Method Article

Cartographie de la densité absolue de l’ADN dans les noyaux cellulaires à l’aide de la microscopie de localisation à molécule unique

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole décrit une méthode mesurant les densités absolues d’ADN dans les noyaux cellulaires adhérents à l’aide de la tessellation Voronoï des données de microscopie de localisation de molécules uniques, du volume connu, de la taille du génome et du stade du cycle cellulaire.

Abstract

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Dans le noyau cellulaire, les gènes silencieux sont généralement situés dans les zones de chromatine de haute densité appelées hétérochromatine, tandis que les gènes actifs se trouvent principalement à l’interface entre la chromatine et l’espace interchromatinin appelé euchromatine. À l’heure actuelle, la caractérisation de l’euchromatine et de l’hétérochromatine est principalement basée sur des modifications épigénétiques des protéines d’histones le long de la séquence d’ADN, alors que l’on sait peu de choses sur les densités absolues d’ADN dans le noyau cellulaire et leurs implications fonctionnelles. Les modèles du noyau basés uniquement sur des données biochimiques et des hypothèses sur la nature de la chromatine en tant que polymère diffèrent encore fondamentalement des données d’imagerie générées par la microscopie à haute résolution. Cela indique qu’il manque encore des informations importantes et structurellement pertinentes. Nous pensons que les contraintes spatiales pourraient être impliquées dans la régulation des gènes et avons donc développé une méthode qui permet de mesurer les densités absolues d’ADN dans les noyaux de cellules de mammifères en transformant les données de localisation à super-résolution en cartes de densité à l’échelle réelle par tessellation de Voronoï.

Introduction

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Depuis les premiers jours de la biologie cellulaire, le noyau cellulaire - siège de l’information génétique - fascine les biologistes. Après avoir appliqué des méthodes de coloration cytologique qu’il a lui-même développées, Emil Heitz a découvert, en 1928, des zones intensément colorées différemment dans le noyau1 de la cellule. Il a appelé les zones denses et plus intensément colorées « hétérochromatine », tandis qu’il a nommé les zones moins fortement colorées et moins denses « euchromatine ». Au fil du temps, il est devenu évident que les gènes actifs sont principalement situés dans l’euchromatine, tandis que les zones plus denses se sont avérées riches en éléments répétitifs et en gènes silencieux. Les termes hétérochromatine et euchromatine ont survécu jusqu’à nos jours, bien que leur définition ait changé, passant de propriétés structurelles à propriétés moléculaires (voir ci-dessous). Nous savons aujourd’hui que le noyau cellulaire est divisé en deux phases principales. L’un liquide (le compartiment interchromainien), qui abrite les corps nucléaires, le compartiment d’épissage et le nucléoplasme, et l’autre solide, semblable à l’hydrogel, le domaine de la chromatine, qui comprend les territoires chromosomiques et les nucléoles2. À l’interface avec l’espace interchromainien, la chromatine est moins dense, et c’est là que se déroulent principalement les processus génétiquement actifs tels que la transcription, la réplication et la réparation 3,4,5, tandis qu’adjacente à la lame, autour des nucléoles et près des centromères, la chromatine présente des niveaux de compactage élevés et est en général transcriptionnellement plutôt inactive6.

Au niveau moléculaire, la chromatine est construite à partir d’ADN enroulé autour de nucléosomes (un octamère des protéines d’histones centrales). Les histones possèdent des domaines de queue intrinsèquement désordonnés qui peuvent être modifiés post-traductionnellement par l’ajout de plusieurs groupes chimiques (méthyle, acétyle, phosphore, biotine), d’acides aminés (arginine) ou même de protéines (SUMO, ubiquitine)7. Ces modifications peuvent être lues et attirer d’autres protéines (par exemple, remodeleur de la chromatine, HP1, protéines de réparation, ARN) et définir ainsi l’état physiologique de la séquence d’ADN (transcriptionnellement permissif/restrictif), sans modifier directement sa séquence (donc « épi »génétique)7. Le type et le nombre de modifications autour d’une séquence spécifique peuvent différer profondément entre les types de cellules, sont réversibles et peuvent changer tout au long du développement, de la sénescence et de la maladie 8,9,10. Il y a des modifications des queues d’histones qui sont plus fréquentes dans les régions hautement transcrites et des modifications qui prédominent dans les régions du génome qui ont peu ou pas d’activité transcriptionnelle.

Par exemple, les régions hautement transcrites qui sont riches en modifications H3K4 ou dont les queues d’histones sont acétylées sont généralement décrites comme euchromatinienne, tandis que les zones riches en modifications répressives d’histones (H3K9me3, H3K27me3 ou H4K20me3) sont appelées hétérochromatine, qui est ensuite divisée en hétérochromatine constitutive (transcriptionnellement inactive dans toutes les cellules) (par exemple, H4K20me3) et hétérochromatine facultative (chromatine réduite au silence en fonction du type de cellule, par exemple, H3K27me3)6. Bien que les méthodes biochimiques et de biologie moléculaire soient très bien adaptées pour mesurer les changements chimiques au niveau de la séquence, il est beaucoup plus difficile de les utiliser pour faire des déclarations sur les propriétés spatiales à la méso-échelle en utilisant ces méthodes.

