REMARQUE : Toutes les expériences décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité de recherche et de soin des animaux de l’Université de Buenos Aires (CICUAL), conformément au Comité du Conseil national de recherches (États-Unis) pour la mise à jour du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire13. Pour les expériences, utilisez des souris mâles C57BL/6J et Gal-3 KO du même âge (âgées de 8 à 10 semaines) pesant de 30 à 35 g, ce qui permet une meilleure manipulation pour la chirurgie. Permettez aux animaux d’avoir accès à de l’eau et à de la nourriture ad libitum. Les souris Gal-3 KO ont été élevées sur un fond C57BL/6J dans les mêmes installations de bioressources que les souris témoins C57BL/6J.
1. Zone chirurgicale et instruments
- Avant de commencer l’opération, vérifiez que le ventilateur est branché sur une source d’alimentation et qu’il fonctionne correctement. Confirmez qu’il y a suffisamment de solution anesthésique. Préparez la solution le jour de l’intervention en calculant le nombre d’animaux à utiliser.
- Vérifiez que tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés, y compris les ciseaux en acier inoxydable, les micro-ciseaux, les porte-aiguilles pour grandes et petites aiguilles, les écarteurs, les pinces extra tranchantes et incurvées, les pinces dentelées et les pinces à tissus. Nettoyez la zone de travail avec de l’éthanol à 70 %.
- Assurez-vous de la disponibilité de petites boules de coton, d’hysope et de gaze pour une cautérisation immédiate de toute hémorragie potentielle.
- Des sutures en soie tressée enduites de silicone, enduites de silicone, prêtes à l’emploi, pour la ligature de l’artère coronaire descendante gauche (LDA), des sutures en nylon pour la fermeture du thorax et du fil de lin pour fermer la peau.
2. Anesthésie et intubation
- Pesez les souris pour déterminer la dose d’anesthésie.
- Préchauffez un coussin chauffant entouré d’une base en polystyrène à 40 °C.
- Anesthésier les souris par l’administration intramusculaire de 0,1 mL/10 g de poids corporel d’une solution contenant de la kétamine (65 mg/kg), de la xylazine (13 mg/kg) et de l’acépromazine (1,5 mg/kg).
- Une fois la souris anesthésiée et avant de commencer l’intervention chirurgicale, vérifiez la profondeur de l’anesthésie en induisant un stimulus légèrement douloureux, par exemple en appuyant sur les pieds avec les doigts. Si l’animal répond au stimulus, ajustez la profondeur de l’anesthésique.
- Placez la souris dans un décubitus dorsal et collez ses pattes à la base de travail au-dessus du coussin chauffant, en la plaçant sous un stéréomicroscope binoculaire. Hyper-étendez le cou avec un fil retenant les dents maxillaires attachées à la base de travail.
- Ensuite, pour la partie intubation, exposez les anneaux de trachée à travers une incision minimale dans le cou, et canalisez-la avec un cathéter intraveineux de 20 G connecté à un ventilateur de rongeur (volume courant : 250 mL/course) à une fréquence respiratoire de 34 à 38 cycles/min, comme décrit précédemment14.
- Placez l’animal dans un décubitus latéral pour effectuer la thoracotomie latérale gauche au quatrième ou cinquième espace intercostal. Faire une incision dans la peau de l’animal ; Observez les muscles ci-dessous et écartez-les soigneusement pour les séparer de la paroi thoracique afin de voir clairement l’espace intercostal. À ce stade, assurez-vous que l’animal est correctement connecté au ventilateur ; Ensuite, ouvrez l’espace intercostal en faisant un trou avec la pince très tranchante.
REMARQUE : La LDA doit être identifiable le long de la paroi ventriculaire gauche libre (VG) dans les espaces intercostaux mentionnés ci-dessus.
- Effectuez la péricardectomie et identifiez la LDA en contrastant les artères coronaires avec les veines coronaires et la ramification de la LDA sous le pavillon gauche. Ensuite, effectuez la ligature du LDA à l’aide du 8-0 fil de soie à ~2 mm du bord de l’oreillette. Enfin, fermez le thorax par couches à l’aide du fil de soie 6-0, fermez les côtes, en vous assurant qu’il n’y a pas de pneumothorax à l’intérieur (faites-le avec précaution en forçant les poumons à se dilater avec le ventilateur), et approchez-vous des muscles ou suturez-les avant de fermer la peau.
