Method Article

Applications techniques des enregistrements de microélectrodes et de patch clamp sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro prometteur pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Ici, nous détaillons un protocole pour mesurer la contractilité et l’électrophysiologie des hiPSC-CMs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cardiotoxicité induite par les médicaments est la principale cause d’attrition des médicaments et de retrait du marché. Par conséquent, l’utilisation de modèles précliniques appropriés d’évaluation de la sécurité cardiaque est une étape cruciale lors de la mise au point de médicaments. À l’heure actuelle, l’évaluation de l’innocuité cardiaque dépend encore fortement des études sur les animaux. Cependant, les modèles animaux sont en proie à une faible spécificité translationnelle pour les humains en raison de différences spécifiques à l’espèce, en particulier en termes de caractéristiques électrophysiologiques cardiaques. Il est donc urgent de développer un modèle fiable, efficace et humain pour l’évaluation préclinique de la sécurité cardiaque. Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro inestimable pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Les hiPSC-CM peuvent être obtenus à partir d’individus ayant divers antécédents génétiques et diverses maladies pathogènes, ce qui en fait un substitut idéal pour évaluer individuellement la cardiotoxicité induite par les médicaments. Par conséquent, il est nécessaire d’établir des méthodologies permettant d’étudier de manière exhaustive les caractéristiques fonctionnelles des CM-CSPh. Dans ce protocole, nous détaillons divers tests fonctionnels qui peuvent être évalués sur les CM-HiPSC, y compris la mesure de la contractilité, du potentiel de champ, du potentiel d’action et de la manipulation du calcium. Dans l’ensemble, l’intégration des CSPhi-CM dans l’évaluation préclinique de l’innocuité cardiaque a le potentiel de révolutionner le développement de médicaments.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement de médicaments est un processus long et coûteux. Une étude sur les nouveaux médicaments thérapeutiques approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis entre 2009 et 2018 a révélé que le coût médian estimé de la recherche et des essais cliniques capitalisés était de 985 millions de dollars par produit1. La cardiotoxicité induite par les médicaments est la principale cause d’attrition des médicaments et de retrait du marché2. Notamment, la cardiotoxicité est signalée parmi plusieurs classes de médicaments thérapeutiques3. Par conséquent, l’évaluation de la sécurité cardiaque est un élément crucial du processus de développement du médicament. Le paradigme actuel de l’évaluation de la sécurité cardiaque dépend encore fortement des modèles animaux. Cependant, les différences entre les espèces par rapport à l’utilisation de modèles animaux sont de plus en plus reconnues comme la principale cause des prédictions inexactes de la cardiotoxicité induite par les médicaments chez les patients humains4. Par exemple, la morphologie du potentiel d’action cardiaque diffère considérablement entre les humains et les souris en raison des contributions de différents courants repolarisants5. De plus, les isoformes différentielles de myosine cardiaque et d’ARN circulaires qui peuvent avoir un impact sur la physiologie cardiaque ont été bien documentées chez les espèces 6,7. Pour combler ces lacunes, il est impératif d’établir un modèle fiable, efficace et humain pour l’évaluation préclinique de la sécurité cardiaque.

L’invention révolutionnaire de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) a généré des plateformes sans précédent de dépistage de médicaments et de modélisation des maladies. Au cours de la dernière décennie, les méthodes de génération de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont devenues bien établies 8,9. Les hiPSC-CM ont suscité un grand intérêt pour leurs applications potentielles dans la modélisation des maladies, le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la médecine de précision. Par exemple, les hiPSC-CM ont été utilisés pour modéliser les phénotypes pathologiques des maladies cardiaques causées par l’hérédité génétique, telles que le syndrome du QT long10, la cardiomyopathie hypertrophique 11,12 et la cardiomyopathie dilatée13,14,15. Par conséquent, des voies de signalisation clés impliquées dans la pathogenèse des maladies cardiaques ont été identifiées, ce qui peut éclairer les stratégies thérapeutiques potentielles pour un traitement efficace. De plus, les hiPSC-CM ont été utilisés pour dépister la cardiotoxicité induite par les médicaments associée aux agents anticancéreux, y compris la doxorubicine, le trastuzumab et les inhibiteurs de la tyrosine kinase16,17,18; Des stratégies visant à atténuer la cardiotoxicité qui en résulte sont à l’étude. Enfin, l’information génétique conservée dans les CSPhi-CM permet le dépistage et la prédiction de la cardiotoxicité induite par les médicaments aux niveaux individuel et de la population19,20. Collectivement, les hiPSC-CM se sont révélés être un outil inestimable pour la prédiction personnalisée de la sécurité cardiaque.

