Article de méthode

Mesure quantitative en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules tumorales après une transfection d’ARNm synthétique

2.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/64274

⸱

23 juin 2023

 , 
1Children’s Mercy Research Institute, Children’s Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri-Kansas City School of Medicine

Dans cet article

Résumé

De nombreux gènes régulés à la hausse stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales, ce qui entraîne un mauvais pronostic. Il est essentiel de déterminer quels gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Ce protocole présente une méthode permettant d’étudier en temps réel les effets de l’augmentation de l’expression d’un gène sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.

Résumé

Les cellules tumorales sont très mobiles et invasives et présentent des profils d’expression génique altérés. La connaissance de la façon dont les changements dans l’expression des gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales est essentielle pour comprendre les mécanismes de l’infiltration des cellules tumorales dans les tissus sains voisins et les métastases. Auparavant, il a été démontré que l’inactivation des gènes suivie de la mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules tumorales basée sur l’impédance permet d’identifier les gènes nécessaires à la migration et à l’invasion des cellules tumorales. Récemment, les vaccins à ARNm contre le SRAS-CoV-2 ont suscité un intérêt accru pour l’utilisation de l’ARNm synthétique à des fins thérapeutiques. Ici, la méthode utilisant l’ARNm synthétique a été révisée pour étudier l’effet de la surexpression des gènes sur la migration et l’invasion des cellules tumorales. Cette étude démontre qu’une expression génique élevée avec une transfection d’ARNm synthétique suivie d’une mesure en temps réel basée sur l’impédance peut aider à identifier les gènes qui stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Cet article de méthode fournit des détails importants sur les procédures d’examen de l’effet de l’expression modifiée des gènes sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.

Introduction

La motilité des cellules tumorales joue un rôle crucial dans les métastases 1,2. La propagation des cellules tumorales aux tissus sains voisins et éloignés rend le traitement du cancer difficile et contribue à la récidive 3,4. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes de motilité des cellules tumorales et de développer des stratégies thérapeutiques pertinentes. Étant donné que de nombreuses cellules tumorales ont des profils d’expression génique altérés, il est crucial de comprendre quels changements dans le profil d’expression génique conduisent à une altération de la motilité des cellules tumorales 5,6.

Plusieurs tests ont été développés pour mesurer la migration cellulaire in vitro. Certains tests ne fournissent que des informations limitées car ils ne permettent des mesures qu’à des moments précis, tandis que d’autres offrent des informations complètes sur la motilité des cellules tumorales en temps réel7. Bien que bon nombre de ces tests de motilité cellulaire puissent fournir des résultats quantitatifs à un moment donné ou au point final, ils ne fournissent pas d’informations suffisamment détaillées sur les changements dynamiques du taux de migration cellulaire au cours de la période expérimentale. De plus, il peut être difficile d’examiner les changements potentiels dans le taux de migration cellulaire en fonction de la conception expérimentale, des types de cellules et du nombre de cellules. En outre, les effets de traitements non compliqués peuvent être étudiés par la simple quantification des tests de motilité traditionnels, mais une quantification plus sophistiquée peut être nécessaire pour étudier les effets complexes de divers traitements combinés8.

Un instrument de surveillance du courant électrique d’un fond de puits à plaque de microtitration recouvert de microélectrodes a été mis au point9. L’adhérence des cellules à la surface du puits entrave le flux d’électrons, et l’impédance est corrélée à la liaison quantitative et qualitative des cellules. La présence des microélectrodes au fond du puits permet de mesurer l’adhérence, l’étalement et la prolifération des cellules. La présence des microélectrodes sous une membrane microporeuse de la chambre supérieure permet de mesurer la migration et l’invasion des cellules dans la chambre inférieure, la chambre supérieure étant recouverte de protéines de la matrice extracellulaire (MEC) pour permettre l’invasion10.

