Technique d’injection d’embryons pour l’édition de gènes chez la tique à pattes noires, Ixodes scapularis

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode d’injection d’embryons de tiques. L’injection d’embryons est la technique préférée de manipulation génétique pour générer des lignées transgéniques.

Résumé

Les tiques peuvent transmettre divers agents pathogènes viraux, bactériens et protozoaires et sont donc considérées comme des vecteurs d’importance médicale et vétérinaire. Malgré le fardeau croissant des maladies transmises par les tiques, la recherche sur les tiques a pris du retard par rapport aux insectes vecteurs de maladies en raison des défis liés à l’application des outils de transformation génétique pour les études fonctionnelles à la biologie unique des tiques. Les interventions génétiques ont attiré l’attention pour réduire les maladies transmises par les moustiques. Cependant, le développement de telles interventions nécessite une transformation germinale stable par injection d’embryons. Une telle technique d’injection d’embryons fait défaut pour les chélicérates, y compris les tiques. Plusieurs facteurs, tels qu’une épaisse couche de cire externe sur les embryons de tiques, un chorion dur et une pression intra-ovale élevée, sont des obstacles qui empêchaient auparavant le développement du protocole d’injection d’embryons chez les tiques. Le présent travail a surmonté ces obstacles, et une technique d’injection d’embryons pour la tique à pattes noires, Ixodes scapularis, est décrite ici. Cette technique peut être utilisée pour fournir des composants, tels que CRISPR / Cas9, pour des transformations germinales stables.

Introduction

Les tiques sont des vecteurs d’importance médicale et vétérinaire, capables de transmettre une variété d’agents pathogènes viraux, bactériens, protozoaires et nématodes ^1,2. Dans l’est des États-Unis, la tique à pattes noires, Ixodes scapularis, est un vecteur important de l’agent pathogène de la maladie de Lyme (ML), le spirochète Borrelia burgdorferi. Plus de 400 000 cas de ML sont signalés chaque année aux États-Unis, ce qui en fait la principale maladie infectieuse à transmission vectorielle aux États-Unis¹. En plus de B. burgdorferi, six autres microorganismes sont transmis par I. scapularis, dont quatre bactéries (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi et Ehrlichia muris eauclarensis), un parasite protozoaire (Babesia microti) et un virus (virus Powassan), faisant de cette espèce de tique un problème majeur de santé publique³ . Alors que les maladies transmises par les tiques sont devenues plus répandues ces dernières années, la recherche sur les tiques a pris du retard par rapport à d’autres arthropodes vecteurs, tels que les moustiques, en raison de la biologie unique des tiques et des défis associés à l’application d’outils génétiques et génomiques fonctionnels ^4,5.

Les techniques d’édition de gènes, en particulier CRISPR / Cas9, ont maintenant rendu les études de génomique fonctionnelle réalisables dans des organismes non modèles. Pour créer des mutations héréditaires dans un organisme, l’injection d’embryons reste la méthode préférée pour délivrer des constructions permettant de modifier la lignée germinale 6,7,8,9. Cependant, jusqu’à récemment⁴, les œufs de tiques étaient considérés comme trop difficiles ou même impossibles à injecter sans tuer l’embryon^10,11. Une épaisse couche de cire sur les œufs, un chorion dur et une pression intra-ovale élevée étaient quelques-uns des principaux obstacles qui empêchaient l’injection d’embryons chez les tiques. I. scapularis adulte nourri au sang dépose une seule couvée de jusqu’à 2 000 œufs¹² sur 3-4 semaines (environ 100 œufs / jour). Les œufs sont pondus individuellement, et chaque œuf est enrobé de cire sécrétée par les protubérances ou « cornes » de l’organe glandulaire de Gené^{13,14,15 de} la mère. Cette cire protège les œufs de la dessiccation et contient des composés antimicrobiens¹⁵. Pour injecter avec succès des œufs de tiques, il est important d’enlever la couche de cire, de ramollir le chorion et de dessécher les œufs pour diminuer la pression intraovale afin que l’injection n’endommage pas irréversiblement l’œuf. Comprenant l’importance cruciale des injections d’embryons pour la transformation réussie de la lignée germinale, un protocole pour I. scapularis est développé, qui peut être utilisé pour délivrer une construction CRISPR / Cas9 et générer des mutations germinales stables⁴. En plus de sa contribution à la recherche sur I. scapularis, ce protocole pourrait également être optimisé pour d’autres espèces de tiques.