Par exemple, des tentatives ont été faites à l’aide d’informations de proximité provenant d’expériences Hi-C, qui détectent et cartographient les proximités étroites de l’ADN entre les régions de séquence, pour reconstruire des modèles spatiaux du génome11. Cependant, la comparaison directe avec des images de microscopie optique et électronique à haute résolution montre que cela n’est possible que dans une mesure limitée (figure 1). Bien que des méthodes telles que Hi-C12 puissent détecter correctement les territoires chromosomiques dans les cellules interphasiques en tant qu’entités distinctes, ces modèles sont plutôt « myopes », car les proximités des séquences d’ADN seules sont aveugles pour refléter les relations spatiales entre les parties plus éloignées du génome et ne sont donc pas très bien adaptées à une reconstruction correcte du génome en 3D. Par conséquent, les différences de densité ne peuvent pas non plus être correctement reflétées par les informations de fréquence de contact. Cela conduit à des représentations « spaghettifiées » du génome dans le noyau (voir Figure 1B), qui semblent se produire en une boule de boucles librement accessibles ressemblant à de la laine.

Pour ouvrir la voie à une image intégrative et plus réaliste du noyau qui combine des informations biochimiques avec des données biophysiques et structurelles, il faut développer des méthodes permettant de générer des données sur différents aspects de l’organisation nucléaire. Jusqu’à récemment, il était également difficile de déterminer les densités absolues d’ADN dans les noyaux cellulaires à partir des données d’imagerie. Les raisons en étaient la résolution limitée des microscopes optiques conventionnels, les problèmes de coloration spécifique de l’ADN en microscopie électronique et les faibles volumes d’observation en microscopie électronique.

La résolution des microscopes à fluorescence conventionnels est limitée par la diffraction de la lumière. L’image d’une source lumineuse ponctuelle est étalée en raison de la limite de diffraction et peut être décrite par la fonction d’étalement de points (PSF). Selon la PSF, l’image d’un fluorophore, qui peut être considérée en bonne approximation comme une source ponctuelle de lumière, occupe un volume d’une certaine taille autour de sa source d’origine (fluorophore)13. Lorsque de nombreux fluorophores, situés beaucoup plus près les uns des autres que les dimensions de leurs images limitées par la diffraction, sont excités simultanément, les distributions d’intensité imagées sont superposées et l’emplacement des fluorophores uniques ne peut pas être résolu. L’émission séquentielle et stochastique de lumière à partir de fluorophores (clignement) permet d’isoler optiquement des molécules individuelles et, ainsi, de trouver leur emplacement exact en déterminant les centres de gravité d’intensité de leurs signaux.

Cela peut être utilisé pour reconstruire les informations structurelles des échantillons en accumulant des données de localisation de fluorophores à partir de nombreuses images enregistrées. Cette méthode est généralement appelée microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) (pour plus d’informations, voir14). Plus un fluorophore émet de photons pendant son « temps de marche », plus les centres de gravité d’intensité peuvent être déterminés avec précision. Les lentilles astigmatiques dans le trajet du faisceau transforment les signaux des fluorophores au-dessus ou en dessous du plan focal optique en ellipses, qui peuvent être utilisées pour déterminer leur position le long de l’axe optique. Les grands axes des ellipses provenant de signaux fluorescents situés au-dessous du plan focal sont tournés à 90° par rapport aux axes des ellipses provenant de fluorophores situés au-dessus du plan focal. De plus, le rapport des axes de ces ellipses permet de déterminer la position de la molécule le long de l’axe optique par rapport au plan focal dans une plage de ±300 nm15.

La qualité des images à super-résolution générées par la reconstruction des événements de clignement stochastique dépend fortement de la densité de marquage et du nombre d’événements de clignement. Ces derniers dépendent de la photostabilité des fluorophores et du nombre d’événements de clignement avant qu’ils ne finissent par échouer (nombre de cycles marche/arrêt). La méthode décrite ici pour obtenir des images à super-résolution de la distribution intranucléaire de l’ADN est appelée fBALM (microscopie de localisation assistée par liaison assistée par fluctuation). Il est basé sur des fluorophores qui s’intercalent transitoirement en acides nucléiques et ne deviennent fluorescents qu’une fois qu’ils sont liés à l’ADN16,17. En raison des résidus chargés de son squelette de diester phosphoreux, l’ADN est un polymère hautement chargé négativement. La stabilisation des brins d’ADN complémentaires dans les cellules vivantes nécessite une neutralisation par des protéines chargées positivement (par exemple, les histones) et des ions. En abaissant le pH, la stabilité de l’appariement complémentaire des bases est réduite pour permettre aux colorants intercalaires de diffuser vers l’intérieur et vers l’extérieur16,17.