Auparavant, il a été démontré que les mesures en temps réel basées sur l’impédance de la migration et de l’invasion des cellules tumorales fournissent des données en temps réel pendant toute l’expérience, ainsi que des comparaisons et des quantifications instantanées dans diverses conditions expérimentales11. Dans cet article de méthode, l’inactivation des gènes a été induite pour tester le rôle des protéines d’intérêt dans la migration et l’invasion des cellules tumorales. Étant donné qu’un effet d’inactivation génique à part entière dans les conditions expérimentales testées a pris 3 à 4 jours après l’électroporation avec de petits ARN interférents (siRNAs)8, les cellules ont été replaquées après l’électroporation et récoltées à nouveau 3 jours plus tard pour la mesure en temps réel basée sur l’impédance de la migration et de l’invasion des cellules tumorales.

Les régulateurs CT10 de la kinase (Crk) et Crk-like (CrkL) sont des protéines adaptatrices qui interviennent dans les interactions protéine-protéine en aval de diverses voies kinases du récepteur du facteur de croissance et des voies tyrosine kinase non réceptrices12. Des niveaux élevés de protéines Crk et CrkL contribuent à un mauvais pronostic dans plusieurs cancers humains, y compris le glioblastome13. Cependant, il n’est pas clair comment des protéines Crk et CrkL élevées conduisent à un mauvais pronostic. Par conséquent, il est important de définir l’effet de la surexpression de Crk et de CrkL sur les fonctions des cellules tumorales. Auparavant, une étude de knockdown génique a été réalisée pour démontrer que des niveaux endogènes de protéines Crk et CrkL sont nécessaires à la migration et à l’invasion des cellules de glioblastome8. Ici, un système de dosage modifié a été développé pour traiter l’effet de la surexpression de Crk et CrkL sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.

Récemment, la synthèse in vitro de l’ARNm et ses applications thérapeutiques ont fait l’objet d’un regain d’attention en raison du développement des vaccins à ARNm contre le SRAS-CoV-2 (revue par Verbeke et al.14). En outre, des progrès remarquables ont été réalisés dans l’utilisation de l’ARNm synthétique dans le cancer et d’autres maladies15,16. L’électroporation des cellules est une méthode efficace pour délivrer de l’ARNm synthétique et induire une modification génétique transitoire (revue par Campillo-Davo et al.17), et l’utilisation de l’ARNm synthétique permet une expression génique rapide et efficace dans les fibroblastes immortalisés 18. Cet article de méthode combine la surexpression des gènes à l’aide d’ARNm synthétique avec des analyses cellulaires en temps réel pour étudier la migration et l’invasion des cellules tumorales. Cependant, le schéma expérimental utilisé pour les siRNA ne fonctionne pas avec la transfection d’ARNm synthétique, car le niveau de protéines exogènes augmente rapidement et diminue progressivement lors de la transfection d’ARNm synthétique18. Par conséquent, la méthode a été modifiée pour effectuer l’analyse en temps réel de la migration et de l’invasion cellulaires juste après la transfection sans cultiver davantage les cellules.

Cet article de méthode démontre que la combinaison de mesures en temps réel basées sur l’impédance avec la transfection de cellules tumorales avec des ARNm synthétiques fournit une analyse rapide et complète des effets de la régulation positive des gènes sur la migration et l’invasion des cellules tumorales. Ce document de méthode décrit des procédures détaillées pour mesurer comment la migration et l’invasion des cellules de glioblastome sont affectées par la surexpression de Crk et CrkL. En examinant les effets dépendants de la concentration de l’ARNm synthétique sur la migration des cellules tumorales, l’article décrit clairement comment une augmentation des niveaux de protéines stimule la migration des cellules tumorales. De plus, une approche consistant à faire varier la concentration du gel ECM est présentée pour évaluer les effets des changements dans l’expression des gènes sur l’invasion des cellules tumorales.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Synthèse de l’ARNm

REMARQUE : Pour la synthèse de l’ARNm, tous les réactifs et équipements doivent être spécialement traités pour inactiver les RNases avant utilisation. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.

