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Article de méthode

Surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre

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DOI :

10.3791/64190

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18 août 2022

 , 
1Department of Environmental Sciences, University of California, Riverside

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un protocole pour la surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre.

Résumé

La méthylation de la cytosine est hautement conservée chez les espèces de vertébrés et, en tant que facteur clé de la programmation épigénétique et de l’état de chromatine, joue un rôle essentiel dans le développement embryonnaire précoce. Les modifications enzymatiques entraînent la méthylation active et la déméthylation de la cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC) et l’oxydation ultérieure de la 5-mC en 5-hydroxyméthylcytosine, 5-formylcytosine et 5-carboxylcytosine. La reprogrammation épigénétique est une période critique du développement in utero , et l’exposition maternelle aux produits chimiques a le potentiel de reprogrammer l’épigénome dans la progéniture. Cela peut potentiellement entraîner des résultats indésirables tels que des conséquences phénotypiques immédiates, des effets à long terme sur la susceptibilité aux maladies chez l’adulte et des effets transgénérationnels des marques épigénétiques héréditaires. Bien que le séquençage à base de bisulfite permette aux chercheurs d’interroger la méthylation de la cytosine à une résolution par paire de bases, les approches basées sur le séquençage sont coûteuses et, en tant que telles, empêchent la capacité de surveiller la méthylation de la cytosine à tous les stades de développement, les concentrations multiples par produit chimique et les embryons répliqués par traitement. En raison de la facilité de l’imagerie in vivo automatisée, des manipulations génétiques, du temps de développement ex utero rapide et de l’élevage pendant l’embryogenèse, les embryons de poisson zèbre continuent d’être utilisés comme modèle physiologiquement intact pour découvrir les voies médiées par les xénobiotiques qui contribuent à des résultats indésirables au cours du développement embryonnaire précoce. Par conséquent, en utilisant des anticorps spécifiques au 5-mC disponibles dans le commerce, nous décrivons une stratégie rentable pour une surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation de la cytosine dans des embryons de poisson-zèbre intacts individuels en tirant parti de l’immunohistochimie à montage entier, de l’imagerie automatisée à haut contenu et du traitement efficace des données à l’aide du langage de programmation avant l’analyse statistique. Selon les connaissances actuelles, cette méthode est la première à détecter et à quantifier avec succès les niveaux de 5-mC in situ dans les embryons de poisson zèbre au cours du développement précoce. La méthode permet la détection de la méthylation de l’ADN dans la masse cellulaire et a également la capacité de détecter la méthylation de la cytosine des ARNm maternels localisés par le jaune au cours de la transition mère-zygote. Dans l’ensemble, cette méthode sera utile pour l’identification rapide des produits chimiques susceptibles de perturber la méthylation de la cytosine in situ lors de la reprogrammation épigénétique.

Introduction

Les modifications enzymatiques entraînent la méthylation active et la déméthylation de la cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC) et l’oxydation ultérieure de la 5-mC en 5-hydroxyméthylcytosine, 5-formylcytosine et 5-carboxylcytosine 1,2. Le phosphate de tris(1,3-dichloro-2-propyle) (TDCIPP) est un retardateur de flamme largement utilisé aux États-Unis dont il a déjà été démontré qu’il modifie la trajectoire de méthylation de la cytosine après une exposition embryonnaire précoce de 0,75 heure après la fécondation (HPF) jusqu’à la gastrulation précoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Chez les vertébrés, le 5-mC et ses dérivés modifiés sont essentiels pour réguler le développement embryonnaire précoce9. La fécondation d’un embryon déclenche la déméthylation de l’ADN parental, suivie de la dégradation de l’ARNm maternel, de l’activation du génome zygotique et de la reméthylation du génome zygotique9. Les processus biologiquement pertinents qui utilisent la méthylation de la cytosine comprennent la modification des histones, le recrutement de la machinerie transcriptionnelle, la méthylation de l’ARN, la reprogrammation épigénétique et la détermination de la structure de la chromatine10,11. La méthylation de la cytosine est également conservée chez les espèces de vertébrés, ce qui souligne l’importance de comprendre et d’étudier comment la méthylation aberrante de la cytosine peut affecter la trajectoire du développement d’un organisme11. De plus, le développement in utero est sensible à l’exposition maternelle et peut entraîner des effets indésirables tels que des conséquences phénotypiques immédiates, des effets à long terme sur la susceptibilité aux maladies chez l’adulte et des effets transgénérationnels des marques épigénétiques héréditaires12,13,14.

