Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.
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Article de méthode
Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les nanoparticules biomimétiques obtenues à partir de bactéries ou de virus ont suscité un intérêt considérable dans la recherche et le développement de vaccins. Les vésicules de la membrane externe (OMV) sont principalement sécrétées par les bactéries à Gram négatif pendant la croissance moyenne, avec un diamètre nanométrique et une activité auto-adjuvante, ce qui peut être idéal pour l’administration du vaccin. Les OMV ont fonctionné comme un système d’administration à multiples facettes pour les protéines, les acides nucléiques et les petites molécules. Pour tirer pleinement parti des caractéristiques biologiques des OMV, les OMV dérivés d’Escherichia coli issus du bio-ingénierie ont été utilisés comme porteur et le domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2 (RBD) comme antigène pour construire une plate-forme vaccinale « Plug-and-Display ». Les domaines SpyCatcher (SC) et SpyTag (ST) de Streptococcus pyogenes ont été appliqués aux OMV et RBD conjugués. Le gène de la cytolysine A (ClyA) a été traduit avec le gène SC en protéine de fusion après transfection plasmidique, laissant un site réactif à la surface des OMV. Après avoir mélangé RBD-ST dans un système tampon conventionnel pendant la nuit, une liaison covalente s’est formée entre les OMV et les RBD. Ainsi, un vaccin multivalent OMV a été obtenu. En les remplaçant par divers antigènes, la plateforme vaccinale OMVs peut afficher efficacement une variété d’antigènes hétérogènes, prévenant ainsi potentiellement rapidement les épidémies de maladies infectieuses. Ce protocole décrit une méthode précise pour construire la plateforme vaccinale OMV, y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.
Introduction
En tant que plate-forme vaccinale potentielle, les vésicules de membrane externe (OMV) ont attiré de plus en plus d’attention ces dernières années 1,2. Les OMV, principalement sécrétées naturellement par les bactéries à Gram négatif3, sont des particules sphériques à l’échelle nanométrique composées d’une bicouche lipidique, généralement de la taille de 20-300nm4. Les OMV contiennent divers composants bactériens parentaux, y compris des antigènes bactériens et des profils moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP), qui servent de potentialisateurs immun....
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Protocole
1. Construction plasmidique
- Insérer l’ADN codant pour la séquence SpyCatcher (dossier supplémentaire 1) dans un plasmide pThioHisA-ClyA résistant à l’ampicilline (voir le tableau des matériaux) entre les sites BamH I et Sal I pour construire le plasmide pThioHisA ClyA-SC à la suite d’un rapport publié précédemment20.
- Licater le gène de fusion SpyTag-RBD-Histag synthétisé (fichier supplémentaire 1) dans un plasmide pcDNA3.1 (voir le tableau des matériaux) entre les sites BamH I et EcoR I pour construire le plasmide pcDNA3.1 RBD-ST à ....
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Résultats
L’organigramme de ce protocole est illustré à la figure 1. Ce protocole pourrait être une approche générale de l’utilisation des OMV comme plate-forme vaccinale; Il suffit de choisir les systèmes d’expression appropriés en fonction du type d’antigènes.
La figure 2 présente un schéma de conception plasmidique réalisable. Le gène SC est connecté au gène ClyA via un linker flexible, tandis que ST se connecte à la terminaison 5' du gène R.......
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Discussion
Pour créer une plate-forme vaccinale à nanoparticules « Plug-and-Display », ClyA fusionné SC a été exprimé dans les souches BL21 (DE3), qui est l’un des modèles les plus largement utilisés pour la production de protéines recombinantes en raison de ses avantages dans l’expression des protéines24, de sorte qu’il y aurait suffisamment de fragments SC affichés à la surface des OMV pendant le processus de prolifération bactérienne. Dans le même temps, un antigène cible fusionné ST a été préparé pour le.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le programme clé de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) et le projet de la Fondation nationale chinoise des sciences naturelles (n° 31670936, 82041045).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ampicilline sodique | Sangon Biotech | A610028 | |
| Compteur de cellules automatisé | Countstar | BioTech | |
| BCA kit de quantification des protéines | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Appareil d’électrophorèse | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Chèvre pAb à souris IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| Centrifugeuse de congélation à grande vitesse | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag souris mAb | Technologie de signalisation cellulaire | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | ||
| Isopropyl bêta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Lait écrémé en poudre | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 Milieu de culture cellulaire | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmide | Wuhan genecreat Technique | ||
| Tampon phosphate salin | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyéthylénimine Linéaire | Polysciences | 23966-1 | |
| Échelle protéique précolorée | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmide | Wuhan Genecreat technologie | ||
| PVDF Western Blot | Membranes Roche | ||
| Systèmes de paillasse Quixstand (colonne à fibres creuses de 100 kD) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Chlorure de sodium | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (solution de chimiluminescence améliorée) | Thermo | 34577 | |
| Instrument de suspension | Life Technology | Hula Mixer | |
| Microscope électronique à transmission | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | XPN-100 | |
| Spectrophotomètre ultraviolet | Hitachi | U-3900 | |
| Extrait de levure | Sangon Biotech | A610961 |
Références
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. ....
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Réimpressions et autorisations
