrations de lipides (Figure 1), ce qui réduit la qualité et/ou le rendement de l’ARNtotal 15,16 et des noyaux17. Ici, une procédure de digestion enzymatique optimisée est décrite pour isoler les adipocytes matures, dans laquelle l’avantage de l’heptane est de dissoudre et d’éliminer rapidement et efficacement les lipides18 avant l’extraction de l’ARN ou les étapes d’isolement des noyaux par extraction de noyaux par SONication (NEXSON)19. Le protocole garantit une excellente récupération et qualité de l’ARN total pour les études à l’échelle du génome et améliore considérablement le rendement des noyaux intacts pour le ChIP-seq reproductible.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences sur des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), numéro de protocole : 18-10-028. Des souris C57BL/6J mâles âgées de 12 semaines ont été euthanasiées avec du CO2 et disséquées pour recueillir les coussinets adipeux du tissu adipeux blanc de l’épididyme (eWAT).

1. Isolement des adipocytes

  1. Préparez le tampon de digestion (tableau 1) et réchauffez-le à 37 °C au bain-marie.
  2. Mettez le coussinet adipeux du tissu adipeux blanc de l’épididyme (eWAT) dans une boîte de Pétri. Coupez le tissu en petits morceaux (5 mm x 5 mm) à l’aide d’une pince et d’un scalpel dans 5 ml de DMEM.
    REMARQUE : Une boîte de Pétri qui ne contient pas de revêtement d’adhérence cellulaire est préférée. Il est également important de tenir le coussinet adipeux doucement pour éviter d’endommager les cellules. Plus le tissu adipeux est manipulé, plus le rendement est compromis. Une méthode scalpel/pince est préférable à la coupe des coussinets de graisse avec des ciseaux ou des pinces seules car elles peuvent endommager les adipocytes.
  3. Égouttez l’excès de DMEM sans déranger les débris tissulaires.
    REMARQUE : Ne retirez pas les débris de tissu de la surface de la boîte de Pétri.
  4. Ajoutez 5 ml de tampon de digestion dans la boîte de Pétri, remuez pour libérer les fragments de tissu de la boîte et versez tout le contenu dans un tube à centrifuger de 50 ml. Répétez le processus jusqu’à ce que tous les fragments de tissu soient transférés dans le tube à centrifuger.
  5. Ajouter le tampon de digestion restant dans le tube à centrifuger de sorte que le volume final soit de ~20 ml.
  6. Incuber les fragments de tissu dans un bain-marie à 37 °C à 100 tr/min pendant 20 à 30 min, ou jusqu’à ce que les fragments de tissu soient inférieurs à 1 mm x 1 mm.
  7. Ajouter 0,4 mL d’EDTA 0,5 M et 0,2 mL d’EGTA 0,5 M dans le tube à centrifuger et continuer à agiter à 37 °C pendant 10 min.
  8. Transférez la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de 10 ml à travers un filtre à matrice fine (420 μm, voir le tableau des matériaux) au-dessus d’un autre tube à centrifuger de 50 ml pour éliminer le tissu non digéré.
  9. Centrifuger le tube de centrifugation de 50 mL à 200 x g pendant 5 min à température ambiante pour séparer les adipocytes purs (flottant sur le dessus) de la fraction vasculaire stromale (pastille en bas) (figure 2A).
  10. Versez la couche adipocytaire flottante dans un nouveau tube de 50 ml, en prenant soin de ne pas perturber la pastille.
    REMARQUE : Évitez d’utiliser les pointes de pipette pour transférer les adipocytes flottants, car elles peuvent coller à la paroi de la pointe de la pipette (réduisant ainsi le rendement). Une partie du tampon de digestion sera transférée dans le nouveau tube ; À l’aide d’une seringue et d’une aiguille, retirez le tampon de digestion résiduel sous la couche adipocytaire.
  11. Utilisez les adipocytes purifiés pour l’extraction totale de l’ARN (étape 2) et/ou le ChIP-seq (étapes 3 et 4) immédiatement.
    REMARQUE : L’utilisateur peut décider d’utiliser l’extrait adipocytaire entier pour l’étape 2. ou l’étape 3., selon l’objectif de la recherche. L’utilisateur peut également diviser l’ensemble de l’extrait adipocytaire en deux parties et passer à l’étape 2. et l’étape 3. en parallèle pour obtenir des résultats d’analyse à partir d’échantillons biologiquement identiques.