L’objectif global de ce protocole est d’établir des méthodologies pour étudier de manière exhaustive et efficace les caractéristiques fonctionnelles des CSPh-CM, qui sont d’une grande importance dans l’application des CSPhi-CM à la modélisation de la maladie, au dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et à la médecine de précision. Ici, nous détaillons une série de tests fonctionnels pour évaluer les propriétés fonctionnelles des CM-HiPSC, y compris la mesure de la contractilité, du potentiel de champ, du potentiel d’action et de la manipulation du calcium (Ca2+) (Figure 1).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation des supports et des solutions

  1. Préparer le milieu d’entretien hiPSC-CM en mélangeant un flacon de 10 ml de supplément de B27 50x et 500 ml de milieu RPMI 1640. Conservez le milieu à 4 °C et utilisez-le dans un délai d’un mois. Équilibrer la température moyenne à la température ambiante (RT) avant utilisation.
  2. Préparer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM en mélangeant 20 mL de sérum de remplacement et 180 mL de milieu d’entretien hiPSC-CM (dilution à 10 %, v/v). Bien que le milieu de semis fraîchement préparé soit préférable, il peut être conservé à 4 °C pendant 2 semaines au maximum. Équilibrer le milieu à RT avant utilisation.
  3. Préparer la solution de revêtement de matrice extracellulaire en décongelant un flacon (10 mL) de matrice membranaire basale à 4 °C pendant une nuit et en aliquote 500 μL de matrice membranaire basale dans des tubes stériles de 1,5 mL. Conserver à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Mélanger 500 μL de matrice membranaire basale et 100 mL de milieu DMEM/F12 glacé (dilution 1:200, v/v) pour obtenir une solution de revêtement matriciel membranaire basal.
  4. Préparer 50 mL de solution de Tyrode contenant 135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glucose et 10 mM HEPES. Ajustez le pH à 7,4 avec NaOH. Préparez la solution fraîche de Tyrode le jour de l’expérience.
  5. Préparer 50 mL de solution de pipette intracellulaire contenant 120 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM d’EGTA et 10 mM de HEPES. Ajustez le pH à 7,2 avec KOH. Aliquote la solution de pipette intracellulaire dans des tubes stériles de 5 mL et la conserver à -20 °C. Le jour de l’expérience, ajouter fraîchement MgATP à la solution pour obtenir une concentration finale de 3 mM.
  6. Préparer 1 mL de solution de chargement Fura-2 AM contenant 2 μM de Fura-2 AM et 0,1 % de F-127 pluronique. Préparez une solution de chargement fraîche le jour de l’expérience et protégez-la de la lumière.