Protocole

Les adultes d’Ixodes scapularis ont été achetés à l’Université d’État de l’Oklahoma (OSU) ou élevés à l’Université du Nevada, Reno (UNR) (protocole IACUC #21-001-1118).

1. Préparation des tiques femelles pour la collecte d’embryons

REMARQUE: Pour collecter des œufs d’âge approprié, il est important de synchroniser la ponte. Bien que les indices de ponte chez les tiques restent incertains, dans les conditions insectaires standard (température de 27 °C et humidité relative (HR) de >90 %), les femelles d’I. scapularis commencent à pondre environ 8 jours après le détachement de l’hôte. Cette période peut être allongée en stockant les femelles remplies à 4 °C. Nous avons stocké des femelles nourries de sang entre 4 °C et 8 semaines sans aucun effet négatif sur la ponte. Ces conditions peuvent devoir être modifiées pour chaque insecte.

1. Conservez toutes les femelles remplies à 4 °C avec >90 % HR dans une boîte en plastique de 6 litres tapissée de papier filtre humide jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour les micro-injections.
2. Une semaine avant les injections, transférer les femelles de 4 °C vers un incubateur à 27 °C pour l’initiation de la ponte.
3. Lorsque les femelles commencent à pondre (3-4 jours après les avoir déplacés à 27 °C), retirez les œufs à l’aide d’un pinceau à pointe fine et préparez les femelles à l’ablation de l’organe (glande de cire) de Gené.
   NOTE: L’organe du Gené s’étend de la zone située entre le scutum et le capitule (base dorsale des pièces buccales), les pièces buccales se plient sur la surface du corps ventral (parallèle à la surface) et l’organe étendu de Gene recouvre les œufs dès que les œufs sont pondus (Figure 1). Les œufs pondus avant le prélèvement d’organes de la Gené ou la vidange de la cire auront un enrobage de cire et ne conviennent pas aux injections et doivent être jetés.
4. Pour enlever ou vider l’organe du Gené, utiliser de l’argile pour positionner la femelle engorgée sur une lame de verre sous un microscope orienté de manière à ce que les pièces buccales soient visibles sur les côtés ventral et dorsal (Figure 1B,C).
   1. Piquez soigneusement la zone exactement entre le scutum et les pièces buccales à l’aide de pinces fines et d’aiguilles en tungstène fabriquées en laboratoire à l’aide de fil de tungstène en suivant un protocole¹⁶ publié précédemment (les aiguilles peuvent également être achetées dans le commerce et attachées à une microsonde de dissection, voir le tableau des matériaux).
   2. En travaillant à l’intérieur avec l’aiguille en tungstène, retirez la glande de cire (Figure 1D,E). L’ablation de la glande peut prendre plusieurs minutes. Essuyez toute sécrétion de cire liquide à l’aide de lingettes de laboratoire.
      REMARQUE: La glande peut également être retirée de la face ventrale juste en dessous des pièces buccales; en tendant la main dans le dos vers le scutum avec une aiguille et une pince. L’application de colle de silicium autour des pièces buccales bloque également l’éversion des organes de Gene et peut être utilisée au lieu d’enlever ou de vider la cire (communication personnelle avec le Dr Ladislav Simo, INRAE, France). Les tiques engorgées ne resteront pas sur du ruban adhésif double face. L’utilisation d’argile pour « emmailloter » la tique aide à les maintenir en place pendant la manipulation. Utilisez une pince pour tenir la tique et l’aiguille en tungstène pour la dissection. La partie ventrale est plus facile à percer avec une aiguille et préférée par les auteurs.
5. Pour vider la glande, disposez la tique gravide comme mentionné à l’étape 1.4. Percez soigneusement la zone située derrière les pièces buccales du côté dorsal et appliquez une pression sur la face ventrale à l’aide d’une pince.
   REMARQUE: Alternativement, il n’est pas nécessaire d’enlever la glande de cire; Vider la glande de cire durera plusieurs jours. Les femelles pondeuses ont une zone blanche autour des pièces buccales qui indique l’emplacement de la glande de cire et peut être utilisée comme référence.
   1. Placez le bord d’une lingette de laboratoire non pelucheuse et retirez la cire liquide sortant du site de ponction. Assurez-vous d’éviter la sécrétion d’hémolymphe, qui est un liquide clair par rapport à la cire visqueuse légèrement jaunâtre. Cela peut prendre 5-10 minutes jusqu’à ce que la majeure partie de la cire soit enlevée.
6. Après manipulation, placez les femelles dans un incubateur à 27 °C (>90% HR) et laissez-les récupérer pendant 1-2 jours.
   REMARQUE : Les femelles traitées mettent habituellement 1 à 2 jours à se rétablir et à recommencer à pondre.
7. Lorsque les femelles recommencent à pondre, utilisez un pinceau fin pour recueillir les œufs fraîchement déposés (0 à 18 h après la ponte) et placez-les dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
   REMARQUE: Si vous utilisez des œufs de la même femelle au fil du temps, cette procédure doit être répétée après 4-5 jours de ponte si les glandes n’ont pas été enlevées.

