Method Article

Développement et test de dipeptides nanostructurés méthylés qui inhibent l’activité de la kinase Src in vitro pour des applications anticancéreuses

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voici un protocole pour concevoir et tester des dipeptides capables d’inhiber l’activité de l’enzyme kinase Src à l’aide d’essais acellulaires et cellulaires pour des applications anticancéreuses. Les peptides formulés ici (W-RCH3, WCH3-R CH3 et W-R(CH3)2) ont inhibé la kinase Src avec des valeurs IC50 de 510 nM, 916 nM et 1 μM, respectivement.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, dans le but de développer un nouveau traitement anticancéreux, sept dipeptides contenant du tryptophane méthylé et/ou de l’arginine méthylée ont été conçus et ont été produits à l’aide de la synthèse peptidique en phase solide Fmoc. La surexpression de l’enzyme tyrosine kinase Src a été impliquée dans le développement de différents cancers. Il a déjà été démontré que les dipeptides contenant des acides aminés non naturels tels que l’arginine méthylée (RCH3), l’arginine diméthylée (R(CH3)2) et/ou les résidus de tryptophane méthylé (WCH3) inhibent la kinase Src. Dans cette étude, trois de ces dipeptides, W-RCH3, WCH3-R CH3 et W-R(CH3)2, ont été testés à l’aide d’essais acellulaires et se sont avérés avoir des valeurs de CI50 (la concentration à laquelle l’inhibition de 50 % se produit) de 510 nM, 916 nM et 1 μM, respectivement. Ces valeurs étaient comparables à celles obtenues pour les peptides cycliques penta- à nano-W-R ([W-R]5-[W-R]9) synthétisés dans des études précédentes. Cependant, les versions non méthylées des dipeptides n’ont montré aucune activité inhibitrice contre la kinase Src. Tous ces dipeptides (50 μM) n’ont montré aucune cytotoxicité après une incubation allant jusqu’à 72 h avec trois lignées cellulaires cancéreuses différentes, y compris la leucémie (CCRF-CEM), l’adénocarcinome du sein (MDA-MB-231) et l’adénocarcinome ovarien (SK-OV-3), indiquant la perméabilité limitée des peptides à travers la membrane cellulaire. Par conséquent, des études supplémentaires sont nécessaires pour améliorer la perméabilité de ces peptides pour des applications anticancéreuses, par exemple en utilisant un support peptidique ou une fonctionnalisation supplémentaire du peptide. En résumé, cette étude fournit un protocole pour synthétiser et tester des peptides qui inhibent l’activité de la kinase Src, et possèdent donc une capacité anticancéreuse prometteuse, comme démontré à l’aide de tests acellulaires et cellulaires.

Introduction

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Le cancer est causé par la croissance anormale de cellules normales et est l’une des maladies les plus mortelles dans le monde. Ces cellules anormales se propagent à différents organes du corps par un processus appelé métastase. La forme de cancer la plus courante est le cancer du sein, qui est survenu chez 2,26 millions de personnes en 2020. De plus, il y a eu environ 1,80 million de décès dus au cancer du poumon en 20201. Selon l’Organisation mondiale de la santé, environ 10 millions de personnes sont mortes du cancer en 20202. Les cellules cancéreuses diffèrent des cellules normales en ce qu’elles surexpriment certaines enzymes, telles que les protéines tyrosine kinases (PTK). L’Institut national du cancer définit les kinases comme des enzymes capables de phosphoryler d’autres protéines ou sucres3. La connaissance de la fonction régulatrice des kinases peut faciliter la conception de médicaments anticancéreux efficaces. Par exemple, les PTK catalysent la phosphorylation d’autres protéines ou sucres, et par conséquent, l’ATP est converti en ADP par la perte d’un groupe phosphate. Au total, 80 % des oncogènes et protooncogènes codent pour les PTK4. Les kinases Src sont une famille de tyrosine kinases non réceptrices, y compris Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes et Yrk, qui sont surexprimées dans les cellules cancéreuses, en particulier dans le cancer du sein 5,6. Les tyrosine kinases Src sont associées à la mitogénèse, à la différenciation, à l’activation des lymphocytes T et à la transformation cellulaire. Src aide à l’invasion des cellules cancéreuses et aux métastases en raison de sa capacité à réduire l’adhésion des cellules cancéreuses. Il existe cinq domaines différents dans la kinase Src, ordonnés des N- aux C-terminaux comme suit : le domaine des acides gras, le domaine d’homologie Src 3 (SH3), le domaine d’homologie Src 2 (SH2), le domaine de la tyrosine kinase (SH1) et le domaine régulateur C-terminal7.