De longues étendues de paires cytosine-guanine, ou îlots CpG, ont été les principaux foyers d’intérêt des chercheurs qui visent à caractériser la dynamique de la méthylation de la cytosine dans le génome15,16,17. Les stratégies à base de bisulfite telles que le séquençage du bisulfite du génome entier, le séquençage du bisulfite à représentation réduite et le séquençage de l’amplicon du bisulfite représentent l’étalon-or pour interroger la méthylation de la cytosine à la résolution par paire de bases. Cependant, les approches basées sur le séquençage sont d’un coût prohibitif et, en tant que telles, empêchent la capacité de surveiller la méthylation de la cytosine à tous les stades de développement, à des concentrations multiples par produit chimique et de répliquer les embryons par traitement. En outre, les approches basées sur le séquençage ne fournissent pas d’informations sur la localisation spatiale, ce qui est essentiel pour comprendre les types de cellules et les zones potentiellement affectées au sein d’un embryon en développement. De même, les tests globaux de méthylation de l’ADN tels que l’analyse de restriction dépendante de la méthylation, les tests immunologiques enzymatiques (ELISA) de 5-mC et la chromatographie liquide par spectrométrie de masse (LC-MS) de la 5-méthyl-2'-désoxycytidine (5-mC) reposent sur des homogénats cellulaires ou tissulaires et, en tant que tels, empêchent la capacité de surveiller la localisation et l’ampleur de la méthylation de la cytosine dans l’espace et le temps dans des échantillons intacts12,18.

En raison de la facilité de l’imagerie in vivo automatisée, des manipulations génétiques, du temps de développement ex utero rapide et de l’élevage pendant l’embryogenèse, les embryons de poisson zèbre continuent d’être largement utilisés comme modèles physiologiquement intacts pour découvrir les voies médiées par les xénobiotiques qui contribuent à des résultats indésirables au début du développement embryonnaire. Par conséquent, en utilisant des anticorps disponibles dans le commerce spécifiques au 5-mC, le protocole ci-dessous décrit une stratégie rentable pour une surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation de la cytosine dans des embryons de poisson-zèbre intacts individuels en tirant parti de l’immunohistochimie (IHC), de l’imagerie automatisée à haut contenu et du traitement efficace des données à l’aide du langage de programmation avant l’analyse statistique.

Selon les connaissances actuelles, cette méthode est la première à surveiller le 5-mC dans des embryons de poisson zèbre intacts. La méthode permet la détection de la méthylation de l’ADN dans la masse cellulaire et a également la capacité de détecter la méthylation de la cytosine des ARNm maternels localisés par le jaune au cours de la transition mère-zygote. Dans l’ensemble, cette méthode sera utile pour l’identification rapide des produits chimiques susceptibles de perturber la méthylation de la cytosine in situ lors de la reprogrammation épigénétique.

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Protocole

Les éleveurs adultes ont été manipulés et traités conformément à un protocole d’utilisation des animaux approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) (#20180063) à l’Université de Californie, Riverside.

