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Microscopie intravitale pour étudier les interactions plaquettes-leucocytes-endothéliales dans le foie de souris

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DOI :

10.3791/64239

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6 octobre 2022

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1Center for Translational Research on Inflammatory Diseases, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

La microscopie intravitale est un outil puissant qui permet de mieux comprendre les relations temporelles et spatiales des processus rapides et/ou séquentiels. Dans cet article, nous décrivons un protocole permettant d’évaluer à la fois les interactions protéine-protéine et les interactions plaquettes-neutrophiles-endothéliales dans les sinusoïdes hépatiques dans un modèle murin de septicémie expérimentale (endotoxémie).

Résumé

L’inflammation et la thrombose sont des processus complexes qui se produisent principalement dans la microcirculation. Bien que l’histologie standard puisse donner un aperçu de la voie finale de l’inflammation et de la thrombose, elle n’est pas en mesure de montrer les changements temporels qui se produisent tout au long de ces processus. La microscopie intravitale (MIV) est l’utilisation de l’imagerie d’animaux vivants pour obtenir un aperçu temporel des processus physiologiques in vivo. Cette méthode est particulièrement puissante pour évaluer les interactions cellulaires et protéiques au sein de la circulation en raison des événements rapides et séquentiels qui sont souvent nécessaires pour que ces interactions se produisent. Bien que la MIV soit une méthodologie d’imagerie extrêmement puissante capable de visualiser des processus complexes in vivo, il existe un certain nombre de facteurs méthodologiques qui sont importants à prendre en compte lors de la planification d’une étude IVM. Cet article décrit le processus d’imagerie intravitale du foie, en identifiant les considérations importantes et les pièges potentiels qui peuvent survenir. Ainsi, cet article décrit l’utilisation de la MIV pour étudier les interactions plaquettes-leucocytes-endothéliales dans les sinusoïdes hépatiques afin d’étudier les contributions relatives de chacun dans différents modèles de lésions hépatiques aiguës.

Introduction

L’inflammation et la thrombose sont des processus complexes qui se produisent principalement dans la microcirculation. Ce protocole décrit la préparation chirurgicale qui permet l’imagerie de la microvascularisation hépatique in vivo. Bien que l’histologie standard puisse donner un aperçu des voies finales de l’inflammation et de la thrombose, elle ne peut pas montrer les changements temporels qui se produisent tout au long du processus. De plus, cette méthode est particulièrement puissante pour évaluer les interactions cellulaires et protéiques transitoires qui se produisent dans la circulation microvasculaire en raison de sa capacité à capturer, par vidéomicroscopie, les interactions souvent rapides et séquentielles qui se produisent au sein des systèmes biologiques. Cet article décrit l’utilisation de la microscopie intravitale pour étudier les interactions plaquettes-leucocytes-endothéliales dans les sinusoïdes hépatiques afin d’étudier la contribution relative de chacune dans différents modèles de lésions hépatiques aiguës.

Bien que cette préparation chirurgicale et cette modalité d’imagerie aient le potentiel d’être adaptées à une multitude de modèles inflammatoires et pathologiques, deux modèles d’inflammation vasculaire sont décrits ici : un modèle d’endotoxémie de septicémie murine et des lésions hépatiques induites par l’acétaminophène (APAP). L’injection d’endotoxine (lipopolysaccharide ; LPS) pour induire un modèle expérimental de sepsis murin a commencé dès les années 1930 avec son isolement et son exploration ultérieure en tant que molécule clé dans la progression du sepsis1. Bien que ce modèle soit limité dans la mesure où le LPS n’est qu’un seul composant des bactéries à Gram négatif, il s’agit d’une méthode largement acceptée et utilisée, relativement simple et rapide à mettre en œuvre. De plus, il reproduit rapidement et avec précision les manifestations physiologiques du sepsis1. Étant donné le rôle que joue l’absorption intestinale des endotoxines dans le développement des maladies et de l’inflammationdu foie 2, il s’agit d’un excellent modèle pour étudier les interactions plaquettes-leucocytes-endothéliales dans le foie de souris.

En plus d’un modèle LPS de septicémie, le surdosage APAP fournit un excellent modèle pour l’étude des interactions pathologiques cellule-cellule dans le foie. Un surdosage d’APAP peut entraîner une insuffisance hépatique aiguë, marquée par une thrombocytopénie et une accumulation de plaquettes dans le foie, bloquant par la suite la récupération hépatique médiée par les leucocytes3. Bien que la méthodologie de préparation chirurgicale et d’imagerie de ce modèle puisse être adaptée à un certain nombre de questions biologiques et à l’étude de divers processus pathologiques, le modèle LPS de la septicémie et les lésions hépatiques induites par l’APAP sont d’excellents modèles pour l’étude des interactions plaquettes-leucocytes-endothéliales in vivo.