  1. Linéarisation de l’ADN
    NOTE : Les ADNc de souris de CrkI et de CrkL ont été clonés dans le vecteur d’expression pFLAG-CMV-5a pour ajouter le marqueur épitopique FLAG à l’extrémité C-terminale et sous-clonés dans le vecteur pcDNA3.1/myc-His pour incorporer le promoteur T7, comme décrit précédemment 18,19.
    1. Ajouter 10 μL de tampon de réaction 10x, 1,5 μL de PmeI (10 000 unités/mL) et 10 μg d’ADN plasmidique dans un tube de microcentrifugation pour linéariser l’ADN plasmidique avec l’enzyme de restriction. Ajouter de l’eau sans nucléase pour porter le volume de réaction à 100 μL.
    2. Mélangez en tapotant, essorez et incubez le mélange réactionnel à 37 °C pendant la nuit.
    3. Faire tourner vers le bas et ajouter 5 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 1 μL de protéinase K (20 mg/mL, grade ARN) au mélange réactionnel. Mélanger en tapotant, essorer et incuber à 50 °C pendant 30 min.
    4. Sous la hotte, ajoutez 100 μL de la phase inférieure de phénol :chloroforme :alcool isoamylique au mélange réactionnel plasmidique pour l’extraction. Vortex, puis centrifugation à 18 800 × g pendant 5 min à température ambiante. Déplacez la phase supérieure vers un nouveau tube.
    5. Répétez l’étape 1.1.4 avec chloroforme :alcool isoamylique à 24 :1.
    6. Dans le nouveau tube, porter le volume de réaction à 300 μL en ajoutant 200 μL d’eau sans nucléase, puis ajouter 30 μL d’acétate de sodium 3 M et 600 μL d’éthanol 100 %.
    7. Mélanger par vortex, puis placer à −20 °C pendant 30-60 min pour la précipitation de l’ADN à l’éthanol.
    8. Centrifuger à 18 800 × g pendant 20 min à 4 °C, jeter le surnageant et rincer la pastille avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Répétez la centrifugation pendant 10 minutes, puis retirez complètement le surnageant.
    9. Séchez avec le capuchon ouvert pendant 2 minutes, ajoutez 30 μL d’eau sans nucléase et remettez la pastille d’ADN en suspension.
    10. Déterminer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
    11. Vérifier la taille et la quantité de l’ADN linéarisé à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose.
  2. Synthèse d’ARN à l’aide de l’ARN polymérase T7
    1. Ajouter 2 μL de chacun des 10 μl de tampon de transcription, ATP, GTP, UTP, CTP et T7 et 1 μg d’ADN linéarisé dans un tube de microcentrifugation. Ajouter de l’eau sans nucléase pour porter le volume de réaction à 20 μL.
    2. Mélanger en tapotant, essorer et incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 2 h pour la synthèse de l’ARN.
    3. Essorez, ajoutez 1 μL de DNase (2 U/μL) et incubez à 37 °C pendant 15 min pour éliminer l’ADN matrice.
  3. Précipitation de l’ARN par le chlorure de lithium
    1. Ajouter 10 μL de chlorure de lithium (7,5 M) au mélange réactionnel. Mélanger en tapotant, essorer et incuber le mélange réactionnel à −20 °C pendant 30 min.
    2. Centrifuger à 18 800 × g pendant 20 min à 4 °C, jeter le surnageant et rincer la pastille avec 500 μL d’éthanol à 70 %. Répétez la centrifugation pendant 10 minutes, puis retirez complètement le surnageant.
    3. Sécher avec le capuchon ouvert pendant 2 min, ajouter 30 μL d’eau sans nucléase et remettre en suspension la pastille d’ARN.
  4. Plafonnement
    1. Chauffez l’échantillon d’ARN à 65 °C pendant 10 minutes, puis placez-le sur de la glace pour le refroidir.
    2. Ajouter 5 μL de tampon de bouchage 10x, 10 mM de GTP et 1 mM (10x) de S-adénosylméthionine (SAM), 2 μL chacun d’un mélange d’enzymes de capsulage et d’un mélange d’enzymes O-méthyltransférases, et 1,25 μL d’inhibiteur de la RNase. Mélanger en tapotant, essorer et incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 1 h.
  5. Résidus en poly(A)
    1. Essorez l’échantillon, puis ajoutez 6 μL d’eau sans nucléase, 20 μL de tampon E-PAP 5x, 10 μL de 25 mM MnCl2, 10 μL d’ATP 10 mM et 4 μL d’enzyme de résidus E-PAP poly(A). Mélanger en tapotant, essorer et incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 2 h.
  6. Précipitation du chlorure de lithium et quantification de l’ARNm synthétique
    1. Ajouter 50 μL de chlorure de lithium (7,5 M) et effectuer la précipitation du chlorure de lithium comme décrit aux étapes 1.3.1 à 1.3.3.
    2. Mesurez la concentration de l’ARNm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    3. Vérifier la taille et la quantité d’ARNm à l’aide d’une électrophorèse sur gel au formaldéhyde (1 % à 2 %), à l’agarose (1 %).