2. Mesure du mouvement de contraction hiPSC-CM

  1. Préparer les plaques revêtues de matrice membranaire basale en ajoutant 100 μL de solution de revêtement à matrice extracellulaire à chaque puits de plaques de 96 puits. Incuber les plaques de 96 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% de CO2 pendant la nuit.
  2. Dissociation enzymatique des CM-HIPSC
    1. Demandez des hiPSC à Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Générer des hiPSC-CM selon les publications précédentes 8,9. Observez les hiPSC-CM cultivés dans des plaques à six puits au microscope à un grossissement de 10x.
      NOTE: Ne dissociez pas les cellules lorsqu’elles sont encore prolifératives. Sinon, les cellules proliféreront sur les puits après le replacage et conduiront à des résultats inexacts des tests fonctionnels. Habituellement, les hiPSC-CM arrêtent la prolifération aux jours 18-23.
    2. Assurez-vous que les hiPSC-CM battent fort et ont une pureté de plus de 95%. Evaluer la pureté par immunomarquage contre la troponine T cardiaque, un marqueur spécifique des cardiomyocytes 8,9.
    3. Aspirez le fluide d’entretien et lavez les cellules avec 1x DPBS deux fois. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire dans chaque puits des plaques à six puits et incuber pendant 10 min à 37 °C.
      REMARQUE : La durée d’incubation doit être surveillée régulièrement. Assurez-vous de ne pas trop digérer les cellules car cela réduirait la viabilité cellulaire.
    4. Pipeter doucement les hiPSC-CM de haut en bas plusieurs fois à l’aide d’une pipette de 5 ml pour générer une suspension unicellulaire. Ajouter un volume égal de milieu d’ensemencement hiPSC-CMs pour neutraliser la solution de décollement cellulaire.
    5. Centrifuger les hiPSC-CMs à 300 x g pendant 3 min à TA. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1-2 mL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM.
    6. Quantifier la densité cellulaire et la viabilité à l’aide d’une méthode d’exclusion du bleu trypan. En bref, mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec un volume égal de bleu de trypan, transférer sur une lame de comptage de cellules, puis compter à l’aide d’un compteur de cellules, comme décrit précédemment21.
  3. Ensemencement des hiPSC-CM
    1. Retirez la solution de revêtement de matrice extracellulaire des plaques à 96 puits.
    2. Ensemencer 50 000 cellules par puits dans 100 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM et placer les plaques de 96 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% de CO2 pendant la nuit.
    3. Remplacer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM par 100 μL de milieu d’entretien hiPSC-CM 1 jour après le placage. Changez le support de maintenance hiPSC-CM tous les 2 jours jusqu’à l’enregistrement.
  4. Acquisition de données
    1. Mesurer le mouvement de contraction hiPSC-CM au moins 10 jours après le placage (recommandé).
    2. Allumez le régulateur de température et réglez 37 °C comme température préférée. Allumez le microscope, l’appareil photo et l’alimentation en CO2 .
    3. Remplissez la chemise d’eau du porte-plaque avec une quantité appropriée d’eau désionisée stérile (figure 2A). Placez la plaque de 96 puits sur le support de plaque et laissez les cellules s’acclimater pendant au moins 5 minutes.
    4. Ouvrez le logiciel de visualisation, réglez la fréquence d’images de la caméra sur 75 images par seconde (ips) et la résolution vidéo/image sur 1024 × 1024 pixels. Appliquez les fonctions de mise au point automatique et de luminosité automatique. Enregistrez des vidéos et des images de hiPSC-CM.
      REMARQUE: Évitez les vibrations de la table de microscope pendant l’enregistrement.
    5. Ouvrez le logiciel d’analyse pour une analyse automatique.