2. Extraction de l’ARN total

REMARQUE : Effectuez cette étape dans une hotte chimique.

  1. Ajouter le réactif d’isolement de l’ARN (1 mL) (voir le tableau des matériaux) aux adipocytes purifiés dans le tube à centrifuger de 50 mL (étape 1.11.).
  2. Pipeter de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL pour dissoudre complètement les adipocytes dans le réactif d’isolement de l’ARN et transférer dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.
  3. Incuber le tube pendant 15 min à température ambiante.
  4. Ajouter 0,5 mL d’heptane dans le tube à centrifuger et agiter à pleine vitesse pendant 30 s.
    REMARQUE : Les lipides se dissoudront dans l’heptane (Figure 2B).
  5. Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  6. Acquérez la couche inférieure du réactif d’isolement de l’ARN à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 30 G, puis transférez-la dans un nouveau tube de 1,5 ml.
  7. Ajouter 0,1 mL de 1bromo-3chloropropane (voir le tableau des matières) à l’extrait du réactif d’isolement de l’ARN et agiter à pleine vitesse pendant 30 s. Incuber le tube à température ambiante pendant 15 min.
  8. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette, prélevez la phase aqueuse supérieure et transférez-la dans un nouveau tube.
  9. Ajouter 0,5 mL d’isopropanol et incuber pendant 10 min à 4 °C. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE : L’ARN sera précipité sous forme de pastille au fond du tube.
  10. Utilisez une pipette pour retirer le surnageant, en prenant soin d’éviter de toucher la pastille.
  11. Ajouter 1 mL d’EtOH à 75 % et agiter brièvement à pleine vitesse.
  12. Centrifuger le tube à 7 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette. Ne dérangez pas le granulé.
  13. Faites sécher la pastille à l’air libre à température ambiante pendant 10 minutes ou jusqu’à ce qu’elle devienne claire/transparente.
  14. Dissoudre la pastille dans 50 μL d’eau sans nucléases.

3. Fixation des adipocytes pour le ChIP-seq

REMARQUE : Effectuez l’étape 3. dans une hotte chimique.

  1. Ajoutez 0,3 mL d’EDTA 0,5 mL, 0,2 mL d’EGTA 0,5 M, 14,8 mL de DMEM et 10 mL d’heptane dans le tube de 50 mL contenant des adipocytes isolés (étape 1.11.).
  2. Ajouter 0,7 mL de formaldéhyde à 16 % (0,7 % final) et faire tourner sur un rotateur de tube (voir le tableau des matériaux) à 10 tr/min pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE : Réglez une minuterie et comptez pendant 5 min. Si vous traitez plusieurs échantillons, ajoutez du formaldéhyde séquentiellement à des intervalles de 30 secondes pour permettre un moment précis et comparable de fixation sur tous les échantillons.
  3. Ajouter 1,78 mL de glycine 1,25 M (0,125 M final) et mélanger sur le rotateur à 10 tr/min pendant 5 min maximum à température ambiante.
    REMARQUE : Le formaldéhyde reste actif même après l’ajout de glycine. Par conséquent, il est important de séparer les couches par centrifugation (étape 3.4.) immédiatement après l’étape d’incubation de 5 minutes. S’il y a plus d’un échantillon, ajoutez de la glycine à chaque échantillon pour arrêter la réaction séquentiellement dans des intervalles de temps de 30 s.
  4. Ensuite, centrifugez à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE : Il doit y avoir trois couches de liquide évidentes et discrètes (Figure 2C). La couche blanche intermédiaire contient les adipocytes fixes.
  5. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml, transférez la couche adipocytaire (blanche) dans un tube à centrifuger frais de 15 ml, en minimisant la quantité de fixateur et d’heptane transportée dans le nouveau tube.
  6. Remplissez le tube avec 10 ml (température ambiante) de DMEM complété par le cocktail d’inhibiteurs de protéase (PIC, voir le tableau des matériaux) comprimé. Bien mélanger par inversion.
  7. Centrifugez le tube à ≤200 x g pendant 5 min à température ambiante. Maintenez la force de centrifugation à 100 x g pour minimiser l’éclatement des cellules.
  8. Répétez les étapes 3.5 à 3.7. 1x avant de passer à l’étape 3.9.
  9. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml, transférez la couche adipocytaire (blanche) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml ou 2 ml.
  10. Centrifugez le tube à 100-200 x g pendant 5 min à température ambiante et utilisez une pointe de pipette de 1 ml pour retirer l’heptane (couche supérieure) et le DMEM (couche inférieure).
  11. Conservez les adipocytes fixes à -80 °C jusqu’à 6 mois jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.