figure-introduction-1
Figure 1 : Les domaines cibles de l’enzyme kinase Src, y compris un domaine SH3, un domaine SH2, un domaine kinase (SH1) et un court segment régulateur C-terminal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le domaine kinase SH1 est le plus souvent ciblé lors de la conception d’inhibiteurs de la kinase Src, car il contient deux sites conservés pour l’ATP et la liaison au substrat (Figure 1). Si la séquence d’acides aminés du domaine kinase est connue, le substrat peut également être utilisé comme cible pour concevoir un composé qui imite la liaison du substrat à la kinaseSrc 8. De plus, d’autres sites tels que les domaines SH3 et SH2 peuvent être utilisés comme cibles. Comparés à d’autres agents de chimiothérapie, les inhibiteurs de kinases présentent une toxicité moindre et une efficacité plus élevée9. En septembre 2021, il y avait 73 petites molécules qui agissent comme des inhibiteurs de kinases qui ont été approuvées par la FDA10. L’imatinib est un exemple de médicament anticancéreux qui inhibe sélectivement l’activité de la tyrosine kinase ; Cependant, certains patients sont résistants au médicament en raison de l’apparition d’une mutation ponctuelle dans le domaine kinase11. AstraZeneca a lancé le Saracatinib, un médicament qui inhibe la famille des tyrosine kinases Src avec une valeur IC50 (la concentration à laquelle l’inhibition de 50 %) se produit, de 2,7 nM, mais il a été écarté dans les essais de phase 212. Sur les 52 inhibiteurs de PTK approuvés par la FDA américaine au début de l’année 202013, seuls 28 ciblent les récepteurs PTK, 11 bloquent les PTK non récepteurs, 11 inhibent les protéines kinases protéine-sérine/thréonine et deux bloquent les protéines 1/213. L’intérêt croissant de la recherche en oncologie continuera d’alimenter la découverte d’inhibiteurs de kinases en tant que médicaments anticancéreux potentiels. Cependant, seules 50 des 500 protéines kinases ont été ciblées pour le traitement jusqu’à présent ; Par conséquent, un plus grand nombre de kinases devraient être étudiées pour le développement de médicaments dans un avenir proche14. De plus, il est nécessaire de découvrir des inhibiteurs de kinases pour explorer des mutations kinases encore non identifiées qui conduisent au cancer.

Ainsi, cette étude visait à développer des peptides qui pourraient être utilisés comme inhibiteurs de la famille Src et cibler le site de liaison à l’ATP en raison de sa capacité à servir de site conservé entre différentes kinases. À cette fin, une série de dipeptides contenant du tryptophane méthylé et/ou de l’arginine méthylée ont été synthétisés et testés pour leur capacité synergique à inhiber la kinase Src. Le cycle indole du tryptophane imite l’adénine de l’ATP et entre en compétition avec l’ATP en se liant au site de liaison à l’ATP. De plus, l’arginine méthylée dans le ligand est en compétition pour le domaine SH3 de Src. Les chercheurs ont montré qu’un polypeptide contenant de l’arginine déméthylée inhibe le domaine SH3, peut-être en raison d’une séquence conservée spécifique sur le motif de liaison SH3 (c’est-à-dire PXXP), qui a une affinité de liaison à un ligand contenant deux à trois résidus Arg dans le N-terminal ou un à deux résidus Arg sur le C-terminal des ligands15, 16 et 17. Le groupe guanidino d’Arg se lie au résidu Asp-99 conservé du domaine SH318,19, tandis que la partie restante de l’Arg se lie au Trp-118 conservé de l’enzyme, comme l’a confirmé l’analyse RMN et les structures cristallines de plusieurs domaines SH319. Ici, un protocole pour la synthèse de sept dipeptides méthylés et le test de leur capacité d’inhibition contre la kinase Src est présenté. De plus, la capacité de ces peptides à tuer plusieurs lignées cellulaires cancéreuses in vitro a été examinée.