La MIV présente certains avantages inhérents par rapport aux techniques histologiques standard. Bien que les méthodes histologiques standard permettent d’étudier des échantillons de tissus entiers ou sectionnés et d’apprécier les protéines et l’architecture tissulaire, ces méthodologies présentent des limites. De par leur conception, ces processus nécessitent un traitement tissulaire, ce qui a le potentiel de déformer ou de masquer ce que l’on trouve dans le système vivant. Les tissus doivent être fixés lors de la préparation histologique, ce qui présente un risque d’artefacts de fixation ou d’autofluorescence améliorée. La fixation peut également entraîner des changements intracellulaires dans les tissus, et le potentiel d’une fixation inadéquate peut entraîner une dégradation des tissus. De plus, les méthodes histologiques n’ont pas le potentiel d’étudier directement les aspects temporels des interactions protéiques ou cellulaires et ont le potentiel de manquer des interactions éphémères ou peu fréquentes.

À l’inverse, la microscopie intravitale à fluorescence permet d’éviter de nombreuses complications et limitations inhérentes à l’histologie standard. L’IVM évite la fixation et, par conséquent, les artefacts ou la dégradation des tissus qui peuvent se produire lors de la préparation histologique. De par sa conception, il permet également l’imagerie des tissus du système biologique vivant et, en tant que tel, l’isolement et la section des tissus ne sont pas nécessaires. De plus, il permet l’imagerie et l’étude de processus transitoires ou peu fréquents, qui peuvent être difficiles ou impossibles à capturer à l’aide de l’histologie. Cette méthode IVM peut également être utilisée pour capturer et identifier les processus séquentiels (par exemple, les interactions initiées par les plaquettes ou les leucocytes entraînant des agrégats plaquettaires-leucocytaires liés à l’endothélium vasculaire). Enfin, cette méthode peut être adaptée à une multitude de systèmes d’imagerie. En fonction des besoins de l’étude et de l’ensemble de données souhaité, après la préparation chirurgicale, le foie extériorisé peut être placé sur presque tous les systèmes d’imagerie souhaités. Nous avons appliqué avec succès ce protocole à l’imagerie à l’aide de la microscopie à fluorescence à champ large, de la microscopie à disque rotatif, de la microscopie confocale à balayage laser à l’aide d’un scanner à tête de résonance, ainsi qu’à la microscopie à deux photons. Cependant, il n’y a aucune raison de croire que cette méthode devrait être limitée aux systèmes de microscopie susmentionnés.

Cet article décrit un protocole de MIV, qui a été utilisé précédemment pour étudier les interactions plaquettes-leucocytes-endothéliales dans le foie de souris. Ce protocole a été utilisé pour comparer l’adhésion plaquettaire temporelle et endothéliale des plaquettes, soit marquées avec des anticorps conjugués par fluorescence, soit génétiquement modifiées pour la fluorescence endogène4. Ce protocole a été utilisé pour évaluer les interactions transitoires plaquettes-leucocytes-endothéliales dans les sinusoïdes hépatiques dans un modèle endotoxémique d’inflammation hépatique et pour co-localiser la P-sélectine et la protéine recombinante. De plus, ce protocole a permis de déterminer si les différences observées dans la densité des neutrophiles à l’aide de l’histologie standard étaient le résultat de différences dans les vitesses des globules rouges (comme substitut du débit volumétrique)5. Enfin, cette méthode a été utilisée pour évaluer le recrutement plaquettaire par les cellules de Kupffer dans les sinusoïdes hépatiques dans un modèle aigu de lésions hépatiques induites par l’APAP6. Cet ensemble de travaux n’aurait pas été possible avec les méthodes histologiques standard. Comme indiqué, ce protocole peut être adapté à une variété de systèmes d’imagerie et, avec une préparation chirurgicale appropriée, un choix d’anticorps fluorescents et des paramètres d’imagerie, ce protocole est très fiable et reproductible pour l’étude de la pathologie hépatique.