- Une fois la peau fermée, débranchez lentement la souris du ventilateur en décubitus ventral et retirez le tube endotrachéal lorsque la fréquence respiratoire a récupéré. Laissez l’animal se remettre de l’anesthésie dans un environnement calme et, de préférence, avec une température ambiante stable à 27 °C.
- Attendez que les animaux se remettent de l’anesthésie, commencent à bouger leurs membres et que leur fréquence respiratoire normale soit rétablie. Ensuite, hébergez-les dans des cages individuelles jusqu’à la fin du protocole.
- Effectuer la même procédure sur les animaux témoins ou opérés en simulacre, mais sans la ligature de la LDA.
3. Conception de l’étude
- Pour tester l’évolution temporelle de la cicatrisation et du remodelage ventriculaire après un infarctus du myocarde, randomisez les souris dans les groupes suivants :
- Pour étudier la phase précoce du remodelage ventriculaire après 1 semaine d’évolution de l’IM, assignez les souris aux groupes suivants : 1) C57 Sham (1 semaine) ; 2) Gal-3 KO Sham (1 semaine) ; 3) C57 MI (1 semaine) ; 4) Gal-3 KO MI (1 semaine).
- Pour étudier la phase tardive du remodelage ventriculaire à 4 semaines d’IM, répartissez les souris dans les groupes suivants : 5) C57 Sham (4 semaines) ; 6) Gal-3 KO Sham (4 semaines) ; 7) IM C57 (4 semaines) ; 8) Gal-3 KO MI (4 semaines).
4. Échocardiographie
REMARQUE : Pour les échocardiogrammes de souris, des transducteurs linéaires de plus de 10 MHz doivent être utilisés pour une visualisation correcte des diamètres de paroi et des tailles de cavité. Cette procédure peut être réalisée sous anesthésie avec un avertin intrapéritonéal (IP) à 1,15 mL/kg ou chez des animaux conscients. Cependant, ce dernier peut entraîner des résultats confondants chez les souris atteintes d’IM en raison du stress et de l’anxiété causés par la manipulation.
- Pour anesthésier une souris, prenez-la, tenez-la le dos vers la paume et retournez-la pour atteindre la surface de l’abdomen. Dans cette position, injectez l’anesthésie IP à un angle de 45° entre l’animal et l’aiguille sous-cutanée.
- Une fois la souris anesthésiée, rasez-lui la poitrine et placez la souris sur un coussin chauffant préchauffé en position de décubitus dorsal. Pour obtenir des vues parasternales sur l’axe long et sur l’axe court, déplacez la sonde de 90°. Une fois la vue de l’axe correcte obtenue, placez le curseur au niveau du muscle papillaire, appuyez sur la touche 2D M-mode pour capturer les images et utilisez un logiciel d’analyse d’images pour mesurer les paramètres suivants :
- Mesurez les dimensions du VG, y compris l’épaisseur de la paroi (LVWT), les zones VG à la fois en systole (S) et en diastole (D), et la zone diastolique ventriculaire gauche (LVDA) et la zone systolique ventriculaire gauche (LVSA) en au moins trois battements.
- De plus, calculer la fonction ventriculaire par la fraction d’éjection (EF, %), la fraction de raccourcissement (SF, %), et la masse cardiaque (supposons un cube non corrigé) à l’aide de l’équation (1), de l’équation (2) et de l’équation (3), comme décrit précédemment15.
SF ( %) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
FE ( %) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
Masse VG = 1,055 × ([IVST + LVEDD + PWT]3− [LVEDD]3) (3)
Où LVEDD est le diamètre diastolique final du ventricule gauche, LVESD est le diamètre end-systolique ventriculaire gauche, IVST est l’épaisseur intraventriculaire et PWT est l’épaisseur de la paroi postérieure.
5. Évaluation histologique
- Lors de la nécropsie, extrayez le cœur de l’animal en ouvrant le thorax d’un côté à l’autre et en coupant toutes les structures qui l’entourent. Nettoyez le caillot sanguin qui se trouve à l’intérieur des cavités en appliquant une légère pression à l’aide de papier de soie.
- Récoltez et pesez le cœur sur une balance de précision de laboratoire. Immergez-le dans du formaldéhyde à 10 % pendant au moins 72 h à température ambiante. Coupez le cœur manuellement de l’apex à la base en tranches transversales de 1 mm d’épaisseur à l’aide d’une lame, et traitez les tranches en les enrobant dans de la paraffine. Effectuez des coupes en série sur les sections enrobées de paraffine de 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
- Placez chaque section entre les lames et colorez-les avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E), des sections trichromes de Masson, des sections colorées à la lectine conjuguée à la rhodamine ou du rouge Picrosirius15,16.