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Protocol

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1. Synthèse de peptides

REMARQUE : La synthèse de W-R est décrite à titre d’exemple représentatif (Figure 2).

  1. Peser 566 mg (0,3 mmol) de résine H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl et l’ajouter dans le récipient de synthèse peptidique (voir le tableau des matériaux), conformément à la procédure utilisée par Mandal et al20. Effectuer la synthèse peptidique à l’aide de la stratégie bien établie de synthèse peptidique en phase solide (SPPS)21.
    REMARQUE : Les dipeptides méthylés ou diméthylés contenant des acides aminés non naturels ont été assemblés sur une résine d’amide de patinoire (capacité de charge de 0,3 mmol/g), tandis que les dipeptides contenant des acides aminés naturels ont été assemblés sur une résine à laquelle était attaché le premier acide aminé, comme la résine H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl (capacité de charge de 0,3 mmol/g). Il est important de noter que la résine d’amide de patinoire produit un peptide coiffé d’un C-terminal NH2.
  2. Faites gonfler la résine sèche pendant 1 h dans 5 mL de N,N-diméthylformamide (DMF) sous la pression de l’azote gazeux relié au récipient peptidique.
    REMARQUE : Effectuez l’ensemble du processus de synthèse dans une hotte. Des lunettes, des gants et une blouse de laboratoire doivent être portés tout au long de l’expérience. Une minuterie est également essentielle pour garder une trace entre les étapes d’ajout de réactifs chimiques.
  3. Éliminez l’excès de DMF à l’aide de la pression de l’azote gazeux reliée au récipient de synthèse du peptide tout au long du processus de synthèse.
  4. Peser 473,9 mg de Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 mmol) et 341 mg de 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU) (0,9 mmol) comme réactifs de couplage. Ajoutez les poudres dans un tube à essai et dissolvez-les dans 5 ml de DMF sec.
  5. Ajouter 313,4 μL (1,8 mmol) de N,N-diisopropyléthylamine (DIPEA) comme agent d’activation dans le tube à essai (étape 1.4) et mélanger en agitant le tube.
  6. Ajouter le contenu de l’éprouvette à la résine et laisser la réaction se dérouler pendant 1 h sous azote gazeux à température ambiante. Ensuite, égouttez l’excès de DMF à l’aide de la pression de l’azote gazeux et lavez la résine 3x avec du DMF.
  7. Déprotéger le Fmoc N-terminal à l’aide de 5 mL de pipéridine à 20 % dans du DMF (v/v) pendant 20 min sous azote gazeux. Lavez la résine 3 fois avec du DMF (3 x 5 mL).
  8. Séchez la résine en ajoutant 5 ml de dichlorométhane (DCM) et maintenez-la sous l’azote gazeux pendant 5 min, puis vidangez le DCM en utilisant la pression de l’azote gazeux. Ajouter 5 mL de méthanol sous azote gazeux pendant 5 min pour augmenter la siccité de la résine.
  9. Ajouter 10 ml d’un cocktail de clivage fraîchement préparé de TFA/thioanisole/dithiothreitol/anisole (90:3:5:2 v/v/w/v) pendant 2,5 h pour déprotéger toutes les chaînes latérales et séparer le dipeptide de la résine.
    ATTENTION : Le cocktail de clivage doit être ajouté dans un cylindre doseur en verre car le TFA est acide et dangereux ; Faites attention lorsque vous l’utilisez.
  10. Après 2,5 h, égoutter la solution réactionnelle du récipient peptidique en utilisant la pression de l’azote dans une fiole à fond rond. Ajouter 250 mL d’éther diéthylique froid (Et2O) dans la fiole à fond rond contenant le peptide brut pour précipiter le peptide.
  11. Filtrez le peptide précipité à l’aide d’un papier filtre dans un entonnoir conique avec un bras latéral relié à l’eau (de sorte que la filtration se produise en raison de la pression de l’eau), et collectez le précipité (les peptides) pour éliminer complètement l’éther. Le peptide brut précipite en 10 min.
  12. Purifier le peptide brut sur une colonne de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’un système de gradient. Utiliser un gradient de 0 % à 100 % d’acétonitrile contenant 0,1 % d’AGZ dans de l’eau contenant 0,1 % d’AGF pendant 30 à 60 minutes à un débit de 1 mL/min.