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Protocole

Tous les protocoles pour les animaux ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine et le comité de recherche et développement du Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center. Toutes les expériences sont terminales, l’euthanasie étant réalisée à la fin sous anesthésie chirurgicale. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des anticorps et des colorants

  1. Sélection des anticorps et des colorants
    REMARQUE : Le nombre de couleurs simultanées observées dépendra de la configuration spécifique du microscope. Dans le système utilisé ici, quatre longueurs d’onde différentes peuvent être visualisées simultanément.
    1. Visualisation des navires :
      1. D’après le plan expérimental, étiqueter le système vasculaire avec un anticorps spécifique de l’endothélium (p. ex., CD31) et/ou une molécule uniformément distribuée dans le plasma (p. ex., dextran ou albumine).
        REMARQUE : Cet article décrit l’utilisation du dextran étiqueté Texas Red (150 kDa ; 250 μg/souris). L’avantage de cette protéine de gros poids moléculaire réside dans sa capacité à rester dans le système vasculaire pendant l’inflammation aiguë. Lors de l’utilisation du marquage des anticorps, il faut veiller à éviter les anticorps susceptibles d’interférer avec la fonction endothéliale.
    2. Visualisation des plaquettes :
      1. Pour identifier les plaquettes, utilisez soit des souris génétiquement modifiées (par exemple, R26R-EYFPf/f/PF4-Cre), soit des anticorps spécifiques aux plaquettes (par exemple, anti-GPIbβ) pour la MIV. Pour des informations détaillées sur l’utilisation de l’étiquetage fluorescent des plaquettes, reportez-vous à une publication précédente4.
        REMARQUE : Ici, des anticorps anti-GPIbβ marqués DyLight488 (X488 ; 6 μg/souris) sont utilisés. Des précautions doivent être prises lors de l’utilisation du marquage des anticorps pour éviter d’interférer avec la fonction plaquettaire ou l’adhésion.
    3. Visualisation des leucocytes :
      1. De la même manière que pour l’imagerie plaquettaire, visualisez les leucocytes d’intérêt avec des souris génétiquement modifiées (par exemple, LysM-EGFP pour les granulocytes) ou des anticorps spécifiques des leucocytes (par exemple, Ly6G pour les neutrophiles murins). Pour suivre ce protocole, utilisez des anticorps anti-Ly6G marqués au Brilliant Violet 421 (BV421) (3 μg/souris). Dans les expériences de toxicité aiguë (<6 h), marquer les neutrophiles avec 3 μg d’anti-Ly6G (clone 1A8) par animal.
        REMARQUE : Lors de l’utilisation d’un anticorps anti-Ly6G (clone 1A8), il convient de noter que cet anticorps a été utilisé pour épuiser les neutrophiles (anticorps 0,05-1 mg/souris)7-9 après au moins 24 h et/ou avec des injections répétées. Il a également été rapporté que les anticorps anti-Ly6G (1A8) affectent l’adhésion et la transmigration des neutrophiles à une contrainte de cisaillement élevée (mais pas faible) dans certaines situations, mais pas toutes 9,10. Par conséquent, la posologie de l’anticorps doit être choisie avec soin pour chaque cas.
    4. Protéines supplémentaires :
      1. En fonction du nombre de lasers et d’ensembles de filtres/détecteurs disponibles sur un système d’imagerie particulier, ajoutez plus de longueurs d’onde pour identifier plus d’objets simultanément tout en prenant soin d’éviter le chevauchement spectral.
        REMARQUE : Ce protocole décrit l’imagerie d’un 4e objet, la P-sélectine (clone Psel.KO2.3), à l’aide d’un anticorps anti-P-sélectine marqué au PerCP-eFluor 710 (4 μg/souris). Bien que la majorité des descriptions et des images de cet article concernent des lésions hépatiques aiguës induites par le LPS, d’autres modèles de lésions peuvent être intéressants et nécessiter d’autres étiquettes. Voir la discussion pour une description des anticorps utilisés pour les lésions induites par l’APAP6.
  2. Élimination des conservateurs et stérilisation
    REMARQUE : Bien qu’il existe des anticorps et des colorants disponibles dans le commerce prêts à être injectés chez les animaux, la plupart d’entre eux contiennent des vecteurs ou des agents de conservation (p. ex., l’azoture de sodium) qui peuvent être nocifs pour les animaux ou ajouter des variables confondantes. Les anticorps et les colorants contenant des vecteurs ou des agents de conservation doivent être dialysés contre la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium ni magnésium (DPBS-/- ; ou autres tampons physiologiques).
    1. Versez 500 mL de DPBS-/- (volume de ~1 000 fois de l’anticorps ou du colorant à dialyser) dans un bécher à l’aide d’une barre d’agitation magnétique. Fixez une cassette de 7 000 MWCO à une bouée flottante et placez-la dans le tampon de dialyse pendant au moins 5 minutes pour préconditionner la membrane. Retirez la cassette et épongez les bords en plastique avec un chiffon non pelucheux. Évitez de toucher la membrane de dialyse.
    2. Injectez l’anticorps/colorant dans la cassette par l’un des quatre ports à l’aide d’une aiguille de 18-20 G. Placez la cassette contenant l’anticorps/colorant dans le tampon de dialyse. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et dialysez pendant au moins 1 h à 4 °C. Changez le tampon de dialyse.
    3. Répétez la dialyse et le changement du tampon de dialyse à l’étape 1.2.2 pendant au moins deux fois de plus (au moins trois échanges).
    4. Retirez la cassette et épongez les bords en plastique avec un chiffon non pelucheux. Évitez de toucher la membrane de dialyse. Aspirez l’anticorps/colorant de la cassette à travers un port inutilisé à l’aide d’une aiguille 18-20 G.
    5. Dans une hotte de culture tissulaire, stériliser les préparations à l’aide d’un filtre de 0,2 μm avant de les utiliser chez les animaux. Conserver les portions non utilisées dans des tubes stériles à 4 °C.
  3. Contrôles
    1. Bien que les contrôles exacts nécessaires pour chaque expérience varient en fonction de la conception de l’étude, assurez-vous d’inclure des cohortes fictives appropriées, des groupes traités avec et sans véhicule, ainsi que des contrôles isotypiques afin d’exclure l’étiquetage non spécifique et les effets biologiques lors de l’analyse des résultats de l’étude.