3. Mesure du potentiel de champ hiPSC-CM

  1. Préparation de plaques revêtues de matrice à membrane basale
    1. Placez soigneusement une gouttelette de 8 μL de solution de revêtement de matrice extracellulaire sur la zone de l’électrode d’enregistrement de chaque puits des plaques MEA (Microelectrode Array) à 48 puits. Voir la figure 3A pour connaître la zone d’électrode appropriée pour le placement des gouttelettes. Cette étape est essentielle pour garder la monocouche hiPSC-CM concentrée sur les électrodes. Évitez de toucher les électrodes en aucune circonstance.
    2. Ajouter 3 mL d’eau désionisée stérile à la zone entourant les puits (figure 3A) des plaques d’AEM de 48 puits pour empêcher l’évaporation de la solution de revêtement. Incuber des plaques MEA à 48 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% de CO2 pendant 45-60 min.
      REMARQUE: Ne pas incuber trop longtemps pour empêcher la matrice membranaire basale de sécher.
  2. Effectuer la dissociation enzymatique des CM-HIPSC comme décrit à l’étape 2.2.
  3. Ensemencement des hiPSC-CM
    1. Retirez la majeure partie du milieu de la matrice extracellulaire de la surface du puits sans toucher les électrodes à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL dans la même rangée ou colonne.
    2. Ensemencer 50 000 cellules par puits dans une gouttelette de 8 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM sur la zone de l’électrode d’enregistrement de chaque puits de la même rangée ou colonne.
    3. Répétez les deux dernières étapes jusqu’à ce que tous les puits aient été plaqués avec des cellules. Vérifiez au microscope que tous les puits ont la suspension hiPSC-CM. Pour la densité souhaitée, voir la figure 3B.
      REMARQUE: La fixation des hiPSC-CM sera compromise si la matrice de membrane basale est complètement séchée, ce qui rend la fixation des cellules sous-optimale.
    4. Incuber les plaques MEA de 48 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% de CO2 pendant 60 min.
    5. Ajouter lentement et doucement 150 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM à chaque puits des plaques MEA de 48 puits. Pour ajouter du milieu sans disperser les hiPSC-CM préalablement ensemencés, tenez la plaque à un angle de 45°, appuyez l’extrémité de la pipette contre la paroi de chaque puits et relâchez lentement le milieu.
      REMARQUE: L’ajout de milieu trop rapidement ou avec une pression élevée délogera les cardiomyocytes adhérents. Évitez tout contact direct avec la suspension antichute hiPSC-CM.
    6. Incuber les plaques MEA de 48 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% CO2 pendant la nuit.
    7. Rafraîchir le milieu d’ensemencement hiPSC-CM avec 300 μL de milieu d’entretien hiPSC-CM 1 jour après le placage. Changez le support de maintenance hiPSC-CM tous les 2 jours avant l’enregistrement.
  4. Acquisition de données
    1. Effectuer la mesure de l’AEM au moins 10 jours après le placage (recommandé). Au jour 10 post-placage, vérifier la densité de la monocouche hiPSC-CM battante spontanée au microscope à un grossissement de 10x, qui devrait être comme indiqué à la figure 3C.
    2. Placez la plaque MEA à 48 puits dans l’instrument d’enregistrement. L’écran tactile permet d’observer l’état de la température (37 °C) et du CO2 (5%).
    3. Ouvrez le logiciel de navigation. Dans la fenêtre de configuration expérimentale, sélectionnez Configuration cardiaque en temps réel et Enregistrements du potentiel de terrain. Appliquez des configurations de battement spontanées ou rythmées.
    4. Dans les paramètres de détection des battements, régler le seuil de détection sur 300 μV, la période de battement minimale sur 250 ms et la période de battement maximale sur 5 s. Sélectionnez Régression polynomiale pour le calcul de la durée potentielle du champ (FPD).
    5. Vérifiez si le signal d’activité électrique de base est mature et stable.
      NOTE: Les formes d’onde matures enregistrées par chaque électrode à partir de la plaque MEA multipuits doivent refléter le potentiel de champ cardiaque avec des caractéristiques facilement identifiables coïncidant avec le pic de dépolarisation cardiaque et la phase de repolarisation, comme le montre la figure 3D-F.
    6. Acquérir les activités cardiaques de base pendant 1-3 min. Si un traitement médicamenteux est nécessaire, ajouter des composés aux puits après l’enregistrement de base. Placez la plaque dans un incubateur pendant au moins 30 minutes avant le prochain enregistrement.