4. Extraction des noyaux et cisaillement de la chromatine

REMARQUE : Cette procédure est adaptée d’Arrigoni et al.19.

  1. Allumez le sonicateur (voir le tableau des matériaux) et réglez la puissance de crête sur 75 W, le facteur de service sur 2 % et 200 cycles/rafale, avec le refroidisseur à bain-marie réglé sur 20 °C.
  2. Ajouter un cocktail d’inhibiteurs de protéase (PIC) au tampon de laboratoire Farnham et au tampon de cisaillement (tableau 1).
    REMARQUE : Veuillez consulter quelques autres sonicateurs et paramètres suggérés dans Arrigoni et al.19.
  3. Remettre en suspension les adipocytes fixés (à partir de l’étape 3) avec 750-800 μL de tampon de laboratoire Farnham glacé dans un tube de sonication de 1 mL (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Il est recommandé de ne pas remplir le tube à sa pleine capacité. Sinon, les adipocytes flotteront vers la partie supérieure du tube, ce qui réduit l’efficacité de la sonication.
  4. Sonicez l’échantillon pendant 2,5 min.
    REMARQUE : Vérifiez l’extraction des noyaux sur un microscope à contraste de phase pour déterminer si une sonication supplémentaire est nécessaire. Les noyaux doivent être ronds et intacts, comme le montre la figure 2D.
  5. Avant de poursuivre, réglez la puissance de crête du sonicateur sur 140 W, le facteur de fonctionnement sur 5 % et 200 cycles/rafale, avec le refroidisseur à bain d’eau réglé sur 4 °C.
  6. À l’aide d’une pipette, transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
  7. Retirez soigneusement le surnageant de la pastille (noyaux) et conservez la pastille.
  8. Lavez la pastille avec 1 mL de tampon de laboratoire Farnham sur de la glace.
  9. Centrifugez le tube à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C, utilisez une pipette pour retirer le surnageant et conservez la pastille.
  10. Répétez les étapes 4.8.-4.9. 1x avant de passer à l’étape 4.11.
    REMARQUE : Les noyaux isolés et lavés peuvent être conservés à −80 °C pendant 3 mois jusqu’à une nouvelle utilisation.
  11. Remettez en suspension les noyaux isolés dans 1 mL de tampon de cisaillement et transférez-les dans un nouveau tube de sonication de 1 mL. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le tube.
  12. Sonicer les noyaux dans le sonicateur avec une puissance de crête de 140 W, un facteur de service de 5 % et 200 cycles/rafale pendant 12 min pour cisailler la chromatine à 4 °C.
  13. Transférez le lysat dans un tube de microfuge de 1,5 ml.
    REMARQUE : La chromatine cisaillée est libérée des noyaux et est contenue dans le tampon (lysat).
  14. Centrifugez le tube à 10 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les débris insolubles. Transférez le surnageant (chromatine) dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
  15. La chromatine cisaillée peut être stockée à 4 °C pendant 10 jours ou à -80 °C pendant 3 mois jusqu’à une nouvelle utilisation.
    REMARQUE : Contrôle de qualité supplémentaire : Aliquote 25 μL de la chromatine cisaillée pour déséticuler et éliminer l’ARN avec une RNase sans DNase conformément au rapportprécédemment publié 19. Pour la présente étude, l’ADN résultant a été purifié à l’aide d’un kit de purification de l’ADN conformément aux instructions du fabricant, l’ADN a été quantifié à l’aide d’un kit de quantification de l’ADN sur l’instrument de quantification de l’ADN et la taille du fragment a été évaluée par l’instrument d’électrophorèse automatisé (voir le tableau des matériaux). La taille de la chromatine cisaillée doit être comprise entre 100 et 800 pb. Le reste de la chromatine de cisaillement peut être utilisé pour l’application en aval de ChIP-Seq.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les adipocytes ont été isolés à partir de six coussinets adipeux, l’extraction de l’ARN à base d’heptane a été effectuée (étape 2) et l’ARN résultant a été analysé sur l’instrument d’électrophorèse automatisé. L’indice d’intégrité de l’ARN (RIN) calculé pour tous les échantillons était de >8 (figure 3A), ce qui indique une préparation d’ARN de haute qualité et reproductible. Le kit de préparation de l’ARN total a ensuite été utilisé pour préparer des banques d’ARN, et chaque échantillon a été séquencé sur le séquenceur de nouvelle génération pour atteindre une profondeur de lecture de ≥40 millions de lectures. Le score Phred pour tous les échantillons (figure 3B) et par séquence (figure 3C) était de ≥30, ce qui indique des séquences d’ADN de haute qualité20. Ainsi, l’élimination de l’heptane favorise l’isolement d’ARN à haut rendement et de haute qualité adaptés au séquençage de l’ARN.