2. Revêtement en gel de la matrice extracellulaire (ECM) des plaques d’invasion et de migration cellulaires (CIM)

REMARQUE : Une plaque d’invasion et de migration cellulaire (CIM) est une plaque à 16 puits fabriquée dans le commerce pour l’analyse cellulaire en temps réel basée sur l’impédance. Pour le test d’invasion cellulaire, enduire les plaques CIM de gel ECM, comme décrit précédemment, mais avec quelques modifications11.

  1. Sortez une aliquote de gel ECM du congélateur et conservez-la sur de la glace.
  2. Diluer le gel ECM (10 mg/mL) à une concentration de travail (100 μg/mL) en mélangeant 990 μL de Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco (sans sérum ni antibiotiques) avec 10 μL de gel ECM dans un tube de microcentrifugation. Mélanger par pipetage doux.
  3. Ajouter 60 μL de gel ECM dilué dans chacun des 16 puits de la chambre supérieure de la plaque CIM. Appliquer la méthode de pipetage inversé tout en évitant les bulles d’air20,21.
    REMARQUE : Optimisez la concentration du gel ECM pour chaque lignée cellulaire. Pour les lignées cellulaires de glioblastome, un gel ECM de 0,1 μg/μL à 1 μg/μL a été utilisé pour l’optimisation.
  4. Placez la chambre supérieure de la plaque CIM avec le couvercle de la plaque sur une feuille de plastique protectrice à l’intérieur d’un incubateur de CO2 pendant environ 4 h pour former une couche de gel.
    ATTENTION : Pendant le revêtement de la plaque CIM avec du gel ECM, les électrodes de la chambre supérieure de la plaque CIM ne doivent pas être en contact direct avec les mains de l’expérimentateur ou les surfaces de l’équipement, y compris l’enceinte de sécurité biologique ou l’incubateur de CO2 .

3. Préparation des cellules tumorales

REMARQUE : Tout le matériel de culture cellulaire doit être conservé stérile. Prélever et électroporer les cellules tumorales sous une enceinte de sécurité biologique avec un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, comme décrit précédemment, mais avec quelques modifications11.