4. Mesure du potentiel d’action de la CSPc-CM

  1. Préparer des plats recouverts d’une matrice membranaire basale en plaçant 500 μL de solution de revêtement à matrice extracellulaire sur la partie inférieure en verre de la vaisselle de 35 mm (figure 4A). Incuber les plats de 35 mm dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% CO2 pendant la nuit.
  2. Effectuer la dissociation enzymatique des CM-HIPSC comme décrit à l’étape 2.2.
  3. Ensemencement des hiPSC-CM
    1. Retirez la solution de revêtement à matrice extracellulaire des boîtes de 35 mm. Ensemencer 50 000 cellules par puits dans 500 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM sur la partie inférieure en verre de boîtes de 35 mm.
    2. Incuber les plats de 35 mm dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% CO2 pendant la nuit. Retirer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM et ajouter 2 ml de milieu d’entretien hiPSC-CM dans les boîtes de 35 mm.
      REMARQUE : Il est recommandé de placer un embout non filtré de 200 μL sur la pipette d’aspiration de 2 mL pour retirer le milieu usé afin d’éviter de toucher les cellules.
    3. Changez le milieu de culture hiPSC-CM tous les 2 jours avant l’enregistrement.
  4. Acquisition de données
    1. Effectuer la mesure du potentiel d’action au moins 10 jours après le placage (recommandé). Préparer la solution de Tyrode fraîche comme décrit à l’étape 1.4. Décongeler une partie aliquote de la solution de pipette intracellulaire et ajouter fraîchement le MgATP à une concentration finale de 3 mM.
    2. Tirez les micropipettes des capillaires en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de micropipettes.
      NOTE: Une résistance de 2-5 MΩ des micropipettes est préférée.
    3. Remplacez le milieu de maintenance hiPSC-CM par la solution de Tyrode et laissez les cellules s’acclimater à la solution de Tyrode pendant 15 min (Figure 4C). Insérez les capteurs de température dans la chambre, placez la capsule de 35 mm dans la chambre comme indiqué à la figure 4C et réglez la température à 37 °C (figure 4D).
    4. Remplissez les micropipettes avec une solution intracellulaire et insérez-les dans le support relié à la tête de l’amplificateur à pince patch-clamp (Figure 4E). Ouvrez le logiciel de stimulation/acquisition, chargez le protocole d’enregistrement du potentiel d’action et sélectionnez la configuration tension-pince.
    5. Insérez la micropipette dans la solution du bain, sélectionnez les hiPSC-CM uniques appropriés, et ajustez et abaissez la position de la micropipette à côté de la cellule sélectionnée à l’aide d’un micromanipulateur. Lorsque l’embout de la pipette est inséré dans la solution du bain, vérifiez la résistance de la pipette qui peut être observée sur le moniteur de l’oscilloscope.
    6. Placez la pipette près de la cellule, et les impulsions de courant diminueront légèrement pour refléter la résistance croissante de l’étanchéité. Appliquez une aspiration douce avec une pression négative pour augmenter la résistance, ce qui formera un gigajoint. Appliquez la fonction Sceau .
    7. Appliquez une aspiration supplémentaire pour briser la membrane afin d’obtenir une configuration d’enregistrement de cellule entière. Une fois que la partie membranaire dans la zone de la pipette est rompue par aspiration, la solution interne est en équilibre avec le cytoplasme cellulaire. À ce stade, passez du mode de pince de tension (V-clamp) au mode de pince de courant ou à l’absence d’injection de courant (C-Clamp) à l’aide de la boîte de dialogue de l’amplificateur. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour générer et enregistrer les fichiers d’enregistrement potentiels d’action.
      REMARQUE: Le changement de mode fournit un enregistrement continu des potentiels d’action spontanée des hiPSC-CM via un protocole d’enregistrement sans déclencheur ni stimulation, qui peut être surveillé à la sortie V-mon de l’amplificateur patch-clamp.

5. Mesure du transitoire hiPSC-CM Ca2+

  1. Reportez-vous au protocole précédent pour la préparation de chambres cellulaires personnalisées pour l’imagerie Ca 2+ 21. Pour la préparation de la chambre cellulaire à matrice membranaire basale, placez 200 μL de solution de revêtement de matrice extracellulaire dans les chambres cellulaires. Incuber les chambres cellulaires dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% CO2 pendant la nuit.
  2. Effectuer la dissociation enzymatique des CM-HIPSC comme décrit à l’étape 2.2.
  3. Ensemencement des hiPSC-CM
    1. Retirez la solution de revêtement de matrice extracellulaire des chambres cellulaires. Ensemencer 20 000 cellules par puits dans 200 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM.
    2. Remplacer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM par 200 μL de milieu d’entretien hiPSC-CM 1 jour après le placage. Changez le support de maintenance hiPSC-CM tous les 2 jours avant l’enregistrement.
  4. Acquisition de données
    1. Effectuer une mesure transitoire Ca2+ au moins 10 jours après le placage (recommandé). Préparer la solution de Tyrode fraîche comme décrit à l’étape 1.4. Préparer la solution de chargement Fura-2 AM fraîche comme décrit à l’étape 1.6.
    2. Aspirez le support de maintenance hiPSC-CM et lavez deux fois avec la solution Tyrode. Appliquer 100 μL de solution de chargement Fura-2 AM et incuber pendant 10 min à TA.
    3. Remplacer la solution de chargement Fura-2 AM par la solution Tyrode et prévoir au moins 5 minutes pour une estérification complète de Fura-2 AM.
    4. Ajouter une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif 40x d’un microscope à épifluorescence inversée équipé d’un objectif d’immersion d’huile 40x (0,95 NA). Placez la chambre cellulaire dans l’adaptateur de scène du microscope (Figure 5A).
    5. Installez les fils du régulateur de température dans la chambre du bain et réglez-la à 37 °C. Installez les électrodes de stimulation de champ électrique et réglez les impulsions à 0,5 Hz avec une durée de 20 ms.
    6. Allumez la source lumineuse à commutation de longueur d’onde ultra-rapide et réglez-la sur les modes de commutation rapide 340 nm et 380 nm selon les instructions de l’instrument.
    7. Appliquez un temps d’exposition de 20 ms pour les deux longueurs d’onde et un temps d’enregistrement de 20 s dans le logiciel. Enregistrez la vidéo reflétant les changements en temps réel du transitoire Ca2+ dans les hiPSC-CM. Exportez les données vers une feuille de calcul et analysez-les comme décrit précédemment23.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit comment mesurer le mouvement de contraction, le potentiel de champ, le potentiel d’action et le transitoire Ca2+ des hiPSC-CM. Un diagramme schématique comprenant la digestion enzymatique, l’ensemencement cellulaire, l’entretien et la conduction fonctionnelle du test est illustré à la figure 1. La formation de la monocouche hiPSC-CM est nécessaire pour la mesure du mouvement de contraction (Figure 2B). Une trace représentative du m...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technologie iPSC humaine est devenue une plate-forme puissante pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour mesurer la contractilité hiPSC-CM, le potentiel de champ, le potentiel d’action et le transitoire Ca2+. Ce protocole fournit une caractérisation complète de la contractilité et de l’électrophysiologie hiPSC-CM. Ces tests fonctionnels ont été appliqués dans plusieurs publications de notre groupe 12,13,18,24,25,26,27....