Dans l’étape de fixation au formaldéhyde, trois préparations d’isolement nucléaire contenant de l’heptane et une préparation de contrôle sans heptane ont également été réalisées. La chromatine cisaillée a ensuite été analysée sur l’instrument d’électrophorèse automatisé. Dans les deux cas, la chromatine a été cisaillée à une plage de taille de 100 à 800 pb (Figure 4A), idéale pour les procédures de ChIP-seq en aval19. Il est important de noter que ~5 fois plus de chromatine a été obtenue à partir des échantillons traités à l’heptane (11,5 ng/μL, 9,42 ng/μL et 9,6 ng/μL) par rapport aux échantillons non traités (2,2 ng/μL). H3K4me3 et H3K27me3 ChIP-seq ont été réalisés d’après Arrigoni et al.19. Comme le montre la figure 4B, les traces de signal de trois échantillons indépendants traités à l’heptane étaient comparables à la trace de l’échantillon non traité à l’heptane pour les deux marques d’histones. Le traitement à l’heptane n’interfère pas avec la qualité du ChIP-seq mais améliore significativement le rendement des noyaux (et de la chromatine cisaillée).

figure-results-1
Figure 1 : Adipocytes isolés. Des adipocytes isolés ont été colorés avec du DAPI (bleu) pour colorer le noyau et du BODIPY (vert) pour les lipides. Les gouttelettes lipidiques cytosoliques représentent jusqu’à 95 % du volume des adipocytes et posent un défi technique pour obtenir des rendements élevés lors des extractions d’ARN et de chromatine. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Flux schématique de l’isolement des adipocytes pour l’analyse du transcriptome et de l’épigénome. L’ensemble du flux de travail est décrit, de l’isolement des adipocytes à l’application du transcriptome ou de l’épigénome. Les étapes clés et les résultats représentatifs sont présentés. (A) Les adipocytes isolés flottent sur la couche supérieure, se séparant de la fraction vasculaire stromale sous forme de pastille au fond du tube. (B) L’utilisation de l’heptane pour éliminer les lipides avant l’extraction de l’ARN avec un réactif d’isolement de l’ARN. (C) L’utilisation de l’heptane pour éliminer les lipides lors de la fixation des adipocytes. (D) L’image représentative des noyaux adipocytaires isolés doit être intacte et ronde. Barre d’échelle = 20 μm. Le système a été créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Électrophérogramme représentatif de l’intégrité de l’ARN et des scores de qualité après le séquençage de l’ARN. (A) Les échantillons 1 à 6 représentent six répétitions d’adipocytes traités à l’heptane, et leur analyse de l’intégrité de l’ARN a été effectuée sur l’instrument d’électrophorèse automatisé. L’indice d’intégrité de l’ARN (RIN) est basé sur les rapports d’ARN ribosomique 18S et 28S et représente la qualité de l’ARN. Échelle de 1 (très dégradé) à 10 (le moins dégradé). (B, C) Le score de qualité de lecture du séquençage a été déterminé par l’analyse multiQC (B) pour le score de qualité moyen sur les bases (C) et pour le score de qualité par séquence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Électrophérogramme