2. Injection intrapéritonéale d’endotoxines

REMARQUE : Pour évaluer les interactions plaquettes-neutrophiles-endothéliales dans les sinusoïdes hépatiques dans un modèle expérimental de septicémie murine, l’injection d’endotoxines peut être utilisée.

  1. Pesez les souris pour déterminer la quantité d’endotoxine à injecter (5 mg/kg ; Escherichia coli sérotype O111 :B4 ; teneur en endotoxines 1 x 106 EU/mg).
    REMARQUE : La puissance et l’effet des endotoxines dépendent de l’espèce et de la souche et peuvent varier d’un lot à l’autredu lot 11. Par conséquent, pour maximiser la cohérence des résultats, les expériences doivent être menées avec le même lot d’endotoxine12.
  2. Prélevez l’endotoxine diluée avec une solution saline normale (chlorure de sodium à 0,9 %) dans une seringue munie d’une aiguille de 27 G. Dans la main non dominante, tenez la souris par la peau à l’aide du pouce et de l’index. À l’aide de l’autre main, mettez une traction sur la queue pour exposer l’abdomen et placez la queue entre le cinquième doigt et la paume de la main non dominante.
  3. Nettoyez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Insérez l’aiguille dans la partie inférieure gauche (ou droite) de l’abdomen et injectez l’endotoxine.
    REMARQUE : Il faut prendre soin d’éviter d’insérer l’aiguille trop profondément car il existe un risque de lésions organiques qui pourraient perturber les expériences (par exemple, des lésions aux intestins, à l’intestin, aux reins, etc.).
  4. Effectuez les étapes 2.1 à 2.3 chez les animaux témoins utilisant une solution saline normale (ou un véhicule).
    REMARQUE : Les lésions hépatiques induites par l’APAP peuvent être réalisées en utilisant une méthodologie similaire à celle ci-dessus, en utilisant l’APAP plutôt que l’endotoxine6. Voir la discussion pour plus de détails sur le modèle des lésions hépatiques induites par l’APAP.

3. Induction et maintien de l’anesthésie des animaux et euthanasie

  1. Placez les animaux sous un plan chirurgical d’anesthésie. Maintenez l’anesthésie à l’aide d’isoflurane inhalé via un cône de nez ou une canule de trachéotomie. Évaluez et ajustez le niveau d’anesthésie en surveillant les mouvements après un pincement des orteils.
  2. Pratiquer l’euthanasie à la fin de toutes les expériences par exsanguination sous anesthésie chirurgicale suivie de pneumopathies bilatérales.