figure-protocol-1
Figure 2 : Synthèse peptidique en phase solide de W-R. Abréviations : HBTU = 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-hexafluorophosphate de tétraméthyluronium ; DIPEA = N,N-Diisopropyléthylamine ; TFA = acide trifluoroacétique ; DMF = diméthylformamide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Détermination de la toxicité cellulaire des peptides synthétisés

  1. Plaquez 2 000 cellules/puits de cellules SK-OV-3, 5 000 cellules/puits de cellules MDA-MB-231 ou 5 × 106 cellules/puits de cellules CCRF-CEM (dans un volume total de 100 μL/puits) dans une microplaque de 96 puits. Incuber les cellules dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2, 95 % d’air à 37 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent 75 %-80 % de confluence.
    REMARQUE : Le milieu RPMI-16 est utilisé pour la culture des cellules CCRF-CEM et du milieu essentiel minimum d’Eagle (EMEM) pour les lignées cellulaires MDA-MB-231 et SK-OV-3. Les deux milieux sont complétés par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (10 000 unités/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine dans 0,9 % de NaCl). Placez tous les milieux et suppléments dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes avant de commencer l’expérience. L’expérience doit être réalisée avec une cagoule de biosécurité, des gants et une blouse de laboratoire.
  2. Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette et ajoutez 100 μL du peptide 50 μM ou de la doxorubicine 10 μM (Dox) utilisée comme témoin positif en triple exemplaire dans des puits contenant les trois différents types de cellules cancéreuses plaquées dans la plaque à 96 puits. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant 72 h (dans les mêmes conditions que celles mentionnées à l’étape 2.1).
  3. Après 72 h, ajouter 20 μL de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium (MTS) dans la plaque à 96 puits. Enveloppez la plaque de papier d’aluminium et incubez la plaque pendant 1 à 4 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée.
    REMARQUE : MTS est un colorant utilisé pour visualiser des cellules vivantes (non traitées ou traitées avec les peptides), car seules les cellules vivantes convertissent le tétrazolium MTS en colorant formazan coloré qui peut être mesuré à 490 nm.
  4. Mesurer l’absorbance du produit formazan à 490 nm (A490) sur un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux). Inclure un milieu mélangé à du MTS comme blanc pour l’expérience. Utilisez de l’eau seule (car les peptides sont solubles dans l’eau) et du HCl 0,1 N (car leCH3 W a besoin de HCl pour se dissoudre) comme témoins négatifs.
  5. Mesurez le pourcentage de survie cellulaire à l’aide de l’équation suivante (Éq 1), à l’aide d’un tableur (voir Tableau des matériaux). La procédure est la même que celle utilisée par Mandal et coll.20.
    figure-protocol-2Égaliseur (1)

3. Dosage de l’activité kinase c-Src

REMARQUE : Le test d’activité kinase Src a été réalisé à l’aide d’un kit de test commercial (voir le tableau des matériaux) en trois exemplaires, conformément à la procédure de Chhikara et al.22. Utilisez WCH3 et RCH3 seuls comme témoins pour comparer l’effet de l’acide aminé méthylé seul sur la kinase et avec un autre acide aminé méthylé ou non méthylé.