représentatif de la chromatine cisaillée et des pics d’enrichissement du ChIP-seq. (A) Profils représentatifs de l’instrument d’électrophorèse automatisé montrant les distributions granulométriques de la chromatine du témoin (échantillon 1, en haut à gauche) et des préparations de chromatine adipocytaire traitées à l’heptane (échantillons 2, 5 et 8, en haut à droite et en bas deux en bas). Les concentrations de chromatine dans les préparations finales sont indiquées en haut à gauche de chaque image. (B) Capture d’écran du navigateur Genome réalisée à l’aide de l’Integrative Genomics Viewer (IGV). La partie supérieure du graphique montre les profils H3K4me3 ChIP-seq pour trois échantillons traités à l’heptane (rouge) et un témoin (bleu). Le panneau inférieur montre la même chose pour le ChIP-seq de H3K27me3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

TamponComposition
Tampon de digestion (pour 3000 mg ou moins de tampon adipeux/20 ml)20 ml de Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
0,3 g de BSA sans acides gras
0,1 g de collagénase de type 2
Tampon de laboratoire de FarnhamTUYAUX DE 5 mM (pH 8)
85 mM KCl
0,5 % IGEPAL
Tampon de cisaillement10 mM de Tris-HCl pH 8
0,1 % SDS
1 mM d’EDTA

Tableau 1 : Composition des différents tampons utilisés dans la présente étude.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole d’isolement des adipocytes présenté ici est basé sur des méthodes de digestion enzymatique bien acceptées11,14 pour séparer les adipocytes matures (flottants) de la fraction vasculaire stromale restante du tissu adipeux blanc. Il fournit une approche simple et universelle pour purifier les adipocytes matures dans n’importe quel modèle de souris. Comme démontré ci-dessus, le protocole est adapté à une utilisation en aval pour les analyses du transcriptome entier et du ChIP-seq. Il fournit un rendement suffisant pour générer plusieurs profils épigénomiques (par exemple, plusieurs modifications d’histones plus le séquençage de l’ARN) à partir du même coussinet adipeux individuel.

Pour garantir les rendements élevés qui permettent la préparation de telles données épigénomiques appariées, une étape critique consiste à utiliser l’heptane pour dissoudre les lipides des adipocytes intacts et des adipocytes qui lysent au cours du processus. D’après notre expérience, cette étape augmente considérablement la reproductibilité et le rendement en empêchant la perte d’ARN et de noyaux dans la couche lipidique. La rotation continue des tubes contenant les adipocytes en cours de fixation est tout aussi importante car elle améliore l’homogénéité avec laquelle les lipides sont éliminés des adipocytes. Au lieu du tampon fixateur de formaldéhyde à 1 % signalé dans une grande partie de la littérature ChIP-seq21,22, il a été constaté qu’il était nécessaire de réduire la concentration à 0,7 % de formaldéhyde pour éviter une fixation excessive. Le temps de cisaillement de la chromatine a également été optimisé à 12 min pour obtenir une plage de taille de chromatine optimale (100-800 pb) pour le ChIP-seq.

