Applications techniques des enregistrements de microélectrodes et de patch clamp sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Summary

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro prometteur pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Ici, nous détaillons un protocole pour mesurer la contractilité et l’électrophysiologie des hiPSC-CMs.

Abstract

La cardiotoxicité induite par les médicaments est la principale cause d’attrition des médicaments et de retrait du marché. Par conséquent, l’utilisation de modèles précliniques appropriés d’évaluation de la sécurité cardiaque est une étape cruciale lors de la mise au point de médicaments. À l’heure actuelle, l’évaluation de l’innocuité cardiaque dépend encore fortement des études sur les animaux. Cependant, les modèles animaux sont en proie à une faible spécificité translationnelle pour les humains en raison de différences spécifiques à l’espèce, en particulier en termes de caractéristiques électrophysiologiques cardiaques. Il est donc urgent de développer un modèle fiable, efficace et humain pour l’évaluation préclinique de la sécurité cardiaque. Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro inestimable pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Les hiPSC-CM peuvent être obtenus à partir d’individus ayant divers antécédents génétiques et diverses maladies pathogènes, ce qui en fait un substitut idéal pour évaluer individuellement la cardiotoxicité induite par les médicaments. Par conséquent, il est nécessaire d’établir des méthodologies permettant d’étudier de manière exhaustive les caractéristiques fonctionnelles des CM-CSPh. Dans ce protocole, nous détaillons divers tests fonctionnels qui peuvent être évalués sur les CM-HiPSC, y compris la mesure de la contractilité, du potentiel de champ, du potentiel d’action et de la manipulation du calcium. Dans l’ensemble, l’intégration des CSPhi-CM dans l’évaluation préclinique de l’innocuité cardiaque a le potentiel de révolutionner le développement de médicaments.

Introduction

Le développement de médicaments est un processus long et coûteux. Une étude sur les nouveaux médicaments thérapeutiques approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis entre 2009 et 2018 a révélé que le coût médian estimé de la recherche et des essais cliniques capitalisés était de 985 millions de dollars par produit¹. La cardiotoxicité induite par les médicaments est la principale cause d’attrition des médicaments et de retrait du marché². Notamment, la cardiotoxicité est signalée parmi plusieurs classes de médicaments thérapeutiques³. Par conséquent, l’évaluation de la sécurit....

Protocol

1. Préparation des supports et des solutions

1. Préparer le milieu d’entretien hiPSC-CM en mélangeant un flacon de 10 ml de supplément de B27 50x et 500 ml de milieu RPMI 1640. Conservez le milieu à 4 °C et utilisez-le dans un délai d’un mois. Équilibrer la température moyenne à la température ambiante (RT) avant utilisation.
2. Préparer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM en mélangeant 20 mL de sérum de remplacement et 180 mL de milieu d’entretien hiPSC-CM (dilution à 10 %, v/v). Bien que le milieu de semis fraîchement préparé soit préférable, il peut être conservé à 4 °C pendant 2 semaines au maximum. Équilibrer le milieu à RT avant uti....

Results

Ce protocole décrit comment mesurer le mouvement de contraction, le potentiel de champ, le potentiel d’action et le transitoire Ca²⁺ des hiPSC-CM. Un diagramme schématique comprenant la digestion enzymatique, l’ensemencement cellulaire, l’entretien et la conduction fonctionnelle du test est illustré à la figure 1. La formation de la monocouche hiPSC-CM est nécessaire pour la mesure du mouvement de contraction (Figure 2B). Une trace représentative du m.......

Discussion

La technologie iPSC humaine est devenue une plate-forme puissante pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour mesurer la contractilité hiPSC-CM, le potentiel de champ, le potentiel d’action et le transitoire Ca²⁺. Ce protocole fournit une caractérisation complète de la contractilité et de l’électrophysiologie hiPSC-CM. Ces tests fonctionnels ont été appliqués dans plusieurs publications de notre groupe 12,13,18,24,25,26,27.^.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plat à fond en verre de 35 mm avec micro-puits de 20 mm #1.5 couvercle en verre	Cellvis	D35-20-1.5-N	Patch clamp
50x B27 suppléments	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM milieu
de culture 6 puits plaque	de culture E & K Scientific	EK-27160	culture hiPSC-CM
96 puits plat à fond transparent en polystyrène noir Microplaques traitées TC	Corning	3603	Mesure du mouvement de contraction
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	Dissociation enzymatique
Axion’s Integrated Studio (AxIS)	Logiciel de navigation	Axion Biosystems
Capillaires en verre borosilicaté	Harvard Apparatus	BF 100-50-10,	Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode' s
solution Lames de chambre de comptage cellulaire	ThermoFisher Scientific	C10228	Comptage cellulaire
CytoView Plaques MEA 48 puits	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	Matrice extracellulaire milieu
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Solution de pipette intracellulaire
EPC 10 USB  ; patch clamp amplificateur	Warner Instruments	89-5000	Patch clamp
Fura-2, AM, cellule perméable	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ mesure transitoire
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode' s solution
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode' solution
hiPSCs	Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode' s
solution KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM milieu de semis
KOH 8  ; M	Sigma-Aldrich	P4494	Solution de pipette intracellulaire
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ mesure transitoire ; source lumineuse à commutation de longueur d’onde ultra-rapide
Luna-FL compteur de cellules de fluorescence automatisé	WISBIOMED	LB-L20001	Comptage de cellules
Maestro Pro  ; Système MEA	Axion Biosystems		MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matrice de membrane basale Corning		356231	Matrice extracellulaire
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Solution de pipette intracellulaire
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode' s solution
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode' s solution
NaOH 10  ; M	Sigma-Aldrich	72068	Tyrode' solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (solution à 20 % dans DMSO)	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ mesure transitoire
RPMI 1640 medium Life	Technologies	11875-119	milieu de culture hiPSC-CM
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System	Sony Biotechnology		Mesure du mouvement de contraction
Sutter Extracteur de micropipettes	Sutter Instruments	P-97	Patch clamp
Trypan blue stain	Life Technologies	T10282	Comptage de cellules