  1. Dans une microplaque à fond rond noire non liante de faible volume de 384 puits, ajoutez 2,5 μL du cocktail réactionnel contenant 0,7 nM de son domaine kinase 6-Src dans un tampon de kinase, qui fait partie du kit de dosage, à 2,5 μL de peptides prédilués dissous dans 10 % de DMSO (concentration cible 4x). Incuber pendant 10 min à température ambiante à l’aide d’un agitateur de microplaques (5 tr/min) en suivant le protocole du fabricant.
    REMARQUE : Le cocktail réactionnel se compose du tampon kinase (200 mM HEPES, pH 7,5), du MgCl2 (16 mM), du DMSO (4 %), de l’EGTA (8 mM), du 2-mercaptoéthanol (43 mM) et du Brij-35 (0,04 %). Le substrat optimal de la réaction kinase de cette expérience est (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Ajouter 5 μL du cocktail ATP/substrat (40 μM/600 μM) dans la plaque et incuber pendant 30 min sur un agitateur de microplaques à température ambiante.
  3. Pendant ce temps, préparez le mélange de détection 1x ADP contenant 8 nM de traceur ADP et 10 μg/mL d’anticorps ADP2 conjugué à un colorant (voir le tableau des matériaux) au tampon d’arrêt et de détection B (1x) du kit. Arrêter la réaction kinase (étape 3.2) en ajoutant 10 μL du mélange de détection 1x ADP et incuber pendant 1 h à température ambiante.
  4. Mesurez l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques, avec une excitation à 580 nm, une émission à 630 nm et une largeur de bande de 10 nm. Obtenir des unités de fluorescence relative (RFU) de l’instrument pour obtenir le pourcentage d’inhibition enzymatique, selon l’équation (2).
    figure-protocol-3Égaliseur (2)
  5. Calculez la valeur IC50 telle qu’elle figure sur le site Web de l’entreprise23.

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Results

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W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 et les peptides témoins W-R ont été synthétisés à l’aide de la synthèse peptidique en phase solide Fmoc (Figure 3), avec une pureté de 95 %, 98,7 %, 99 %, 100 %, 100 % et 99,5 %, respectivement. Les structures chimiques de ces dipeptides ont été confirmées à l’aide de l’ESI-MS. Les valeurs m/z de ces dipeptides étaient respectivement de 374,1624, 388,194...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les peptides fabriqués et testés ici pour l’inhibition de la kinase Src et la destruction conséquente des cellules cancéreuses contenaient du tryptophane méthylé et/ou de l’arginine méthylée, qui sont des acides aminés non naturels. La formation du précipité blanc lors de l’ajout d’éther diéthylique est une étape critique dans la synthèse de ces peptides. Cependant, tous les peptides synthétiques ne peuvent pas former un précipité ; par conséquent, même lorsqu’un précipité n’est pas form...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier le Décanat de la Recherche Scientifique (DSR) de l’Université King Abdulaziz (KAU), Djeddah, Arabie Saoudite, qui a financé ce projet dans le cadre de la subvention n°. (G : 031-130-1443).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10708984001Synthèse peptidique
Entonnoir filtrant fritté Aldrich pour la synthèse en phase solideSigma-AldrichZ283304Récipient de synthèse peptidique
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 AQueous One  ; La solution  ; Réactifs d’essai de prolifération cellulaire  ;PromegaG3582Essai de prolifération cellulaire (réactif MTS)
Dichlorométhane, 99,9 %, Extra SecFishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 colonne  ;Shimadzu  ; (système RP-HPLC)gradient eau/acétonitrile
IRDye QC-1 quencherBell Brook Labs, Madison, WI3013
Lecteur de microplaques SpectraMax M2eDispositifs
Microsoft Excel TableurMicrosoft
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-Diméthylformamide, anhydre, 99,8 %FishersciAA43997M1
Pipéridine 20 %Sigma-Aldrich80645
Résine Rink Amide (100-200 mesh)Sigma-Aldrich8550010025
ThioanisoleSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src kit de dosage de l’activité kinase
moléculaires

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