Le protocole a été optimisé pour les études de transcriptome et d’épigénome. Le protocole actuel a encore ses propres limites pour les applications du transcriptome et de l’épigénome sur cellule unique. Compte tenu de l’hétérogénéité cellulaire rapportée dans le champ d’adiposité23,24, cette méthode d’isolement pourrait être développée pour être adaptée aux tests sur cellule unique. Dans de tels contextes, des marqueurs restreints aux adipocytes tels que le bore-dipyrrométhène (BODIPY)25 et la périlipine-1 (PLIN1)26, l’ASC-127, ou des marqueurs de noyaux spécifiques aux adipocytes pourraient être précieux pour permettre la quantification de paramètres cellulaires supplémentaires, fonctionnels et pertinents28. Outre l’application aux études génomiques, ce protocole pourrait également améliorer les études protéomiques des adipocytes, qui présentent un obstacle supplémentaire en raison de la teneur élevée en lipides des adipocytes29.

Ce protocole peut également être utilisé pour extraire avec succès des noyaux adipocytaires humains (données non présentées), étendant ainsi son application à la recherche sur l’obésité humaine.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes redevables à l’imagerie optique, au séquençage, au noyau bioinformatique et au personnel du MPI-IE. Ce travail a été soutenu par le financement du MPG, de l’Institut de recherche Van Andel, de la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne, des NIH (R01HG012444 et R21HG011964), de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 675610 et du ministère fédéral de l’Éducation et de la Recherche dans le cadre du projet numéro 01KU1216 (Deutsches Epigenom Programm, DEEP).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solution de formaldéhyde à 16 % (p/v). Sans méthanolThermoFisher SCIENTIFIC28908
1-bromo-3-chloropropane  ;SIGMAB9673
5 M NaClinvitrogenAM9759
Instrument d’électrophorèse automatisé (2100 Bioanalyzer Instrument)Agilent TechnologiesG2939BA
BODIPY  ;ThermoFisher SCIENTIFICD3922
Collagénase de type 2Worthington Biochemical Corp.43D14184B
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase (PIC), sans EDTA  ;Roche4693159001sans
EDTA DAPI  ;ThermoFisher SCIENTIFICD1306
DMEM (+ GlutaMAX)  ;life technologies61965-026
Kit de purification d’ADN (kit de purification PCR)Qiagen28104
Instrument de quantification de l’ADN (fluorimètre Qubit 4)Fisher SCIENTIFICQ33238
Kit de quantification de l’ADN (test ADN haute sensibilité)Agilent Technologies5067-4626
EDTAFisher chimiqueE478-500
EGTAFisher chimiqueO2783-100
EtOHPHARMCO111000200
Sans acides gras BSA  ;SERVA11932.01albumine bovine fraction V, lyophilisée sans acides gras
GlycineSIGMAG7126-100G
HeptaneSIGMAH2198-1L
Analyse d’ARN haute sensibilitéAgilent Technologies5067-1513
IgepalSIGMA18896-50ML
KClSIGMAP3911-25G
Filtre matriciel (420um)Tisch ScientificME17238
de nouvelle génération (Séquenceur HiSeq 3000)  ;Eau
  ;Invitrogen4387936
PIPESACROS organics5625-37-6
Protéinase K  ;ThermoFisher SCIENTIFICEO0491
Réactif d’isolement de l’ARN (Trizol)ThermoFisherSCIENTIFIC15596026
RNase A, sans DNase  ;Rotateur ThermoFisher SCIENTIFICEN0531
(Thermo Scientific Tube Revolver Rotator)ThermoFisher SCIENTIFIC88881001
SDS, Sodium dodecyl sulfateSIGMA8170341000
Sonication (1 mL milliTUBE avec fibre AFA)Covaris520135
Sonicator (Evolution Focused-ultra-sonicator (S220 ou E220))Covaris500217 ou 500239
Kit de préparation de l’ARN total ( Kit de préparation de l’ARN total brin Illumina)Illumina20040525
Tris-HCl  ;Bioréactifs FisherBP153-500
Séquenceur sans nucléases Illumina

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