4. Cathétérisme de la veine jugulaire et de la trachée

  1. Effectuer une trachéotomie pour faciliter la respiration et la mise en place de cathéters vasculaires pour l’injection d’anticorps/colorants marqués.
    REMARQUE : Un microscope de dissection chirurgicale ou des loupes sont utiles pour le cathétérisme.
  2. Rasez la fourrure du cou et de l’abdomen ; Enlever l’excédent de poils. Placez l’animal sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 °C, à l’aide d’une sonde rectale pour surveiller la température centrale. Frottez le cou avec de la bétadine suivie de 70 % d’éthanol.
  3. Faites une incision verticale médiane dans le cou et exposez la trachée à l’aide d’un curage émoussé.
    1. Trachéotomie
      1. Préparez une sonde de trachéotomie PE90 avec une aiguille émoussée de 21 G insérée (Figure 1A).
        REMARQUE : L’ajout d’un biseau de ~45° à l’extrémité de la canule de trachéotomie peut aider à faciliter son insertion dans la trachée. Alternativement, un cathéter intraveineux périphérique de 18-20 G peut également être substitué à la tubulure PE90.
      2. Une fois que la peau et le fascia sont incisés, réfléchissez les glandes salivaires loin du centre.
      3. À l’aide d’une dissection émoussée, séparez le muscle sternothyroïdien pour donner un meilleur accès à la trachée.
        REMARQUE : Veillez à éviter les vaisseaux d’alimentation et les artères carotides adjacentes à la trachée.
      4. Faites une petite incision horizontale (~1-2 mm) entre les anneaux trachéaux sur la face ventrale/antérieure de la trachée (Figure 1B).
        REMARQUE : L’utilisation de ciseaux Vannas facilitera une dissection correcte. S’assurer que seule la face antérieure de la trachée est incisée ; La section complète de la trachée rendra difficile la canulation de la trachée et risque d’endommager les structures vasculaires voisines.
      5. Passez un tube de trachéotomie dans le trou. Assurez-vous que l’extrémité du tube n’est pas insérée au-delà de la carène.
      6. Fixez le tube de trachéotomie à l’intérieur de la trachée en attachant une suture en soie #4-0 autour de la trachée et du tube, en utilisant les anneaux trachéaux comme support (Figure 1C).
    2. Canulation jugulaire externe
      1. Préparez un cathéter jugulaire (Figure 2) à l’aide d’un tube PE50 (OD 0,97 mm, ID 0,58 mm) avec un tube PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) inséré à une extrémité (Figure 2 encadré) et une aiguille émoussée de 22 G ou 23 G insérée dans l’autre. Utilisez un adhésif pour vous assurer que le tube ne glisse pas ou ne fuit pas. Fixez une seringue remplie de solution saline normale stérile pour rincer le cathéter.
      2. Exposez la veine jugulaire externe (EJV) après réflexion des glandes salivaires. À l’aide d’une dissection émoussée, libérez l’EJV du tissu conjonctif environnant (Figure 3A).
      3. À l’aide de sutures en soie #4-0, ligaturez l’extrémité crânienne de l’EJV visualisé et placez une boucle lâche autour de l’extrémité caudale de l’EJV (Figure 3B). Serrez les extrémités de chaque suture avec des hémostats et rétractez doucement les deux hémostats l’un de l’autre pour aider à exposer l’EJV.
        REMARQUE : La région optimale pour la canulation se situe entre les branches de la veine jugulaire antérieure crânienne et la veine jugulaire interne caudalement. Pour faciliter la mise en place de la suture, pliez un morceau (~15 cm) de suture en deux et passez l’extrémité pliée sous l’EJV avec une paire de pinces tout en soulevant l’EJV avec une paire de pinces séparée pour éviter le roulement du vaisseau. Ensuite, coupez la suture pour faire deux longueurs distinctes.
      4. À l’aide de ciseaux Vannas, faites une petite incision (~1 mm) dans la surface antérieure de l’EJV. Insérez une aiguille émoussée de 30 G pliée (augmentée d’une goupille minutien de 0,15 mm limée émoussée et insérée dans la pointe de l’aiguille) dans l’EJV à travers l’incision et soulevez-la doucement pour faciliter le passage du cathéter contenant une solution saline normale dans l’EJV.
        REMARQUE : Assurez-vous que le cathéter et le moyeu n’ont pas de bulles d’air avant de l’insérer et de rincer dans la souris. Une embolie gazeuse peut être mortelle pour l’animal.
      5. Une fois que le cathéter est à l’intérieur de l’EJV, desserrez l’anse caudale juste assez pour permettre le passage du cathéter plus profondément dans la veine. Vérifiez l’emplacement du cathéter en aspirant du sang et en rinçant le cathéter pour vérifier s’il y a des fuites (Figure 3C).
      6. À l’aide de la boucle caudale, fixez le cathéter à l’intérieur de l’EJV. À l’aide de la suture crânienne, fixez le cathéter à l’extrémité crânienne de l’EJV afin de minimiser la décanulation accidentelle (Figure 3D).
      7. Fermez l’incision cutanée du cou avec une suture en soie #4-0.