En fonction du colorant fluorescent intercalaire, cet état peut être atteint dans une certaine plage de pH. Les colorants fluorescents tels que YoYo-1 et SYTOX Orange ne deviennent fluorescents que lorsqu’ils sont liés à l’ADN et parce que les colorants intercalaires (contrairement aux colorants qui se lient au sillon mineur de l’ADN tels que Hoechst et le 4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]) se lient généralement de manière indépendante de la séquence, ils sont bien adaptés pour cartographier la distribution de l’ADN dans les noyaux cellulaires par microscopie de localisation.

La tessellation de Voronoï est une méthode mathématique permettant de subdivisionr l’espace en différentes partitions en fonction de l’emplacement des points. Dans 2D-Space, la taille des tuiles résultantes reflète l’inverse de la densité des points18. Étant donné que la microscopie de localisation reconstruit les images sous la forme d’un ensemble de points qui représentent l’emplacement des fluorophores, la tessellation de Voronoï peut aider à déterminer la densité des signaux de localisation (Figure 2). Ainsi, l’utilisation d’un colorant spécifique à l’ADN comme fluorophore permet de mesurer les densités d’ADN.

La connaissance a priori du contenu en ADN (nombre de paires de bases) et de la dimension spatiale du noyau permet de transformer les densités d’ADN relatives en densités absolues d’ADN. Le protocole suivant montre la cartographie des densités absolues d’ADN dans les cellules adhérentes à l’aide de SMLM à très haute résolution et démontre que ces densités sont sujettes à de grandes variations.

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Protocol

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REMARQUE : la figure 3 donne une vue d’ensemble du flux de travail décrit dans cette section. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur les réactifs, les matériaux, l’équipement et les logiciels utilisés dans ce protocole. Le code utilisé pour cette publication peut être consulté et téléchargé ici : https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Culture cellulaire

  1. Cultiver des cellules C3H10T1/2, HFB et HeLa dans du DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal à 37 °C dans une atmosphère humidifiée complétée par 5 % de CO2. Lorsque les cellules sont proches de la confluence, sous-cultivez les cellules en les divisant selon un rapport de 1:3 (C3H10T1/2, HFB) et 1:10 (HeLa), respectivement.
  2. Un jour avant d’effectuer les mesures, ensemencez les cellules des cultures à croissance exponentielle dans une boîte quadrillée de 35 mm. S’assurer que les boîtes d’observation offrent une excellente qualité optique pour la microscopie à fluorescence (fond de verre d’une épaisseur de 170 μm, #1.5) et possèdent une grille pour localiser sans ambiguïté les cellules. Assurez-vous également que les cellules sont dans une suspension unicellulaire et que toute la surface de la boîte est recouverte de cellules de manière homogène.
    REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des plats avec une grille imprimée pour trouver à nouveau les cellules exactes qui ont été attribuées à une certaine étape du cycle cellulaire.
  3. Si l’expérience l’exige, ajouter 100 nM de trichostatine A (TSA) au milieu de culture cellulaire et incuber les cellules dans les conditions précédemment décrites à l’étape 1.1.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Le jour de la mesure, lavez une fois les cellules avec 1x DPBS avant de les fixer pendant 30 min dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans 1x DPBS.
    REMARQUE : Pour des résultats reproductibles, assurez-vous qu’une solution de PFA fraîche est préparée à chaque fois et veillez particulièrement à ce que la concentration de PFA soit exacte.
  2. Après avoir retiré le fixateur, lavez à nouveau les cellules 2x avec 1x DPBS avant de les perméabiliser pendant 20 min dans 1x DPBS contenant 0,4 % de Triton X-100.
  3. Retirez le tampon de perméabilisation à l’aide d’une pipette et effectuez une étape de lavage supplémentaire avec 1x DPBS avant de traiter les cellules avec un cocktail de RNase (dilution 1:1 000 dans 1x DPBS). Placez les cellules dans un incubateur pendant 30 min à 37 °C dans une chambre humidifiée.
  4. Préparez la solution de coloration en diluant la solution mère SYTOX Orange compatible fBALM (5 mM dans 1x DPBS à une dilution de 1:10 000).
  5. Retirez le tampon RNase à l’aide d’une pipette et appliquez une étape de lavage supplémentaire avec 1x DPBS avant d’ajouter la solution de coloration. Incuber les cellules à température ambiante dans une chambre humidifiée pendant 5 min.
  6. Retirez la solution de coloration SYTOX Orange des cellules à l’aide d’une pipette, lavez avec 1x DPBS et stockez les cellules dans 1x DPBS, à l’abri de la lumière intense.

3. Détermination du cycle cellulaire cytométrique

REMARQUE : Pour cette étape, un microscope de dépistage inversé à haut contenu a été utilisé ici, mais tout microscope à fluorescence inversé à grand champ automatisé peut être utilisé. L’intensité de l’ensemble du noyau est une mesure de son contenu en ADN ; Par conséquent, assurez-vous d’ouvrir complètement le sténopé si vous utilisez un système confocal. Les objectifs à air à faible ouverture numérique (NA) sont préférables aux objectifs à immersion dans l’huile.