2. Traitement embryonnaire pour micro-injections

1. Ajouter ~200 μL (ou un volume suffisant pour couvrir les œufs, selon le nombre d’œufs) de chlorure de benzalkonium/eau à 5 % (poids/volume) (voir le tableau des matières) dans le tube contenant des œufs âgés de 0 à 18 h. Remuez doucement les œufs avec le pinceau pendant 5 minutes pour éviter qu’ils ne se déposent au fond du tube (pour plus de détails, voir Sharma et ^al.4). Retirer le surnageant à l’aide d’une micropipette en laissant les œufs dans un tube.
   ATTENTION : Le chlorure de benzalkonium est corrosif pour la peau et les yeux, portez des gants et une protection oculaire.
2. Ajouter ~200 μL d’eau distillée (DI) dans le tube contenant les œufs, agiter avec un pinceau et retirer l’eau du tube de microcentrifugeuse à l’aide d’une micropipette. Répétez le lavage avec de l’eau DI une fois de plus.
3. Après le lavage à l’eau DI, ajouter ~200 μL de chlorure de sodium (NaCl) à 5% (p/v) et agiter doucement avec un pinceau pendant 5 min. Retirer la solution du tube après 5 min et laver les œufs deux fois avec de l’eau DI.
4. Ajouter ~100 μL de solution de NaCl à 1 % (p/v) dans le tube de microcentrifugation contenant des œufs. Conserver les œufs dans une solution de NaCl à 1 % (p/v) jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour des préparations injectables.
5. Commencez les micro-injections après environ une heure. Cette chronologie aide à la dessiccation correcte des œufs et les empêche d’éclater.
   NOTE: Les œufs peuvent être conservés dans une solution de NaCl à 1% (p / v) pendant 7-8 heures sans affecter significativement la survie. Si les œufs sont difficiles à injecter ou à éclater, ils ne sont pas suffisamment desséchés et peuvent être traités avec 5% (p/v) de NaCl pendant 5 minutes supplémentaires.