5. Extériorisation du foie

  1. Nettoyez l’abdomen avec un gommage à la bétadine suivi d’éthanol à 70 %.
  2. Faites une incision verticale de ~1 cm dans la peau de la partie supérieure de l’abdomen en commençant à la base du sternum. À l’aide d’une dissection émoussée, séparez la peau des muscles abdominaux. Cautériser les gros vaisseaux d’alimentation de la peau et des muscles pour minimiser les saignements lors des étapes suivantes (Figure 4A).
  3. Faites une incision horizontale de ~1-2 cm de la peau suivie du muscle abdominal, en coupant en deux l’incision verticale à l’étape 5.2 approximativement au sommet du foie visible ; utiliser un outil de cautérisation pour aider à l’hémostase de la peau (figure 4B).
    REMARQUE : La taille de l’incision abdominale est essentielle pour une imagerie optimale du foie. Si l’ouverture est trop petite, il existe un risque d’ischémie hépatique due à un étirement excessif ou à un conflit de l’artère hépatique et/ou de la veine porte. Si l’ouverture est trop grande, d’autres organes, tels que les intestins, peuvent également être extériorisés et interférer avec l’imagerie.
  4. Découpez un cercle d’environ 1 cm au centre d’une gaze de 2 po x 2 po et humidifiez-le avec une solution saline normale chaude. Positionnez la gaze de manière à ce que l’ouverture soit centrée sur l’incision. Écartez doucement les bords de l’incision et appliquez une légère pression vers le haut sur l’abdomen pour extérioriser le foie afin que le foie repose facilement sur la gaze humidifiée (Figure 4C).
  5. Placez la souris sur le plateau d’imagerie en position couchée, le foie centré sur la lamelle (Figure 4D).
    REMARQUE : Chez un animal témoin, le foie doit apparaître marron. Un microscope confocal à balayage laser inversé avec un scanner à tête de résonance bidirectionnelle est utilisé pour la MIV dans ce protocole. Par conséquent, une imprimante 3D a été utilisée pour créer un plateau IVM personnalisé (Figure 5). Les fichiers .stl créés pour l’impression 3D sont fournis (Fichier supplémentaire 1) ; Des ajustements peuvent être nécessaires pour répondre aux besoins des individus.
  6. Transférez l’animal dans le microscope inversé.

6. Imagerie par microscopie intravitale du foie

REMARQUE : Ce protocole utilise un microscope confocal à balayage laser avec un scanner à tête de résonance bidirectionnelle pour la microscopie intravitale. Pour stabiliser la fréquence de la tête de résonance, allumez le système pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie. Différents systèmes peuvent avoir des capacités différentes. La discussion de ceux-ci sort du cadre de cet article. Contactez les représentants de l’équipement pour les détails techniques de systèmes spécifiques.

  1. Pour maintenir un plan chirurgical d’anesthésie, connectez l’animal au système d’administration d’isoflurane.
    REMARQUE : Selon le protocole expérimental, une ventilation mécanique peut être nécessaire (par opposition à la ventilation spontanée).
  2. Placez un coussin chauffant radiant sur l’animal, à l’aide de la sonde rectale, pour maintenir une température centrale de 37 °C.
    REMARQUE : Dans ce protocole, un morceau de mousse rectangulaire qui s’adapte autour du plateau IVM agit comme un isolant et une entretoise sur laquelle placer le coussin chauffant radiant (Figure 4D).
  3. Réglez la tourelle de l’objectif sur le grossissement souhaité, en appliquant de l’huile d’immersion si nécessaire. Pour suivre ce protocole, utilisez l’objectif à huile de silicone 60x/NA1.30 avec zoom optique 1x.
  4. Une fois le plan focal identifié, identifiez ≥ 10 champs de vision aléatoires, en évitant les zones proches des bords du foie.
    REMARQUE : Comme le foie présente une autofluorescence dans le canal isothiocyanate de fluorescéine (FITC), utilisez l’épifluorescence pour identifier rapidement le plan focal général.
    1. Selon le système, identifiez les bords du foie visible à l’aide de l’épifluorescence dans le canal FITC et enregistrez les coordonnées de l’étage (x,y).
    2. Utilisez les limites (x,y) du foie et un générateur de nombres aléatoires pour identifier les coordonnées aléatoires (x,y). Pour un champ de vision acceptable, il faut rechercher a) la présence de navires dispersés dans tout le champ de vision ; b) ≥80 % des récipients dans le même plan focal ; et (c) ≥1 champ de vision à l’écart de tout bord du foie (exemple à la figure 6). Si l’analyse d’images se concentre sur les interactions plaquettes-leucocytes-endothéliales dans les sinusoïdes hépatiques, excluez les champs avec des vaisseaux dont le diamètre est de ≥15 μm (les sinusoïdes murines ont généralement un diamètre de ≤10 μm).

7. Analyse d’images

REMARQUE : ImageJ/FIJI a été utilisé pour traiter toutes les images de ce document. FIJI (fiji.sc) est une version open-source d’Image J (imagej.nih.gov) qui offre plus de fonctionnalités grâce à l’utilisation de plugins et de macros supplémentaires13.