1. Collecte d’embryons de poisson zèbre et exposition à des produits chimiques

  1. Ajouter des pièges de reproduction dans les bassins contenant des poissons-zèbres mâles et femelles adultes sexuellement matures et viables sur le plan de la reproduction. Ajouter au moins trois pièges par réservoir de 6 L au moins 12 h avant la collecte à ~9h00, ce qui est le moment approximatif de la fécondation et du frai des œufs dans les réservoirs.
  2. Préparer une solution d’exposition fraîche le matin de la collecte. La solution d’exposition est préparée à l’aide d’une pipette de 5 mL et en ajoutant 5,0 mL d’eau du système sans particules à une boîte de Petri en verre de 60 mm.
  3. Ensuite, utilisez une pipette microcapillaire en verre de 10 μL pour transférer 10 μL de solution mère de véhicule (diméthylsulfoxyde ou DMSO) ou de produit chimique à l’eau du système dans le plat en verre.
  4. Faites tourbillonner la boîte de Petri en verre pour vous assurer que la solution mère se dissipe. Ajouter 5,0 ml supplémentaires d’eau du système à la boîte de Pétri en verre. Remuer la boîte de Petri en verre pour homogénéiser la solution d’exposition.
  5. Répéter pour chaque groupe de traitement en répétitions de quatre pour obtenir quatre répétitions par traitement.
  6. Une fois les solutions d’exposition préparées, boucher les plats en verre avec des couvercles en verre pour minimiser l’évaporation.
  7. Tout en retirant les pièges reproducteurs de chaque réservoir, laissez soigneusement l’eau à l’intérieur de chaque piège s’écouler dans le réservoir avant de la retirer des réservoirs. Assurez-vous que les pièges restent à droite.
  8. Transférer les pièges reproducteurs dans l’évier de laboratoire et les rincer à l’aide d’une bouteille remplie d’eau osmosée (OI) dans une filets préalablement trempée dans de l’eau de Javel à 10% et rincée à l’eau. Rincez les embryons jusqu’à ce que tous les débris soient éliminés et qu’il ne reste que des embryons propres.
  9. Transférer les embryons de la filet à l’aide d’une bouteille d’eau RO remplie d’eau dans une boîte de Petri en plastique de 100 mm. Trier au hasard 50 embryons vivants à 0,75 h après la fécondation (HPF) et enlever l’excès d’eau d’OI.
  10. À l’aide d’une microspatule, placer les embryons triés dans la solution de traitement. Tous les embryons doivent se trouver dans le véhicule ou la solution de traitement au plus tôt à 9 h 45. Remuez les plats en verre pour vous assurer que les embryons sont uniformément enrobés dans la solution de traitement.
  11. Une fois que quatre boîtes répliquées (N = 50 par répétition) ont été installées pour chaque groupe de traitement, placez le couvercle en verre sur les boîtes d’exposition et transférez toutes les boîtes dans un incubateur à température contrôlée réglé à 28 °C jusqu’à 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf ou 10 hpf.
  12. Préparer du paraformaldéhyde (PFA) frais à 4 % au moins 4 h avant la fin de l’exposition et conserver à 4 °C.
    1. Allumer la plaque chauffante à 115 °C, préparer 20 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (2 mL de 10x PBS + 18 mL d’eau osmosée) dans un tube à centrifuger de 50 mL et peser 800 mg de paraformaldéhyde.
    2. Dans une hotte chimique, transvaser 1x solution de PBS dans une fiole d’erlenmeyer de 250 mL, ajouter 800 mg de paraformaldéhyde, puis ajouter 2 μL de NaOH 10 N. Placez un thermomètre à l’intérieur de la fiole, placez la fiole sur la plaque chauffante et surveillez la température tout en remuant.
    3. Lorsque la température atteint 62-65 °C, retirez le PFA à 4% de la plaque chauffante et laissez-la refroidir à température ambiante (RT). Conserver le PFA à 4 % à 4 °C.
  13. Une fois la durée d’exposition terminée, retirez les embryons de l’incubateur et transférez tous les embryons vivants dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Aspirer la solution d’exposition résiduelle à l’aide d’une pipette de 1 mL. N’aspirez aucun embryon.
  14. Ajouter 500 μL de PFA réfrigéré à 4% dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et mélanger les embryons dans 4% PFA en retournant plusieurs fois. Laissez les embryons se fixer dans 4% PFA pendant la nuit.
    REMARQUE: Il n’est pas recommandé de laisser les embryons rester dans le PFA pendant plus de 12 heures.

2. Déchorionation des embryons

  1. Le lendemain, aspirez le PFA à 4%, remettez les embryons en suspension dans 1x PBS et pipeter doucement de haut en bas pendant 30 s. Si nécessaire, arrêtez le protocole à cette étape et conservez les embryons dans 1x PBS à 4 °C jusqu’à 48 h.
  2. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférer soigneusement les embryons fixés dans un plat en verre rempli d’eau osmosée et agiter doucement pendant 30 s. Répétez cette étape une fois de plus.
  3. Utilisez des aiguilles de seringue avec un grossissement de 5,0x à l’aide d’un stéréomicroscope standard pour déchorioner manuellement tous les embryons. Pour ce faire, utilisez la pointe de l’aiguille pour percer le chorion et le décoller doucement du jaune et de la masse cellulaire4.
  4. Une fois les embryons déchorionnés, utilisez une pipette microcapillaire en verre pour transférer jusqu’à 25 embryons intacts dans un panier d’immunochimie (IHC) et placez le panier IHC dans une plaque de 96 puits. Utilisez une pipette de 1 mL pour aspirer l’eau d’osmose inverse de chaque puits.

3. Immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques de 5 mC

  1. Remettez les embryons en suspension dans 500 μL de tampon bloquant (1x PBST + 2% de sérum de mouton + 2 mg/mL d’albumine sérique bovine) par puits, et enveloppez la plaque avec du parafilm et du papier d’aluminium pour les protéger de la lumière. Incuber à 4 °C pendant 4 h sur un agitateur orbital (100 tr/min).
  2. Retirez la pellicule de parafilm et l’aluminium et utilisez une pipette de 1 mL pour aspirer le tampon de blocage de chaque puits. Remplacez-le par 500 μL d’une dilution 1:100 d’anticorps monoclonal anti-5-mC de souris dans le tampon de blocage. Incuber tous les embryons avec des anticorps primaires, à l’exception d’un sous-ensemble d’embryons témoins de véhicules qui seront incubés avec le tampon bloquant pour tenir compte du bruit de fond. Attention à ne pas perturber l’intégrité des embryons, ni à aspirer les embryons lors de cette étape.
  3. Réenvelopper la plaque dans du parafilm et du papier d’aluminium et laisser la plaque incuber à 4 °C pendant une nuit sur un agitateur orbital (100 tr/min).
  4. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaires de chaque puits et remplacez-la par 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Lavez chaque puits trois fois avec 1x PBST pendant 15 minutes par lavage sur un agitateur orbital (100 tr / min).
  5. Remplacer 1x PBST par une dilution de 1:500 d’anticorps IgG anti-souris de chèvre dans le tampon de blocage et incuber tous les embryons avec l’anticorps secondaire. Laisser la plaque incuber à 4 °C pendant une nuit sur un agitateur orbital (100 tr/min).
  6. Le lendemain, retirer l’anticorps secondaire et laver la solution résiduelle trois fois avec 1x PBST pendant 15 min par lavage sur un agitateur orbital (100 rpm).
    REMARQUE: Le protocole peut être arrêté ici jusqu’à 48 heures si les paniers IHC sont stockés dans des puits propres remplis de 1x PBS.
  7. Utilisez une pipette de 1 mL pour aspirer 1x PBST de chaque puits et placez le panier IHC dans une boîte de Petri en verre remplie d’eau osmosée. Sous un stéréomicroscope standard, triez au hasard les embryons intacts dans une plaque de 96 puits, ce qui donne un embryon par puits.
  8. À l’aide d’une pipette de 1 mL, retirer toute l’eau d’osmose inverse des puits individuels et la remplacer par 200 μL de 1x PBS. Centrifuger la plaque pendant 3 min à 1 x g.

4. Imagerie automatisée des embryons dans des plaques à 96 puits

  1. Imagez les embryons avec un objectif 2x sous lumière transmise et FITC à l’aide d’un système de dépistage à haut contenu (Table of Materials).
    REMARQUE: Une image fluorescente de chaque embryon a été capturée automatiquement à l’aide du grossissement mentionné ci-dessus et d’un filtre FITC19.
    1. Sélectionnez Autofocus pour vous assurer que la mise au point de l’appareil photo est sur le bas de la plaque et décalée par l’épaisseur inférieure.
    2. Sélectionnez une longueur d’onde FITC avec une durée d’exposition de 100 ms et réglez l’autofocus sur laser avec un décalage Z. Observer et confirmer l’acquisition correcte de l’image dans plusieurs puits avant de commencer l’acquisition de plaques.
      REMARQUE: L’instrument acquiert automatiquement des images de tous les puits sélectionnés contenant des embryons. Une plaque de 96 puits nécessitait environ 30 minutes pour l’acquisition d’images et le stockage de données. Pendant toute la durée de la période d’acquisition, la température interne à l’intérieur du système d’imagerie a été maintenue à RT.
  2. Après l’acquisition de l’image, effectuez l’analyse des données à l’aide du système de filtrage à haut contenu et d’une procédure d’analyse d’image automatisée personnalisée. Sélectionnez chaque embryon sur la plaque de 96 puits à analyser pour la surface totale et l’intensité intégrée de la fluorescence.
    REMARQUE : L’analyse comprenait la fourniture d’images contenant des superpositions de points de données de l’analyse.
  3. Ensuite, tabulez les points de données et exportez-les à partir du système de filtrage à haut contenu en allant sous Mesure et en sélectionnant Open Data Log vers une feuille de calcul. Les parties relatives à l’acquisition de plaques et à l’analyse des données sont illustrées à la figure 1.