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. est co-fondateur de Greenstone Biosciences mais n’a pas d’intérêts concurrents, car le travail présenté ici est complètement indépendant. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Blake Wu d’avoir relu le manuscrit. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, et NASA NNX16A069A (JCW), et AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plat à fond en verre de 35 mm avec micro-puits de 20 mm #1.5 couvercle en verreCellvisD35-20-1.5-NPatch clamp
50x B27 supplémentsLife Technologies17504-044hiPSC-CM milieu
de culture 6 puits plaquede culture E & K ScientificEK-27160culture hiPSC-CM
96 puits plat à fond transparent en polystyrène noir Microplaques traitées TCCorning3603Mesure du mouvement de contraction
AccutaseSigma-AldrichA6964Dissociation enzymatique
Axion’s Integrated Studio (AxIS)Logiciel de navigationAxion Biosystems
Capillaires en verre borosilicatéHarvard ApparatusBF 100-50-10,Patch clamp
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s
solution Lames de chambre de comptage cellulaireThermoFisher ScientificC10228Comptage cellulaire
CytoView Plaques MEA 48 puitsAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Matrice extracellulaire milieu
DPBS, sans calcium, sans magnésiumFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Solution de pipette intracellulaire
EPC 10 USB  ; patch clamp amplificateurWarner Instruments89-5000Patch clamp
Fura-2, AM, cellule perméableThermoFisher ScientificF1221Ca2+ mesure transitoire
GlucoseSigma-AldrichG8270Tyrode' s solution
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' solution
hiPSCsStanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode' s
solution KnockOut Serum ReplacementThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM milieu de semis
KOH 8  ; MSigma-AldrichP4494Solution de pipette intracellulaire
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ mesure transitoire ; source lumineuse à commutation de longueur d’onde ultra-rapide
Luna-FL compteur de cellules de fluorescence automatiséWISBIOMEDLB-L20001Comptage de cellules
Maestro Pro  ; Système MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matrice de membrane basale Corning356231Matrice extracellulaire
MgATPSigma-AldrichA9187Solution de pipette intracellulaire
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s solution
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s solution
NaOH 10  ; MSigma-Aldrich72068Tyrode' solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (solution à 20 % dans DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ mesure transitoire
RPMI 1640 medium LifeTechnologies11875-119milieu de culture hiPSC-CM
Sony SI8000 Cell Motion Imaging SystemSony BiotechnologyMesure du mouvement de contraction
Sutter Extracteur de micropipettesSutter InstrumentsP-97Patch clamp
Trypan blue stainLife TechnologiesT10282Comptage de cellules

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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