  1. Culture des cellules tumorales
    1. Cultiver des cellules U-118MG dans 10 mL de DMEM contenant 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotiques par boîte de culture tissulaire en polystyrène de 100 mm x 20 mm à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 (conditions de culture).
  2. Épuisement sérique des cellules tumorales
    REMARQUE : L’exposition des cellules aux chimioattractants présents dans le FBS doit être réduite au minimum avant les essais de migration et d’invasion cellulaire en utilisant une concentration élevée de FBS.
    1. Retirer l’ancien milieu et ajouter 10 mL de DMEM préchauffé contenant 0,5 % de FBS et 1 % d’antibiotiques par boîte (milieu à faible teneur en sérum).
    2. Répétez l’étape 3.2.1.
    3. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 4 h ou plus.
  3. Prélèvement des cellules tumorales
    1. Retirer l’ancien milieu, ajouter 8 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco préchauffée par boîte, retirer le DPBS, ajouter 0,05 % trypsine-EDTA préchauffée (2 mL/boîte) pour couvrir la surface et incuber dans l’incubateur de CO2 pendant 30 s.
    2. Aspirer soigneusement la trypsine-EDTA, ajouter le milieu à faible teneur en sérum (7 mL/boîte), puis recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 50 mL ou 15 mL.
    3. Aliquotez un petit volume de cellules et utilisez un compteur de cellules automatisé portatif pour compter les cellules.
    4. Calculez le nombre total de cellules et le volume requis pour 10 000 cellules/μL.
    5. Essorez les cellules en les centrifugeant à 100 × g pendant 5 min à température ambiante, aspirez le surnageant, ajoutez le volume calculé de DMEM contenant 0,5 % de FBS (sans antibiotiques) et remettez doucement la pastille cellulaire en suspension.
    6. Transférer 110 μL de la suspension cellulaire, contenant 1,1 million de cellules, dans un tube de microcentrifugation pour chaque traitement.
    7. Répétez l’étape 3.3.6 pour transférer les cellules dans quatre tubes de microcentrifugation pour quatre traitements différents.
      REMARQUE : Une plaque CIM a un total de 16 puits. Concevez quatre traitements différents à des fins de comparaison afin que quatre puits de la plaque CIM puissent être attribués à chaque traitement. Utilisez les cellules électroporées pour les expériences suivantes : analyses par transfert Western (0,3 million de cellules par boîte de culture tissulaire de 35 mm), quatre puits de tests de migration cellulaire en temps réel (0,1 million de cellules/puits) et quatre puits de tests d’invasion cellulaire en temps réel (0,1 million de cellules/puits) pour chaque traitement. Ajustez le nombre de cellules qui doivent être électroporées si le plan expérimental change.

4. Électroporation des cellules tumorales

  1. Pour retirer le milieu, ajoutez 1 mL de DPBS à la suspension cellulaire dans chaque tube, faites tourner la suspension cellulaire trois fois pendant 10 s à chaque fois tout en faisant tourner le tube de 180° toutes les 10 s à l’aide d’une mini-centrifugeuse et retirez le surnageant à l’aide d’une micropipette.
    REMARQUE : Il est important de former une pastille de cellules compacte mais facilement resuspendable.
  2. Ajouter 110 μL de tampon de remise en suspension R à la pastille cellulaire pour obtenir 0,1 million de cellules dans 10 μL.
  3. Ajouter de l’ARNm synthétique à la pastille cellulaire pour obtenir une concentration de 0,2 à 20 ng/μL selon le niveau d’expression souhaité. Mélangez et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire en tapotant ou en pipetant doucement.
    REMARQUE : Utilisez différentes concentrations d’ARNm synthétique, examinez l’expression de la protéine à l’aide de l’analyse Western Blot et déterminez la concentration d’ARNm synthétique qui conduit au niveau d’expression souhaité afin d’étudier la corrélation spécifique entre l’expression de la protéine et les effets biologiques.
  4. Électroporer 10 μL de la suspension cellulaire avec un système d’électroporation à 1 350 V pendant 10 ms avec trois impulsions à chaque fois.
  5. Transférez les cellules électroporées dans un nouveau tube de microcentrifugation contenant 1,1 mL de DMEM contenant 0,5 % de FBS.
  6. Répétez l’électroporation jusqu’à ce que le reste de la suspension cellulaire soit électroporé. Combinez les cellules électroporées dans le tube de microcentrifugation pour obtenir 1,1 million de cellules dans 1,1 mL.
    REMARQUE : Les pointes d’électroporation de 100 μL et de 10 μL peuvent être utilisées pour électroporer un grand volume de cellules, mais les pointes d’électroporation de 10 μL et 100 μL sont incluses dans deux kits distincts et doivent être achetées séparément. Le tampon de remise en suspension R est inclus dans les deux kits.
  7. Une fois toutes les électroporations respectives terminées, remettez doucement en suspension les cellules regroupées.
  8. Plaquer 0,3 million de cellules dans une boîte de culture tissulaire en polystyrène de 35 mm x 10 mm avec 2 mL de DMEM contenant 5 % de FBS, et cultiver les cellules pendant 1 jour dans les conditions de culture pour la préparation du lysat cellulaire total et les analyses par transfert Western.
  9. Conservez le reste des cellules électroporées à température ambiante jusqu’à ce que le système d’analyse cellulaire en temps réel soit prêt.

