Method Article

Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude présente une procédure détaillée pour effectuer des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) sur des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en utilisant un marquage spécifique au site via l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA). Le protocole fournit un guide étape par étape pour la préparation des échantillons smFRET, les expériences et l’analyse des données.

Abstract

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La capacité des cellules à répondre aux signaux externes est essentielle au développement, à la croissance et à la survie cellulaires. Pour répondre à un signal de l’environnement, une cellule doit être capable de le reconnaître et de le traiter. Cette tâche repose principalement sur la fonction des récepteurs membranaires, dont le rôle est de convertir les signaux dans le langage biochimique de la cellule. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines réceptrices membranaires chez l’homme. Parmi les RCPG, les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) sont une sous-classe unique qui fonctionne comme dimères obligatoires et possède un grand domaine extracellulaire qui contient le site de liaison au ligand. Les progrès récents dans les études structurelles des mGluR ont amélioré la compréhension de leur processus d’activation. Cependant, la propagation de changements conformationnels à grande échelle par mGluR pendant l’activation et la modulation est mal comprise. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) est une technique puissante pour visualiser et quantifier la dynamique structurelle des biomolécules au niveau de la protéine unique. Pour visualiser le processus dynamique d’activation de mGluR2, des capteurs conformationnels fluorescents basés sur l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) ont été développés qui ont permis le marquage des protéines spécifiques au site sans perturbation de la structure native des récepteurs. Le protocole décrit ici explique comment effectuer ces expériences, y compris la nouvelle approche d’étiquetage UAA, la préparation des échantillons et l’acquisition et l’analyse des données smFRET. Ces stratégies sont généralisables et peuvent être étendues pour étudier la dynamique conformationnelle d’une variété de protéines membranaires.

Introduction

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Le transfert d’informations à travers la membrane plasmique dépend fortement de la fonction des récepteurs membranaires1. La liaison du ligand à un récepteur entraîne un changement conformationnel et l’activation du récepteur. Ce processus est souvent de nature allostérique2. Avec plus de 800 membres, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires chez l’homme3. En raison de leur rôle dans presque tous les processus cellulaires, les RCPG sont devenus des cibles importantes pour le développement thérapeutique. Dans le modèle canonique de ....

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Protocol

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Le flux de travail global du protocole est décrit à la figure 1.

1. Préparation de la chambre d’échantillonnage

  1. Nettoyage des glissières et des lamelles de couverture
    NOTE: Ces étapes visent à nettoyer les surfaces des lames ainsi que les lames de recouvrement et à les préparer à l’aminosilanisation. Une exigence critique pour mener des expériences de fluorescence à molécule unique sur des molécules attachées à la surface est une surface passivée. La technique de passivation la plus fiable et la plus reproductible consiste à attacher de manière covalente des chaînes polymères inertes à la surfa....

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Results

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Expression et marquage fluorescent d’un capteur FRET à base de SAU
Ici, des résultats exemplaires de l’insertion et du marquage fluorescent d’un SAU (AZP) dans le CRD de mGluR2 (548UAA) sont discutés11. Comme mentionné précédemment, pour insérer AZP dans mGluR2, la co-expression de la machinerie translationnelle modifiée, qui comprend une synthétase d’ARNt modifiée et un ARNt complémentaire (pIRE4-Azi), et mGluR2 contenant un codon ambre en position 548, créé par mutagénèse, es.......

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Discussion

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Les RCPG sont des protéines qui agissent sur la membrane cellulaire pour initier la transduction du signal. De nombreux RCPG se composent de plusieurs domaines, la signalisation dépendant de l’interaction coopérative entre les domaines. Pour moduler les propriétés de ces récepteurs membranaires, il est essentiel de comprendre le comportement dynamique des multiples domaines. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) est une technique de fluorescence qui permet de mesurer la conformat.......

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Disclosures

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgements

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Nous remercions les membres du laboratoire Reza Vafabakhsh pour leurs discussions. Ce travail a été soutenu par la subvention R01GM140272 des National Institutes of Health (à R.V.), par le Searle Leadership Fund for the Life Sciences de la Northwestern University et par le Chicago Biomedical Consortium avec le soutien des Searle Funds du Chicago Community Trust (à R.V.). B.W.L. a été soutenu par la subvention de formation T32GM-008061 du National Institute of General Medical Sciences (NIGMS).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-Sodium L-AscorbateSigma AldrichCat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanineChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021Construction transfectée
Acide acétiqueFisher Chemical64-19-7
AcétoneFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID :SCR_010279Logiciel, algorithme
Aminoguanidine (chlorhydrate)Cayman Chemical81530
AminosilaneAldrich919-30-2
Bain Sonicateur 2.8 LFisher ScientificBain à ultrasons 2.8 L
Biotin-PEGLaysan Bio IncArticle# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
de chimie de clicBTTES1237-500
Sulfate de cuivre (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
CouvercleVWR16004-306Chambre d’échantillonnage
Cy3 AlcyneClick Outils de chimieTA117-5
de chimieclic d’alcyneTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GMDétergent
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 MLDétergent avec cholectérol
Defined Fetal Bovin SerumThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635SemrockNotch filter
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDAndorDU-897UCaméra
ET542lpChromaFiltre d’émission passe-long
FF640-FDi01SemrockFiltre dichroïque d’émission
FLAG-tagAnticorps GenscriptA01429
Perle fluorescenteInvitrogen T7279Microsphères TetraSpeckPerle sphérique
Lames de verreFisherfinest12-544-4chambre d’échantillonnage
GlutamateSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Lignée cellulaire
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Séparateur d’imagesOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxiusCombinateur laser à 4 lignes
Lipofectamine 3000 Réactif de transfectionThermo Fisher ScientificL3000015Réactif de transfection
MéthanolFisher Chemical67-56-1
MicroscopeOlympusOlympus IX83
Milli-Q eauBarnsteadDéioniseur d’eau
m-PEGLaysan Bio IncArticle# MPEG-SIL-5000-1G
NF03-405/488/532/635SemrockMiroir dichroïque
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Sérum réduit Medium
OptiMEM/Sérum réduit ThermoFisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID :SCR_014212Logiciel d’analyse de données et de représentation graphique
Pénicilline-StreptomycineGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlasmide # 105829Construction transfectée
Poly-L-lysine hydrobromureSigma AldrichCat # P2636
Acide protocatéchuique (PCA)HWI group99-50-3
smCamera (Version 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera logiciel
Bicarbonate de sodiumFisherBioReagents144-55-8
Hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma1310-73-2
Filtre à seringueWhatman UNIFLOCat#9914-2502Filtration liquide
TroloxSigma53188-07
Outils Cy5 Outils de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, ....

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Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

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