  1. Placez la parabole avec les cellules sur un microscope à fluorescence inverse équipé d’une platine motorisée et d’un logiciel qui permet de reconstruire de grandes zones sur l’échantillon en assemblant des images enregistrées automatiquement.
  2. Choisissez une lentille d’objectif qui permet d’enregistrer suffisamment de cellules par champ de vision (au moins 900 noyaux uniques au total [pour plus de détails, voir Roukos et al.19]) afin que l’acquisition d’images pour la détermination du cycle cellulaire puisse être effectuée dans un délai raisonnable. Utilisez un objectif qui ne présente pas de grandes différences d’intensité entre le centre et les bords. Si un tel objectif n’est pas disponible, appliquez une correction de champ plat aux images (voir étape 7). Pour suivre ce protocole, utilisez un microscope à fluorescence grand champ équipé d’une lentille à air 20x NA 0,4 avec une profondeur de champ = 8 μm.
  3. Lors de l’acquisition d’images, couvrez la zone centrale de la parabole à l’aide de filtres appropriés pour le fluorophore utilisé. Prenez des images en fond clair en mode lumière transmise.
    REMARQUE : Les images en fond clair sont importantes pour le déplacement des cellules sur la grille à l’étape 4.6.
  4. Placez le plat avec les cellules dans un réfrigérateur à 4 °C jusqu’à l’étape 4.4.
  5. Reconstruisez la zone numérisée à partir des images individuelles en mosaïque les images individuelles enregistrées.
  6. Transférez les données d’image de la coloration d’ADN fluorescente sur un ordinateur qui exécute le logiciel open source CellProfiler4.2.120.
  7. Si une correction en champ plat des images de fluorescence est nécessaire, générez une image de référence du microscope utilisé à partir des images enregistrées. Ouvrez le pipeline Illumination Correction.cpproj (inclus dans le fichier supplémentaire 1) ; Observez que le pipeline apparaît sous la forme d’une séquence à l’écran dans laquelle vous pouvez cliquer sur différentes étapes. Faites glisser et déposez les images dans le champ désigné dans les images de la première étape du pipeline.
    REMARQUE : Assurez-vous d’exclure toutes les données autres que les images dans les fichiers répertoriés à l’aide des options de filtrage dans la partie inférieure de la fenêtre.
  8. Dans la dernière étape du pipeline de correction de l’éclairage, cliquez sur Enregistrer les images pour définir un emplacement où les images de référence seront stockées, puis cliquez sur le bouton Analyser les images .
  9. Ouvrez le pipeline CellCycleAnalysis.cpproj (inclus en tant que fichier supplémentaire 2). Faites glisser et déposez les images enregistrées à l’étape 3.3 (voir la figure 4A à titre d’exemple), y compris l’image de référence (étape 3.8), dans le champ désigné à la première étape Images du pipeline.
    REMARQUE : Assurez-vous d’exclure toutes les données autres que les images dans les fichiers répertoriés à l’aide des options de filtrage dans la partie inférieure de la fenêtre.
  10. À l’étape CorrectIlluminationApply du pipeline, choisissez l’image de référence dans le menu déroulant en sélectionnant la fonction Sélectionner l’éclairage.
  11. Dans la dernière étape du pipeline d’analyse du cycle cellulaire, définissez un emplacement où l’image de référence a été stockée à l’étape 3.7 et cliquez sur le bouton Analyser les images pour commencer à mesurer en masse les intensités de fluorescence intégrées de tous les noyaux dans les images enregistrées à l’étape 3.3.
    REMARQUE : CellProfiler4.2.1 générera un fichier texte « CellCycleAnalysis_Nuclei.txt », qui contient les données de chaque noyau mesuré (Image, ObjectID, intensité de fluorescence intégrée, Coordonnées de l’image) au format CSV.
  12. Assurez-vous que l’élément DisplayHistogram du pipeline est coché comme actif.
  13. Notez les intensités de fluorescence intégrées dans l’histogramme pour les pics G1 et G2 (voir la figure 4B à titre d’exemple) et entrez les intervalles autour d’eux dans les éléments FilteredObjects du pipeline. Activez les éléments du pipeline en cliquant sur les cases à cocher.
  14. Activez les éléments de pipeline DisplayDataOnImage correspondants pour générer une image mettant en évidence les cellules dans la phase G1 ou G2 et exécutez à nouveau le pipeline (voir la figure 4C à titre d’exemple).
  15. Choisissez jusqu’à cinq cellules représentant la phase du cycle cellulaire souhaitée à partir de l’image générée dans la zone marquée de la chambre d’observation et essayez de déplacer les cellules sur le microscope SMLM.
    REMARQUE : Étant donné que deux lignées cellulaires dont la taille du génome est inconnue sont utilisées ici, les tailles du génome ont été déterminées en comparant les pics G1 d’une lignée cellulaire de fibroblastes humains aux pics G1 des cellules HeLa et C3H10T1/2. Les histogrammes et la relation proportionnelle entre leurs tailles de génome peuvent être visualisés dans la figure supplémentaire S1.