5. Mise en place de l’analyseur de cellules en temps réel, du programme et des plaques CIM

REMARQUE : Préparez l’analyseur de cellules en temps réel et les deux plaques CIM, comme décrit précédemment11.

  1. Equilibration de l’analyseur de cellules en temps réel
    1. Déplacez l’analyseur de cellules en temps réel dans un incubateur de CO2 plusieurs heures avant utilisation pour équilibrer le système dans les conditions de culture.
  2. Mise en place du programme d’analyse
    1. Ouvrez le programme d’analyse en double-cliquant sur l’icône du logiciel d’analyse cellulaire en temps réel sur le bureau.
    2. Une fois que l’option Configuration du modèle de test par défaut est ouverte, sélectionnez l’option permettant d’exécuter trois tests séparément.
      REMARQUE : Chaque berceau a une fenêtre séparée. Il existe différents onglets pour configurer l’intervalle et la durée de mesure, l’analyse des données et d’autres conditions expérimentales.
    3. Ouvrez chaque berceau en cliquant sur l’onglet Nombre .
    4. Cliquez sur l’onglet Notes de l’expérience , sélectionnez le dossier dans lequel les données seront enregistrées, puis saisissez le nom de l’expérience.
    5. Cliquez sur l’onglet Disposition , configurez des puits quadruplés pour chaque condition de traitement en sélectionnant quatre puits à la fois et en saisissant les informations de l’échantillon, puis cliquez sur Appliquer.
    6. Cliquez sur l’onglet Planification | Ajoutez une étape pour configurer le mode en deux étapes des mesures d’impédance de cellule. Ensuite, cliquez sur Appliquer pour mettre en place la première étape.
    7. Cliquez à nouveau sur Ajouter une étape, entrez 10 min pour l’intervalle et 48 h pour la durée de la migration et de l’invasion, puis cliquez sur Appliquer pour mettre en place la deuxième étape.
      REMARQUE : La première étape prend une mesure de référence unique (un balayage avec un intervalle de 1 minute). La deuxième étape mesure l’impédance de la cellule pour l’expérience (par exemple, 289 balayages avec un intervalle de 10 minutes pendant 48 h) au berceau. Ajustez l’intervalle et la durée en fonction du plan expérimental.
    8. Passez à la station d’accueil suivante et configurez-la en répétant les étapes 5.2.3 à 5.2.7.
  3. Préparation des plaques CIM
    1. Une heure avant le début de la mesure de l’impédance de la cellule, remplissez les puits de la chambre inférieure de la plaque CIM avec 160 μL de DMEM contenant 10 % de sérum ou d’autres chimioattractants.
    2. Assemblez la chambre supérieure qui contient les puits ECM enduits de gel (pour l’invasion) ou les puits non revêtus (pour la migration) avec la chambre inférieure.
    3. Ajouter 50 μL de milieu à faible teneur en sérum dans les puits de la chambre supérieure de la plaque CIM pour le test de migration cellulaire, et placer la plaque CIM dans le berceau du système.
    4. Cliquez sur l’onglet Message et assurez-vous que le message Connexions correctes s’affiche. La plaque CIM est maintenant prête pour l’expérience.
    5. Préincuber la plaque CIM assemblée dans l’incubateur de CO2 pendant 30 à 60 minutes avant l’analyse cellulaire en temps réel pour acclimater la plaque CIM aux conditions de culture.

6. Analyse des cellules en temps réel et exportation des données

REMARQUE : Effectuez une lecture de référence, l’ensemencement des cellules, la mesure de l’impédance des cellules et l’exportation des données comme décrit précédemment11.