5. Analyse des données

  1. Téléchargez la feuille de calcul exportée dans un programme informatique où le package du déployeur (dplyr) est utilisé pour trier, additionner les données de chaque puits et filtrer par numéro de puits. Le package writexl est ensuite utilisé pour exporter les données sommées dans une feuille de calcul. Le code de programme 5mC est affiché dans le fichier supplémentaire 1.

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Résultats

L’objectif global de ce protocole est de déterminer si un traitement affecte l’abondance relative de 5-mC en évaluant la surface totale et l’intensité relative de la fluorescence dans les embryons de poisson-zèbre fixes et marqués. Après avoir terminé le protocole, un stéréomicroscope à fluorescence peut être utilisé pour déterminer d’abord si l’IHC à monture entière a réussi. Lorsque des embryons marqués sont observés sous un filtre FITC ou GFP, un résultat positif est indiqué par un signal FITC positif dans l’embryon, ...

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Discussion

Au cours de ce protocole, il y a quelques étapes qui sont critiques. Tout d’abord, lors de la déchorionisation des embryons, il est important de pointer l’aiguille loin du tissu de l’embryon / sac vitellin / masse cellulaire, car ces parties de l’embryon en développement sont très fragiles et faciles à percer. Deuxièmement, lors du transfert d’embryons marqués vers des puits individuels, utilisez une pipette en verre pour transférer les embryons, car ils adhéreront à une pipette en plastique. Troisièmement, lors de l’exé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.

Remerciements

Le soutien à la recherche a été fourni par une bourse de la division des études supérieures de l’UCR à SAB, une bourse du programme de formation T32 de la NRSA (T32ES018827) à SAB, et une subvention des National Institutes of Health (R01ES027576) et le projet Hatch (1009609) de l’USDA National Institute of Food and Agriculture à DCV.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à microcentrifuger de 1,5 mLFisher Scientific540225
10-µ ; Pipette microcapillaire en verre LFisher Scientific211762B
Boîte de Pétri en plastique de 100 mmFisher Scientific08757100D
10x solution saline tamponnée au phosphate  ;Fisher ScientificBP399500
pipette de 1 mLFisher Scientific13690032
Erlenmeyer de 250 mLFisher ScientificFB501250
de 60 mm avec couverclesFisher Scientific08747A
Plaque à 96 puitsFisher Scientific720089
AlexaFluor 488 IgG de chèvre conjuguée anticorps  ;Fisher ScientificA21121
Albumine sérique bovineFisher ScientificBP67110
DMSOFisher ScientificBP2311
Plaque chauffante  ;Fisher Scientific1110016SH
Pièges de reproduction en bassinHabitats aquatiquesN/ACe produit n’est plus disponible suite à l’acquisition d’Aquatic Habitats par Pentair. Les enquêteurs peuvent utiliser des réservoirs d’élevage standard hors système disponibles auprès de plusieurs fournisseurs.
Système de criblage à haut contenu ImageXpress Micro XLS WidefieldMolecular DevicesN/ATout système de criblage à haut contenu équipé d’un filtre à lumière transmise et d’un filtre FITC conviendra.
Fabricationen interne à l’aide de tubes de microcentrifugation dont la partie conique a été retirée et le fond équipé d’un treillis, dimensionnés pour des plaques de 24 ou 48 puits.
MetaXpress 6.0.3.1658  ;Dispositifs moléculairesN/ATout logiciel capable de quantifier la surface totale et l’intensité intégrée de la fluorescence conviendra.
MicrospatuleFisher Scientific2140115
Souris monoclonale Anticorps anti-5-mCMillipore SigmaMABE146
NaOHFisher ScientificBP359-500
Agitateur orbital  ;Fisher Scientific50998290
Parafilm.Fisher Scientific1337412
Paraformaldéhyde  ;Fisher Scientific18612139
Pipette de transfert en plastiqueFisher Scientific1368050
RstudioRStudioN/ARStudio est un logiciel open source qui peut être téléchargé à l’adresse https://www.rstudio.com.
Sérum de moutonMillipore SigmaS3772-5ML
StéréomicroscopeLeica10450103
Incubateur à température contrôlée  ;Fisher ScientificPR505755L
Tween-20  ;Fisher ScientificP7949-500ML
Pipette de 5 mL Fisher Scientific 13690033

Références

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