4. SMLM-fBALM

REMARQUE : Bien que la somme nette d’oxygène dans ces réactions biochimiques combinées soit nulle, il est recommandé d’effectuer la réaction dans une boîte qui n’est pas scellée, car des concentrations limitées d’oxygène peuvent ralentir la production de D-glucono-1,5-lactone. La concentration croissante de D-glucono-1,5-lactone abaisse progressivement le pH, ce qui est nécessaire car une baisse immédiate du pH modifiera l’ultrastructure de l’échantillon.

  1. Préparez 1 mL du tampon d’imagerie en mélangeant les ingrédients suivants : 900 μL de glucose (1 g/mL de glucose dans 1x DPBS), 50 μL de glucose oxydase (0,5 mg/mL dans 1x DPBS) et 50 μL de catalase (40 μg/mL dans 1x DPBS).
  2. Retirez le 1x DPBS de l’échantillon à l’aide d’une pipette et ajoutez 1 ml du tampon d’imagerie dans la boîte contenant les cellules.
  3. Montez la parabole sur la platine d’un microscope compatible SMLM. Utilisez un objectif à grande ouverture numérique et un grossissement optique élevé.
  4. Localisez l’un des noyaux choisis (à partir de l’étape 3.15) à l’aide du système de coordonnées de l’antenne et centrez-le dans le champ de vision de la caméra.
    REMARQUE : La réaction enzymatique prend ~60-180 min jusqu’à ce que le pH correct pour la méthode fBALM soit atteint et facilite le clignement approprié. Il est recommandé de monter la parabole d’observation dès que possible afin de laisser suffisamment de temps à l’échantillon pour s’adapter à la température de l’instrument, car les changements de température peuvent entraîner une dérive axiale. Assurez-vous que la température dans la pièce où se trouve le microscope SMLM est stable tout au long de la mesure.
  5. Déterminez la hauteur du noyau en changeant la mise au point à l’aide du moteur z du microscope et en enregistrant la position des limites supérieure et inférieure.
  6. À différents moments, vérifiez le bon clignotement produit par le processus fBALM en augmentant la puissance du laser. Une fois que l’échantillon montre un clignement stochastique correct, commencez l’acquisition de la série d’images nécessaire à la reconstruction du SMLM super-résolu.
    REMARQUE : Le microscope utilisé pour le fBALM doit être équipé de lasers d’excitation adaptés à l’excitation du fluorophore utilisé et capables de générer des densités de photons suffisamment élevées pour garantir un nombre suffisant de photons par image. Testez-le dans une expérience pilote avant toutes les autres expériences.
  7. Une fois que le clignotement correct du processus fBALM a été assuré, commencez l’acquisition de la série d’images en utilisant un temps d’exposition de 50 ms, ce qui donne une fréquence d’images de ~20 ips.
  8. Prenez une pile en Z à travers le noyau (autour de la section médiane) avec des intervalles de pas de 200 nm et seulement 500 images par section optique légère. De retour à la section médiane, prenez une série d’images de 50 000 images pour collecter suffisamment d’événements de clignement pour une bonne reconstruction des détails structurels avec une grande précision de localisation (cela prendra ~45 min).
    REMARQUE : L’empilement z est important pour déterminer la fraction de la section médiane du signal d’ADN par rapport à l’ensemble du noyau. Assurez-vous que la taille de pixel effective est bien adaptée au SMLM22 et que le signal de la caméra ne sature pas le capteur.
  9. Assurez-vous que les exigences suivantes sont respectées
    1. Assurez-vous que l’ordinateur d’acquisition dispose de suffisamment d’espace disque, car, en fonction du nombre et de la taille des images 16 bits, la taille des fichiers des piles d’images peut devenir assez importante.
    2. Assurez-vous que l’ordinateur exécutant le logiciel d’acquisition peut gérer un système de fichiers sur le périphérique de stockage utilisé capable de gérer des fichiers de grande taille (>4 Go) et que le taux de transfert vers le périphérique de stockage est suffisamment élevé pour écrire les fichiers en temps réel lors de l’enregistrement direct des données d’image sur le périphérique de stockage.
    3. Lors de l’enregistrement des données après l’acquisition de l’image, assurez-vous que l’ordinateur est équipé d’une mémoire vive suffisante (par exemple, 64 Go).

5. Préparation et enregistrement d’une parabole avec des billes fluorescentes pour l’étalonnage z du microscope SMLM

REMARQUE : Pour un étalonnage axial correct des lentilles astigmatiques du microscope afin d’attribuer des emplacements corrects le long de l’axe optique, l’enregistrement d’empilements z de billes fluorescentes de 100 nm doit être envisagé.

  1. Diluez des billes à l’échelle 1:10 000 dans 1x DPBS et ensemencez des billes de 100 nm dans le même type de plat que celui utilisé pour les mesures SMLM.
    REMARQUE : N’utilisez que la meilleure qualité optique et les spécifications telles que les lamelles #1.5.
  2. Montez la parabole d’étalonnage sur le microscope ; Enregistrez des piles d’images à travers le plan focal des billes (~1,5 μm au total ; pas de 10 nm utilisés ici)15.
  3. Transférez les données vers l’ordinateur d’analyse des données.
    REMARQUE : Ne stockez pas et n’utilisez pas les lames d’étalonnage pendant une longue période.