3. Préparation des aiguilles d’injection

1. Insérez un verre capillaire aluminosilicate (avec filament, voir le tableau des matériaux) dans l’extracteur d’aiguille en suivant les instructions du fabricant.
2. Ajustez l’extracteur d’aiguille aux réglages suivants : Chaleur : 575, Traction : 20, Vitesse : 50, Temps : 200 et Pression : 700.
3. Activez la fonction de traction de l’extracteur d’aiguilles et répétez le processus pour des aiguilles supplémentaires.
4. Conservez les aiguilles tirées en les collant dans des lignes d’argile de modeleur dans une boîte de Petri propre.
5. Chargez l’aiguille avec le mélange d’injection à l’aide d’une pointe de microchargeur (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : La figure 2 présente la comparaison des aiguilles utilisées pour l’injection d’embryons de tiques et de moustiques.

4. Configuration des diapositives pour les micro-injections

1. À l’aide de ruban adhésif double face, collez deux lames de microscope en verre ensemble, en laissant un espace d’environ 0,5 cm pour soutenir l’alignement des œufs et les empêcher de se retourner pendant les injections (figure 3A).
2. Appliquez un morceau de pansement transparent (voir Tableau des matériaux) sur le ruban adhésif double face dans l’espace entre les lames. Assurez-vous d’aligner parfaitement le pansement du film avec l’espace.

5. Microinjections d’embryons

1. Alignez 8 à 10 œufs à la fois sur la configuration de la diapositive (ci-dessus) à l’aide d’un pinceau à poil unique.
   REMARQUE : Les œufs alignés avec l’axe le plus long perpendiculaire (figure 3B) au bord de la lame sont plus faciles à injecter que les œufs dont l’axe longitudinal est aligné parallèlement au bord (figure 3C). Les œufs dans l’orientation perpendiculaire (figure 3B) peuvent mieux résister à l’injection, ce qui entraîne une survie plus élevée.
2. Placez la lame avec les œufs alignés sur la scène d’un microscope composé. Utilisez un morceau de lingette non pelucheuse pour retirer la solution de NaCl à 1% dans laquelle ils sont stockés.
3. Fixez l’aiguille d’injection remplie à un micro-injecteur relié à un micromanipulateur (voir le tableau des matériaux).
4. Ouvrez l’aiguille en la frottant doucement contre la surface de l’œuf à l’aide d’un réglage à haute pression sur le micro-injecteur (>5 000 hPa).
5. Une fois l’aiguille ouverte, réduisez la pression (1 000 à 2 500 hPa) du micro-injecteur en fonction de l’ouverture de l’aiguille.
   REMARQUE: Une petite ouverture nécessitera une pression comparativement plus élevée, tandis qu’une ouverture plus grande nécessitera une pression plus faible. Il s’agit de contrôler le volume de la construction injectée. Selon la taille de l’ouverture de l’aiguille, le volume d’injection variera de 1 à 5 pL.
6. Injectez tous les œufs sur la lame à un angle de 10°-15° le plus rapidement possible et déplacez immédiatement la lame dans des conditions d’humidité élevée dans une boîte de Petri tapissée de papier humide. Dès que les œufs sont injectés, ils commencent à se dessécher.
   REMARQUE: L’injection d’un petit nombre d’ovules à la fois augmente le succès de l’injection et la probabilité de survie. Les aiguilles sont obstruées par le reflux embryonnaire. Si la pointe est encore tranchante, pour dégager les aiguilles obstruées, déplacez l’aiguille dans une petite gouttelette de NaCl à 1% ajoutée au bord de la lame. L’action capillaire va déloger le petit sabot. Si l’aiguille est déjà émoussée, changez-la.