- À l’aide d’un photomicroscope approprié, prenez des images numérisées à 400x pour la morphométrie, la fibrose et la quantification de la MCSA. Vérifiez que le microscope est connecté à un appareil photo numérique et à un ordinateur doté d’un logiciel d’analyse d’images. Pour chaque analyse morphométrique, assurez-vous que les images se trouvent dans les mêmes zones, avec un minimum de 10 champs de haute puissance à 400x par section (septum, zone infarctus et zone distante) et sans chevauchement des champs.
- Pour mesurer le MCSA, soyez conscient de la position des myocytes cardiaques et ne comptez que les myocytes qui sont coupés transversalement et entourés d’au moins trois capillaires à proximité.
- Dans les tranches colorées en rouge Picrosirius, identifiez les zones cicatricielles et septum, et imagez le collagène interstitiel dans les deux zones. Téléchargez les images sur le logiciel d’analyse et ouvrez l’onglet de seuil pour mettre en évidence toutes les zones de collagène positives et négatives Pour obtenir les données, appuyez sur l’onglet de mesure et enregistrez les résultats. Pour calculer le pourcentage de collagène par région, utilisez l’équation (4), ajoutez les zones positives au collagène et divisez-les par le tissu total, y compris les zones positives au collagène, comme décrit ailleurs15,16.
Collagène ( %) = zone rouge de Picrosirius/surface totale des tissus (4)
- Quantifier le MCSA à partir des images numérisées obtenues à partir des sections colorées à la lectine conjuguée à la rhodamine des échantillons enrobés de paraffine. Pour obtenir la bonne image, utilisez un logiciel d’analyse d’images pour tracer les contours rouges des myocytes entourant les membranes cellulaires. Sélectionnez l’onglet Zone , tracez les contours et appuyez sur la fonction Onglet Mesure . Enfin, enregistrez les résultats des zonesde cellule 16.
6. Détermination quantitative de la taille et de la planimétrie de l’infarctus pour évaluer le remodelage cardiaque
- Mesurer la taille de l’infarctus du myocarde, l’épaisseur de la paroi et la longueur des circonférences endocardique et épicardique à l’aide de la planimétrie à partir des images histologiques des coupes trichromes de Masson obtenues au microscope optique (4x) et du logiciel approprié.
- Pour la quantification de la taille de l’infarctus, identifiez la zone d’infarctus (en bleu) et la zone éloignée (en rouge). Tracez et mesurez la longueur totale de la zone d’infarctus et de la zone distante des côtés endocardique et épicardique. Calculez la moyenne des tracés endocardiques et épicardiques en pourcentage de la circonférence totale du VG17.
- De même, mesurez l’épaisseur de la cicatrice (la moyenne de cinq mesures équidistantes) et l’épaisseur du septum (la moyenne de trois mesures équidistantes) dans une section centrale du cœur, et utilisez ces mesures pour déterminer le rapport d’épaisseur de la cicatrice (équation [5]) et l’indice de dilatation (équation [6]18).
REMARQUE : Toutes les valeurs peuvent être enregistrées dans une feuille de calcul.
Rapport d’épaisseur de cicatrice = Épaisseur de la cicatrice/Épaisseur du septum (5)
Indice de dilatation = (surface de la cavité VG/surface VG totale) × (épaisseur du septum/épaisseur de la cicatrice) (6)
REMARQUE : Étant donné que le remodelage peut modifier l’expansion, entraînant une sous-estimation ou une surestimation de la taille de l’infarctus, un certain temps peut être nécessaire pour effectuer une expérience pilote de mesure de la taille de l’infarctus à 24 heures, suivie d’une euthanasie. Dans ce cas, anesthésez l’animal avec la même solution anesthésique IP que celle utilisée pour la procédure d’IM.
- Placez l’animal dans un décubitus dorsal et intubez-le comme décrit précédemment. Une fois l’animal anesthésié, faites une incision diagonale profonde qui atteint la peau, les muscles et les os costaux de l’apophyse xiphoïde au creux axillaire.
- Isolez l’arc aortique, faites un petit trou dans l’aorte ascendante et introduisez un cathéter pour perfuser le cœur avec le bleu d’Evan. Ensuite, retirez manuellement le cœur taché de l’animal et coupez-le de l’apex à la base avec une lame tranchante. Placez les tranches de cœur dans du chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à 1 % dans un tampon de phosphate isotonique (pH 7,4) et incubez à 37 °C pendant 30 min 4 pour confirmer que les animaux sont comparables en termes de taille d’infarctus.