6. Traitement des données SMLM

REMARQUE : Le plug-in ImageJ23 « ThunderSTORM »24 a été utilisé pour l’enregistrement des localisations (par exemple, conversion des points clignotants dans la pile d’images en une liste contenant les coordonnées de localisation, le numéro d’image, etc.). ImageJ ou Fiji25 fonctionne sur tous les principaux systèmes d’exploitation de bureau (Linux/Windows/macOS) et peut être téléchargé et utilisé gratuitement.

  1. Pour utiliser ThunderSTORM aux FidjI, assurez-vous d’ajouter le site de mise à jour du Hohlbein Lab sous AIDE | Mise à jour | Gérez les sites de mise à jour, cochez la case du laboratoire Hohlbein et redémarrez Fidji. Assurez-vous que le programme a accès à suffisamment de mémoire.
    REMARQUE : Les données de l’image doivent être dans un format de fichier qui peut être lu par ImageJ/Fiji. Lorsque vous enregistrez les données sur un système commercial standard, ouvrez directement les données à l’aide du plug-in Bio-Formats pour ImageJ (qui est fourni automatiquement avec Fiji). Dans ce cas, un script MATLAB h52tif.m (fourni sur la page GitHub mentionnée au début du protocole) a été utilisé pour convertir les données enregistrées enregistrées par notre configuration personnalisée du format hdf5 au format TIFF.
    1. En fonction de la quantité de mémoire disponible sur le système utilisé et du nombre d’images à enregistrer, divisez les données en plusieurs sous-piles pour éviter de manquer de mémoire.
      REMARQUE : Dans ce qui suit, les paramètres utilisés pour l’extraction des données affichées dans la section des résultats sont utilisés. Pour une explication plus détaillée des paramètres de ThunderSTORM, reportez-vous aux tutoriels ThunderSTORM, disponibles en ligne.
  2. Optimisez les paramètres de détection des signaux clignotants en adaptant les paramètres de ThunderSTORM en fonction des conditions d’enregistrement souhaitées. Cliquez sur ThunderSTORM | Exécutez l’analyse, choisissez Configuration de la caméra et entrez la taille de pixel correcte des données d’image, le nombre A/N, l’efficacité quantique de la caméra utilisée, le niveau de base et le gain EM (pour cette configuration, taille de pixel : 65 nm, nombre A/N : 0,64, efficacité quantique : 0,8).
  3. Ensuite, choisissez l’algorithme pour déterminer les coordonnées de localisation en ajustant les signaux clignotants. Dans la section Filtrage d’image , utilisez le filtre d’ondelettes (B-Spline) avec une échelle B-Spline d’ordre 3 et une échelle B-Spline 2.0. Pour les autres paramètres, définissez la méthode de localisation approximative des molécules sur Maximum local, le seuil d’intensité de crête sur 2*std(Wave.F1) et la connectivité sur 8-neighborhood. Dans la section Localisation des molécules sous les pixels , choisissez PSF : Gaussienne intégrée, Rayon d’ajustement [px] : 3, Méthode d’ajustement : Vraisemblance maximale et Sigma initial [px] : 1,6.
  4. Exécutez le plug-in pour créer une table contenant une entrée pour chaque localisation détectée et ses propriétés. Enregistrez le tableau sur le disque dur.
  5. Si plusieurs piles d’images doivent être analysées ou si les piles d’images doivent être divisées en plusieurs piles (par exemple, pour permettre l’analyse de grands ensembles de données ou si l’ordinateur d’analyse de données ne dispose pas de beaucoup de mémoire), automatisez la détection de localisation en exécutant une macro.
  6. Si les données d’acquisition doivent être partitionnées en plusieurs piles d’images, concaténez les tables de localisation dans ThunderSTORM en important un fichier après l’autre. Assurez-vous que l’option Ajouter à la table actuelle du menu Importer est activée et que le numéro de départ correct est utilisé pour éviter d’écraser les localisations dans la table.
  7. Une fois que la table de localisation complète a été générée, vérifiez le résultat en reconstruisant l’image à partir des emplacements de la table de résultats. Appuyez sur le bouton Visualisation dans la fenêtre des résultats de ThunderSTORM et attendez que l’image reconstruite (par exemple, l’histogramme des localisations) apparaisse.