6. Soins post-injection des embryons

1. Placez la lame contenant les embryons injectés dans une grande boîte de Petri tapissée de papier filtre humide.
   REMARQUE: Il est essentiel de ne pas déranger les œufs pendant au moins 5-6 heures. Cela permet à la plaie d’injection de sceller correctement. La plaie d’injection peut s’ouvrir lorsqu’elle est agitée et le cytoplasme peut commencer à suinter, entraînant la mortalité des œufs.
2. Après 5-6 h, ajouter une petite goutte d’eau DI au pansement transparent avec les embryons injectés attachés. À l’aide d’un pinceau, déplacez doucement les œufs. Transférer les œufs dans une petite boîte de Petri (10 cm) et les plonger dans de l’eau DI.
   REMARQUE: Le pansement pelliculé permet de retirer facilement les ovules après les injections. Dès qu’une goutte d’eau est ajoutée au pansement du film, les œufs commencent à se déplacer avec l’eau.
3. Gardez les œufs immergés dans l’eau et placez la boîte de Petri dans une boîte en plastique de 6 litres dans un incubateur à 27 °C et >90% HR.
4. Vérifiez les œufs régulièrement, quotidiennement pendant les premiers jours, puis tous les 3-4 jours jusqu’à ce que les larves commencent à éclore.
   REMARQUE: Si un grand nombre d’œufs sont endommagés pendant les micro-injections, le drainage délicat de l’eau DI après une semaine empêchera la croissance fongique sur les œufs morts.
5. Lorsque les larves commencent à éclore des embryons injectés (21 à 25 jours après l’injection pour la configuration de laboratoire actuelle), vérifiez-les quotidiennement et transférez toutes les larves écloses dans des flacons en verre avec un écran sur le dessus. Les larves peuvent éclore sous l’eau et survivre pendant ~1-2 semaines.
6. Cribler les larves⁴ si les œufs ont été injectés avec une construction qui peut entraîner un phénotype visible.

Résultats

Un protocole d’injection embryonnaire efficace pour I. scapularis est décrit dans cet article. Les femelles pondeuses ont été maintenues à une humidité élevée pour éviter la dessiccation des œufs partiellement cirés. La couche de cire a été retirée pour injecter des embryons de tiques en ablant l’organe du gène (glande de cire) de la femelle gravide (Figure 1A-E). Nous avons utilisé des aiguilles en verre aluminosilicate avec un col plus court (

Discussion

Il s’agit du premier protocole développé pour injecter avec succès des embryons précoces de tiques. Un taux de survie de ~4%-8% a été atteint, ce qui est comparable à l’injection d’embryons dans d’autres modèles d’insectes bien établis⁵.

Comme il s’agit du protocole initial, on s’attend à ce que ce protocole soit affiné et spécialisé pour chaque espèce de tique. En particulier, le moment de l’injection variera d’une espèce à l’autre, en fonction de l’embryogenèse, en pa...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Capillaires en silicate d’aluminium, avec filament	Instruments Sutter	AF100-64-10	Injection d’embryons
Chlorure de benzalkonium 50 % dans l’eau, 25 g	TCI-America	B0414	Traitement d’embryons, 25 g correspondent à environ 25 mL
Papier filtre	Whatman	1001-090	Soins post-injection
Pince	Thomas Scientific	300-101	Organe du gène manipulation
Lingettes de laboratoire	Genesee Scientific	88-115
Embouts de microchargeur	Eppendorf	930001007	Chargement des aiguilles tirées
Micromanipulateur	Instruments de Sutter	ROE-200	Injection d’embryons
Lames microscopiques - lisses, bords rectifiés	Genesee Scientific	29-100	Alignement de l’embryon, les bords rectifiés sont préférés, les bords biseautés pourraient Cacher les œufs à la vue
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Traitement
l’embryon Extracteur d’aiguille	Sutter Instruments	P-1000
Permanent Ruban adhésif double face	Scotch	34-8716-3417-5	Alignement de l’embryon
Plaques de Pétri	Genesee Scientific	32-107G	Soin post-injection
Tegaderm/ Transparent pansement filmique	3M Healthcare	1628	Alignement
d’embryons Aiguilles en tungstène	Outils de science fine	10130-10	Manipulation d’organes de gènes
Fil de tungstène	Amazon	B08DNT7ZK3	Manipulation d’organes
de gènes Micro-injecteur numérique XenoWorks Instruments	mesure	MPC-200	Injection d’embryons