  1. Ouvrez les fichiers multicanaux en accéléré dans ImageJ/FIJI.
    REMARQUE : Selon la plate-forme, des programmes/plugins supplémentaires peuvent être nécessaires. ImageJ/FIJI dispose d’un importateur de bio-formats qui peut ouvrir plusieurs types de fichiers différents, tels que les fichiers .oir d’Olympus. Ici, les fichiers ont été convertis en .tif car il s’agit d’un format plus largement utilisé.
  2. Assurez-vous que l’échelle correcte est réglée ; Recherchez le rapport pixel/μm et l’intervalle de temps dans les métadonnées/propriétés.
  3. Utilisez différents filtres pour supprimer le bruit de fond (par exemple, un filtre médian avec un rayon de 2 pixels utilisé dans ce protocole). Assurez-vous que le traitement est similaire entre toutes les images afin de minimiser les variations lors du post-traitement. Comme les comptages et les longueurs sont comparés dans ces expériences, au lieu de l’intensité moyenne de fluorescence, filtrez pour améliorer la clarté et l’identification et la mesure des interactions cellule-cellule.
    REMARQUE : L’utilisation et l’amplitude des filtres dépendront de la taille de la ou des cibles d’intérêt et du rapport signal/bruit dans les images.
  4. Comme il existe une hétérogénéité entre les champs de vision dans la densité vasculaire, mesurez la surface vasculaire totale dans chaque champ à l’aide du pinceau de sélection (Figure 7).
    1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’outil de sélection ovale et choisissez l’outil Pinceau de sélection .
    2. Ajustez la taille du pinceau en double-cliquant sur l’icône de l’outil de sélection .
    3. Tracez sur les récipients pour les mettre en évidence/les sélectionner. Pour supprimer des parties de la sélection, utilisez [ alt]-clic gauche et ajoutez des parties à l’aide de [shift]-clic gauche.
    4. Appuyez sur [M] pour mesurer la zone sélectionnée.
      REMARQUE : Si l’échelle de l’image a été correctement réglée, la sortie doit être en μm2, qui est converti en mm2.
  5. Comptez le nombre de plaquettes et de leucocytes dans le champ. Considérez les cellules comme des cellules adhérentes si elles se sont déplacées <1 corps cellulaire pendant 30 s. Calculer le nombre de cellules (plaquettes et/ou leucocytes) parmm2.
  6. Pour estimer le débit sanguin relatif à l’intérieur de chaque vaisseau, mesurez la vitesse moyenne des globules rouges (GR) en tant que substitut à l’aide du plug-in MTrackJ dans ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)14, comme décrit précédemment5. Identifiez les globules rouges comme des défauts de remplissage ronds ou en forme de disque dans le canal dextran. Enregistrez les traces pour la tenue de registres, l’analyse asynchrone et la vérification.
    REMARQUE : La figure 8 et la vidéo supplémentaire S1 en sont un exemple.

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Résultats

Évaluation de l’effet du domaine bâtonnet de la vimentine dans l’adhésion des leucocytes à l’endothélium enflammé
La liaison de la glycoprotéine P-sélectine ligand-1 de leucocytes (PSGL-1) à la P-sélectine endothéliale et plaquettaire se produit pendant la phase aiguë de l’inflammation hépatique induite par la septicémie. Cependant, il a été démontré que le domaine bâtonnet humain recombinant de la vimentine (rhRod) se lie à la P-sélectine et bloque l’adhésion des leucocytes à l’endothélium et aux pla...

