Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

Summary

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Abstract

La protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP) est une protéine de liaison à l’ARNm qui régule la traduction locale des protéines. La perte ou le dysfonctionnement de la FMRP entraîne des activités neuronales et synaptiques aberrantes dans le syndrome de l’X fragile (FXS), qui se caractérise par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des problèmes de communication sociale. Les études de la fonction FMRP et de la pathogenèse FXS ont principalement été menées avec Fmr1 (le gène codant pour FMRP) knockout chez des animaux transgéniques. Nous rapportons ici une méthode in vivo pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP pendant la période d’assemblage du circuit et de formation synaptique à l’aide d’embryons de poulet. Cette méthode utilise l’électroporation spécifique au stade, au site et à la direction d’un système vectoriel inductible par médicament contenant un petit ARN en épingle à cheveux Fmr1 (shRNA) et un rapporteur EGFP. Avec cette méthode, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif dans le ganglion auditif (AG) et dans l’une de ses cibles du tronc cérébral, le noyau magnocellularis (NM), fournissant ainsi une manipulation spécifique au composant dans le circuit AG-NM. De plus, le motif en mosaïque de la transfection permet des contrôles intra-animaux et des comparaisons neurones/fibres voisines pour une fiabilité et une sensibilité accrues dans l’analyse des données. Le système de vecteurs inductibles fournit un contrôle temporel de l’apparition de l’édition de gènes afin de minimiser l’accumulation d’effets sur le développement. La combinaison de ces stratégies fournit un outil innovant pour disséquer la fonction autonome cellulaire de la FMRP dans le développement synaptique et de circuits.

Introduction

Le syndrome de l’X fragile (FXS) est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des comportements autistiques. Dans la plupart des cas, le FXS est causé par une perte globale de la protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP; codée par le gène Fmr1) à partir des premiers stades embryonnaires¹. La FMRP est une protéine de liaison à l’ARN qui est normalement exprimée dans la plupart des neurones et des cellules gliales du cerveau, ainsi que dans les organes sensoriels ^2,3,4. Da....

Protocol

Les œufs et les embryons de poulet ont été manipulés avec soin et respect conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Jinan.

1. Préparation d’oeufs et de plasmides

1. Préparation des œufs
   1. Procurez-vous des œufs de poule frais fécondés (Gallus gallus) de l’Université agricole de Chine méridionale et conservez-les à 16 °C avant l’incubation. Pour une viabilité optimale, préparez tous les œufs pour l’incubation dans la semaine suivant l’arrivée.
   2. Placer les œufs horizontalement et incuber à 38 °C pendant 46 à 48 h j....

Results

En effectuant une électroporation in ovo à différents sites et à différents stades de développement, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif soit dans la périphérie auditive, soit dans le tronc cérébral auditif.

FMRP knockdown en NM
Un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) contre le poulet Fmr1 a été conçu et cloné dans le système vectoriel Tet-On comme décrit précédemment²⁰. La configuration de l’électroporation in ovo

Discussion

Pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP, il est nécessaire de manipuler son expression dans des groupes cellulaires individuels ou des types de cellules. Étant donné que l’une des principales fonctions de la FMRP est de réguler la formation synaptique et la plasticité, la manipulation sélective de chaque composant synaptique d’un certain circuit est une condition préalable à une compréhension complète du mécanisme FMRP dans la communication synaptique. En utilisant l’él.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
incubation des œufs
16 ° ; C réfrigérateur	MAGAT		Utilisé pour le stockage des œufs fécondés.
Incubateur d’œufs	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Œufs fécondés	Ferme de l’Université		Les œufs doivent être utilisés en une semaine pour une viabilité optimale.
Préparation plasmidique
Centrifugeuse	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Faire une solution de travail à 0,1 % dans de l’eau distillée et de l’autoclave.
Plasmide Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissoudre l’ADN plasmidique dans un tampon Tris-EDTA (TE) ; kit de préparation sans endotoxines
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S2889	Faire 7,5M solution de travail dans de l’eau sans nuclase.
<Électroporation > forte et administration de doxycycline
Electroporator	BTX	ECM399
Seringue 1 mL / 5 mL	GUANGZHOU KANGFULAI
Microscope de dissection	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Utilisez des aliquotes fraîches pour chaque dose et conservez à -20 & deg ;C.
Capillaire en verre	BEIBOBOMEI	RD0910	0,9-1,1 mm*100 mm
Parafilm de laboratoire	PARAFILM	PM996	film transparent
Extracteur de pipette	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Condition de traction : 500 ° ; C pour 15 s
Elctrodes en platine	Fait		0,5 mm de diamètre, 1,5 mm d’intervalle.
Tube en caoutchouc	Sigma-Aldrich	A5177
Dissection et fixation tissulaire
Forceps	RWD	F11020-11	Taille de l’embout : 0.05*0.01 mm
Autres outils chirurgicaux	RWD
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127	Une solution de PFA à 4 % fraîchement préparée dans une solution saline tamponnée au phosphate peut être conservée à 4 ° ; C jusqu’à 1 semaine.
SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone	DOW	01673921	Pour les plaques à fond noir, une poudre de carbone de qualité alimentaire est appliquée.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gélatine	Sigma-Aldrich	G9391	À partir de peau de bovin.
Microtome coulissant	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris	Abcam	ab150113	dilution 1:500, RRID : AB_2576208
Alexa Fluor 555 chèvre anti-lapin	Abcam	ab150078	dilution 1:500, RRID : AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1 : 1000 dilution
Fluoromount-G milieu de montage	Sud  ; Biotech	Sb-0100-01
Anticorps FMRP	Y. Wang, Florida State University	#8263	Dilution 1:1000, RRID : AB_2861242
Islet-1 Anticorps	DSHB	39.3F7	Dilution 1:100, RRID : AB_1157901
Netwell plaque	Corning	3478
Neurofilament Anticorps	Sigma-Aldrich	N4142	dilution 1:1000, RRID : AB_477272
Anticorps anti-parvalbumine	Sigma-Aldrich	P3088	dilution 1:10000, RRID : AB_477329
SNAP25	Abcam	ab66066	dilution 1:1000, RRID :
AB_2192052Imaging
Adobe photoshop	Logiciel de retouche d’images	ADOBE
microscope confocal	LEICA	SP8
Stéréomicroscope fluorescent	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		progiciel de traitement d’images commercial