  8. Vérifiez l’image reconstruite pour des problèmes tels que la dérive latérale et d’autres artefacts d’imagerie. Mesurez et corrigez la dérive dans le sous-menu Dérive en déterminant la corrélation croisée des sous-sections additionnées de la pile de données (utilisée ici) ou en utilisant des marqueurs repères dans l’échantillon. Après avoir appuyé sur le menu >> , entrez 5 cases et le facteur de grossissement (6,5 dans ce protocole). Attendez qu’une fenêtre apparaisse indiquant les dérives x et y.
    REMARQUE : Les premières images après l’enregistrement peuvent encore souffrir d’une forte fluorescence de fond (tout en amenant les fluorophores dans l’état sombre) ; par conséquent, il peut être nécessaire d’exclure les premières centaines d’images de l’analyse (par exemple, tapez « frame >500 » dans le champ Filtre de la fenêtre principale de ThunderSTORM).
  9. Pour éviter de surcompter les signaux visibles sur plusieurs trames consécutives, appliquez la fusion aux données de localisation à l’aide d’un rayon qui tient compte de la précision de localisation moyenne (20 nm ici), de 1 trame sombre et de 0 trame maximale (aucune restriction sur le temps de marche maximal d’une molécule).
  10. Si seule une section ultramince optique à lumière mince doit être analysée, excluez de l’ensemble de données toutes les localisations au-dessus et au-dessous du plan focal. Tout d’abord, recherchez le point dans z qui contient le plus de localisation en appuyant sur Tracer l’histogramme dans la fenêtre contenant la table des résultats, puis ignorez les localisations 50 nm au-dessus et en dessous de ce point à l’aide de la commande de filtrage :
    Z > « Pic de l’histogramme » - 50 & Z < « Pic de l’histogramme » + 50
  11. Pour déterminer la fraction d’ADN dans la section enregistrée, déterminez les localisations dans chaque plan de la pile d’images (épaisseur 200 nm ; 100 nm de chaque côté) enregistrées à l’étape 4.7.1. Ouvrez la première table des résultats de localisation de la pile en choisissant Plug-ins | OrageORAGE | Importation/exportation | Importez les résultats et filtrez chaque tranche enregistrée à 200 nm. Pour cela, cliquez sur Appliquer après avoir tapé dans le champ de filtre :
    Z > -100 et Z < 100
  12. Cliquez sur Visualisation et choisissez l’option Histogrammes pour générer une image de chaque tranche. Enregistrez l’image résultante dans un dossier au format TIFF. Fermez toutes les images ouvertes. Répétez cette opération pour tous les plans de l’image.
  13. Ouvrez toutes les tranches et combinez-les à l’aide de Image | Piles | Images à empiler. Choisir une image | Piles | Z-Project et choisissez l’option Somme . Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement dans ImageJ (Analyser | Outils | ROI-Manager) ; Ensuite, choisissez l’outil de sélection de polygone dans la barre d’outils ImageJ de la fenêtre principale d’ImageJ et tracez le contour du noyau. Cliquez sur Ajouter dans le gestionnaire de retour sur investissement.
    1. Cliquez sur Analyser | Définissez les mesures et sélectionnez Densité intégrée. Cliquez sur Analyser | Mesurer. Dans ThunderSTORM, ouvrez la table des résultats du plan central comme décrit ci-dessus et filtrez-le jusqu’à une épaisseur de 100 nm à l’aide de la commande suivante dans le champ de filtre :
      z > -50 et z < 50
  14. Générez un histogramme des localisations filtrées comme décrit ci-dessus, activez le ROI défini en le sélectionnant dans le gestionnaire de ROI et cliquez sur Analyser | Mesurer.
  15. Déterminez la fraction des localisations dans la section médiane de 100 nm d’épaisseur par rapport au nombre total de localisations en divisant les densités intégrées mesurées - le facteur de conversion nécessaire à l’étape 8.2 pour calculer les densités absolues d’ADN.
    REMARQUE : La teneur en ADN est proportionnelle au nombre de localisations. Pour estimer la fraction d’ADN dans l’image imageée à super-résolution (section médiane), il suffit donc de déterminer le nombre total de localisations dans le volume de l’ensemble du noyau et de déterminer le nombre total de localisations dans la section d’intérêt. Cela peut être accompli en générant des histogrammes 2D des localisations.