  1. Lecture de la ligne de base
    REMARQUE : La ligne de base doit être lue après l’acclimatation de la plaque CIM et avant que les cellules ne soient ajoutées aux puits de la chambre supérieure.
    1. Cliquez sur le bouton Démarrer pour chaque station d’accueil. Lorsque la fenêtre Enregistrer sous s’affiche, enregistrez le fichier expérimental pour effectuer la lecture de référence.
  2. Ensemencement cellulaire
    1. Retirez la plaque CIM du support et placez-la dans l’enceinte de sécurité biologique sur le support de plaque.
    2. Ajouter 100 μL (contenant 100 000 cellules) de cellules électroporées dans les puits de la chambre supérieure de la plaque CIM selon le programme de l’unité de contrôle. Appliquez la méthode de pipetage inversé tout en évitant les bulles d’air.
    3. Laissez la plaque CIM sous l’enceinte de sécurité biologique pendant 30 minutes à température ambiante pour vous assurer que les cellules se répartissent uniformément sur le fond du puits.
  3. Mesure de l’impédance des cellules
    1. Replacez la plaque CIM entièrement assemblée sur le berceau respectif. Cliquez sur le bouton Démarrer de la station d’accueil pour commencer la mesure de l’impédance de la cellule pour la deuxième étape.
    2. Cliquez sur l’onglet Tracé , puis cliquez sur le bouton Ajouter tout , et sélectionnez les cases Moyenne et STD DEV pour visualiser les données en temps réel.
      REMARQUE : L’option de traçage par défaut est Temps pour l’axe des x et Index des cellules pour l’axe des y. La section Sélection de tracé permet à l’utilisateur de sélectionner d’autres options pour l’axe des ordonnées : Index de cellule normalisé ou Index de cellule delta. Une fois le balayage final effectué, l’expérience est terminée et les résultats sont enregistrés automatiquement.
  4. Exportation des données pour analyse
    1. Cliquez sur l’onglet Plot (Tracé ) et sélectionnez les cases Average (Moyenne ) et STD DEV (DEV ) pour copier les données de chaque puits individuellement.
    2. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la zone de tracé et sélectionnez Copier les données au format liste.
    3. Ouvrez une feuille de calcul vide, collez les données, puis enregistrez le fichier.
    4. Revenez au programme d’analyse, cliquez sur l’onglet Plaque pour chaque station d’accueil, puis sélectionnez Relâcher pour fermer l’expérience pour la station d’accueil.
    5. Revenez au fichier de feuille de calcul et ajustez l’heure des données brutes de sorte que l’heure de début de la deuxième étape devienne l’heure de début réelle de la mesure.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Les protéines Crk et CrkL jouent un rôle important dans la motilité de nombreux types de cellules, notamment les neurones22, les lymphocytes T23, les fibroblastes 18,19 et une variété de cellules tumorales13. Étant donné que les protéines Crk et CrkL ont été rapportées comme étant élevées dans le glioblastome24,25,26, les effets de la surexpression de CrkI, une variant...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La migration et l’invasion sont des caractéristiques importantes des cellules tumorales. La mesure de la motilité des cellules tumorales et la compréhension du mécanisme sous-jacent qui contrôle la motilité des cellules tumorales fournissent des informations essentielles sur les interventions thérapeutiques 2,27. Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier la migration cellulaire7. Le test de cicatrisation des plaies à l’aide de ra...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le Medical Writing Center de Children’s Mercy Kansas City pour l’édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation A.R.T. de Natalie (à T.P.) et par une subvention du conseil consultatif des partenaires de MCA du Children’s Mercy Hospital (CMH) et du Centre de cancérologie de l’Université du Kansas (KUCC) (à T.P.).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00Système d’imagerie sur gel d’agarose