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Discussion

L’objectif de cet article sur les méthodes est de décrire les étapes nécessaires pour capturer de manière fiable des images et des vidéos intravitales à haute résolution du foie de souris dans des conditions homéostatiques et après l’administration d’endotoxine ou d’APAP. Bien que ce protocole ait permis de produire de manière cohérente des données sur les interactions plaquettes-leucocytes-endothéliales dans le foie, il existe un certain nombre d’étapes critiques nécessaires au succès, ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Le contenu ne représente pas les opinions du ministère américain des Anciens combattants ou du gouvernement des États-Unis.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) et NIH/NHLBI HL139425 (JC). Le soutien à la recherche a également été financé par le NIH/NHLBI HL116524.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Surgical Supplies
2 » x 2 » éponges non tisséesMcKesson Med. Surg92242000Pour l’isolation du foie
#4-0 suture tressée en soie avec aiguilleSOFSILKN/A4-0 Softsilk coated tressed noir, non résorbable : C-1 aiguille coupante
#4-0 suture tressée en soie sans aiguilleEthiconN/A4-0 Soie tressée noire, aiguille émoussée non résorbable
de 21 G (0,5 pouce)SAI Infusion TechnologiesB21-50Ceci est utilisé pour fixer à l’extrémité du tube de trachéotomie pour permettre la connexion au ventilateur. Une autre source est
l’aiguille émoussée Instech 23 G (0,5 pouce)SAI Infusion TechnologiesB23-50Ceci est utilisé pour le cathéter vasculaire afin de permettre la connexion à une seringue. Une autre source est Instech
Dissecting Scissors (Pointed Tip)Kent ScientificINS600393-GMicro Dissecting Scissors ; Lames en carbure ; Droit; Pointes acérées ; Longueur de lame de 24 mm ; 4 1/2" Longueur totale
McPherson-Vannas Micro-ciseaux (Vannas)Kent ScientificINS600124Ceux-ci sont utiles pour créer les ouvertures dans la trachée et les vaisseaux
Tube en polyéthylène 10InstechBTPE-10Ceci est utilisé pour fabriquer la partie intravasculaire du cathéter. Une autre source est le
tube en polyéthylèneInstechBTPE-50Il est utilisé pour fabriquer la partie extravasculaire du cathéter. Une autre source est le
tube en polyéthylèneInstechBTPE-90Ceci est utilisé pour fabriquer le tube de trachéotomie. Une autre source est BD Intramedic
Sterile normalsaline Coviden8881570121Hospira 0,0 % Sodium Chloride Injection, USP
Microscopy Supplies
Isoflurane delivery system and ventilatorKent ScientificSomnosuiteCombinaison de ventilateur pour rongeurs et d’anesthésique volatil
Entretoise en mousse pour coussin chauffant pendant la microscopieN/AN/ACette entretoise doit être découpée dans de la mousse de haute qualité, doit s’adapter autour du plateau du microscope hépatique et les dimensions spécifiques de la hauteur dépendent du système de microscope
Système de microscope confocal à balayage laser avec scanner de tête de résonanceOlympusFV3000Bien que nous décrivions l’utilisation d’un Olympus FV3000 à l’aide d’un scanner à tête de résonance, ce protocole fonctionne avec la plupart des systèmes d’imagerie
Plateau de microscopeN/AN/ALe plateau de microscope hépatique a été conçu pour un microscope inversé
Anticorps & Réactifs associés
Brilliant Violet 421/anticorps anti-souris Ly6GBioLegend1276283 µ ; g/souris. Pour le marquage des neutrophiles
BV421/F4/80, l’anticorpsBioLegend1231320,75 mg/kg. Pour marquer les cellules de Kupffer
, solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium ni magnésiumGibco/ThermoFisher Scientific14190144Utilisé comme dialysat pour éliminer l’azoture de sodium des anticorps
DyLight649/anti-GPIb&beta ;anticorps emfret AnalyticsX6493 µ ; g/souris. Pour l’étiquetage des plaquettes
DyLight488/anti-souris GPIb&beta ;anticorps emfret AnalyticsX4886 µ ; g/souris. Pour l’étiquetage des plaquettes
Endotoxine de Escherichia coli sérotype O111 :B4Sigma-AldrichL30245 mg/kg ; La puissance de l’endotoxine peut varier d’un lot à l’autre. Par conséquent, le même lot doit être utilisé pour une série d’expériences afin de minimiser les variations dues au lot d’endotoxines
PerCP-eFluor 710/anti-souris P-sélectineanticorps Invitrogen46-0626-824 µ ; g/souris. Pour marquer P-selectin
Slide-a-Lyzer 7 000 MWCOcassette Thermo Scientific66370Utilisé pour dialyser les anticorps afin d’éliminer l’azoture de sodium
Texas Dextran marqué rougeSigma-AldrichT1287~150 kDa ; 250 µ ; g/souris
TRITC/albumine sérique bovineSigma-AldrichA2289500 µ ; g/souris. Diluer à une concentration de 50 mg/mL (5 %) dans une solution saline normale. Utilisé pour étiqueter le système vasculaire. Il peut s’infiltrer dans l’espace interstitiel plus facilement que le dextran de haut poids moléculaire pendant l’inflammation
BD Intramedic 50 BD Intramedic 90 hépatique

Références

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  2. Nolan, J. P. The role of intestinal endotoxin in liver injury: A long and evolving history. Hepatology. 52 (5), 1829-1835 (2010).
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Mots-clés

Interactions plaquettes leucocytessinuso des h patiquesl sion h patique aiguimagerie animale in vivoinflammation de la microcirculationmod les de thromboseimagerie in vivo
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