7. Étalonnage Z du microscope SMLM

  1. Ouvrez les piles d’images enregistrées dans la section 5 aux Fidji.
  2. Dans le menu du plugin ThunderSTORM, sélectionnez le sous-menu étalonnage 3D | Calibrage de l’objectif cylindrique.
  3. Entrez la taille de pas utilisée pour enregistrer les données d’étalonnage (10 nm) et définissez la zone de la pile d’images qui sera utilisée pour l’étalonnage.
  4. Spécifiez un emplacement pour enregistrer le fichier d’étalonnage.
  5. Utilisez les données d’étalonnage dans la boîte de dialogue Exécuter l’analyse en sélectionnant PSF : Elliptique gaussienne (astigmatisme 3D) dans le panneau Localisation des molécules en sous-pixel et en ajustant le chemin d’accès au fichier d’étalonnage créé dans la section 5.

8. Tessellation de Voronoï

REMARQUE : Une fois la table de localisation générée et nettoyée, passez à la dernière étape de l’analyse de l’image, la tessellation de Voronoï. Utilisez MATLAB 2021 pour cette étape ; les scripts MATLAB font partie du progiciel « Localization Analyzer for Nanoscale Distributions » (LAND) et peuvent être téléchargés à partir des liens de la Table des matériaux. À l’instar de l’enregistrement des données et de la génération de la table de localisation, il est important d’utiliser un système bien équipé en mémoire et en puissance de traitement. Le système utilisé pour générer les images de cette publication était équipé de 128 Go de RAM et d’un processeur Intel i9 à 9 cœurs.

  1. Convertissez la table de localisation ThunderSTORM du format .csv au format Orte en exécutant le script MATLAB « TS2Orte.m », qui transforme la table de localisation en matrice MATLAB et l’enregistre au format « .mat ».
  2. Une fois que les données sont dans le bon format, commencez les préparatifs pour la tessellation de Voronoï et le calcul de la densité de l’ADN. Calculez le facteur de conversion en divisant le nombre de paires de bases dans le noyau par le nombre relatif de localisations dans la section imagée par rapport au volume (voir étape 6.15). Allez dans le dossier LAND-Voronoi et dans le sous-dossier /coreAlgorithm, ouvrez le fichier voronoiCluster.m et ajustez le facteur de conversion pour les calculs de densité absolue à la ligne 13.
    REMARQUE : Voir la figure 5 pour un exemple du noyau G1 HeLa ; Un facteur de conversion de 265 a été mesuré.
  3. Éditez le script qui démarre l’analyse « VonoRoi.m ». Ajustez le chemin d’accès aux données de localisation Orte et au dossier de sortie des fichiers de résultats. Dans la liste des coordonnées, spécifiez les coordonnées définissant la zone dans laquelle la tessellation doit être effectuée. Comme le calcul de la tessellation de Voronoï peut prendre beaucoup de temps (en fonction des spécifications de la machine utilisée), définissez plusieurs zones à calculer dans le même jeu de données d’entrée.
  4. Après avoir exécuté le script, recherchez l’image montrant les densités absolues d’ADN ainsi que d’autres fichiers contenant des graphiques montrant l’histogramme de la distribution de la zone et un fichier « densities.mat » contenant les densités de chaque cellule Voronoï calculée dans le dossier de sortie.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le noyau HeLa illustré à la figure 5 a été choisi dans le tableau généré par CellProfiler4.2.1 dans la section 3 pour avoir une intensité de fluorescence intégrée proche du premier pic de l’histogramme illustré à la figure 5 qui représente les noyaux dans la phase G1 . Compte tenu de sa petite taille et de sa structure interne prononcée, il est probable qu’il s’agisse d’un noyau G1 précoce qui est encore en...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article explique comment mesurer les densités absolues d’ADN dans les noyaux de cellules de mammifères à l’aide de SMLM. De plus, nous avons démontré comment déterminer l’étape du cycle cellulaire des cellules cultivées et comment utiliser cette information pour estimer la quantité d’ADN présente dans une section optique ultra-mince légère. La préparation des cellules adhérentes pour la microscopie SMLM fBALM et la façon de traiter les données SMLM pour générer des images microscopiq...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Sandra Ritz de nous avoir permis d’utiliser la plateforme d’imagerie de l’IMB, le Dr Shih-Ya Chen de nous avoir permis d’utiliser son microscope SMLM personnalisé, le Dr Leonard Kubben (IMB) d’avoir fourni des fibroblastes humains, le Dr Christof Niehrs (IMB) d’avoir fourni la lignée cellulaire C3H10T1/2, et le Dr Jan Neumann pour le MATLAB-Script que nous avons modifié pour ce travail. Nous tenons également à remercier la Dre Marion Cremer, le Dr Thomas Cremer et le Dr Christoph Cremer pour leurs discussions fructueuses.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Culture cellulaire
µ ;-Antenne 35 mm, haut Grille-500 Fond en verreIbidi81168
C3H 10T1/2IMB (Laboratoire Niehrs)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSTechnologies de vie16000-044
HelaInstallation de Noyau de Microscopie (IMB)
HFBIMB (Laboratoire Kubben)
L-GlutamineSigma-AldrichG7513
Acides aminés non essentiels et vitamines pour HFB
Sodium PyruvateS8636
Préparation d’échantillon
CatalaseMerck2593710
GlucoseThermoFisher241922500
Glucose oxydaseMerck49180
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127
RNase CocktailThermoFisherAM2286
SYTOX OrangeThermoFisherS11368
Kit d’échantillonnage de microsphères fluorescentes TetraSpeckThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
Logiciel
BioFormatsOpenMicroscopy.orgLogiciels open source https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgLogiciels open source https://cellprofiler.org
Fidjinih.govLogiciels open source https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
TERREnih.govLogiciels open source https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Math Workslogiciel commercial - nécessite une « boîte à outils de traitement d’image »
R v.4... 0.3r-project.orgLogiciels open source https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3https://zitmen.github.io/thunderstorm/ des logiciels libres
Microscopies :
AF 7000Leica
Leica GSDLeica
SMLM MicroscopeLaboratoire Cremerconstruit sur mesure par le Dr S-Y. Chen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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