&alpha ;-tubulineanticorps SigmaT9026Utilisé pour détecter la protéine &alpha ;-tubuline (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16Agilent Technologies, Inc5665825001Plaques d’invasion et de migration cellulaires
Anticorps CrkBD Biosciences610035Utilisé pour détecter les protéines CrkI et CrkII (dilution 1:1 500)
Anticorps CrkLSanta Cruzsc-319Utilisé pour détecter la protéine CrkL (dilution 1:1 500)
Dulbecco' s Aigle modifié' s Milieu (DMEM)ATCC302002Milieu de culture cellulaire
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Corning21-031-CVTampon utilisé pour laver les cellules
Sérum fœtal bovin (FBS)HycloneSH30910.03Complément de milieu de culture
Heracell VIOS 160i Incubateur CO2Thermo Scientific51030285Incubateur CO2
IRDye 800CW chèvre anticorps secondaire IgG anti-sourisLi-Cor926-32210Anticorps secondaire pour l’analyse par transfert Western (dilution 1:10 000)
IRDye 800CW anticorps secondaire IgG anti-lapinLi-Cor926-32211Anticorps secondaire pour l’analyse par transfert Western  ; (dilution 1:10 000)
Chlorure de lithium  ;InvitrogenAM9480Utilisé pour la précipitation de l’ARN
Matrice matrigelCorning354234Matrice extracellulaire (ECM)
Gel MEGAscript T7 Kit de transcriptionInvitrogenAM1334Utilisé pour la synthèse de l’ARN
Marqueurs d’ARN millénairesInvitrogenAM7150Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de formaldéhyde
Mini centrifugeuseISC BioExpressC1301P-ISCUtilisé pour faire tourner les cellules
Cerveau de souris QUICK-Clone ADNcTaKaRa637301Source des gènes (inserts) pour le clonage
NanoQuantTecanM200PROSystème de quantification des acides nucléiques
Système d’électroporation au néon  ;ThermoFisher ScientificMPK5000Système d’électroporation1
Neon système de transfection 10 µ ; L kitThermoFisher ScientificMPK1025Kit d’électroporation
Neon transfection system 100 µ ; L kitThermoFisher ScientificMPK10096Kit d’électroporation
Tampon de gel dénaturant NorthernMaxInvitrogenAM8676Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de formaldéhyde
NorthernMax Colorant de charge de formaldéhydeInvitrogenAM8552Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de formaldéhyde
Tampon de fonctionnement NorthernMaxInvitrogenAM8671Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de formaldéhyde
Eau sans nucléaseTeknovaW3331Utilisé pour diverses réactions lors de la synthèse de l’ARNm
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager pour l’analyse par transfert Western
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020Vecteur dans lequel les inserts (ADNc CrkI et CrkL de souris) ont été clonés
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Source de l’épitope FLAG : étiquette
Phénol : chloroforme : alcool isoamyliqueSigmaP2069Utilisé pour l’extraction de l’ADN
PmeINew England BioLabsR0560LUtilisé pour linéariser les plasmides pour la synthèse de l’ARNm
Kit de résidus Poly(A)InvitrogenAM1350Utilisé pour la réaction de la queue poly(A)
Boîte de culture de tissus en polystyrène (style 100 x 20 mm)Corning353003Utilisé pour la culture de cellules avant la transfection
Boîte de culture tissulaire en polystyrène (style 35 x 10 mm)Corning353001Utilisé pour la culture de cellules transfectées
Protéinase KInvitrogen25530049Utilisé pour éliminer les protéines dans le mélange réactionnel
Purificateur Axiom Classe II, Type C1Labconco Corporation304410001Enceinte de biosécurité pour la manipulation stérile des cellules
Tampon de remise en suspension RThermoFisher ScientificUn tampon inclus dans les kits d’électroporation, MPK1025 et MPK10096. Le tampon est utilisé pour réactiver les cellules avant l’électroporation, et sa composition est une information exclusive.
RNaseZapInvitrogenAM9780Solution de décontamination de l’ARN
ScepterMilliporeC85360Compteur de cellules automatisé portable  ;
Kit ScriptCap 2'-O-méthyltransféraseCellscriptC-SCMT0625Utilisé pour la réaction de bouchage
ScriptCap m7G Système de bouchageCellscriptC-SCCE0625Utilisé pour la réaction de bouchage
Solution de dodécylsulfate de sodiumInvitrogen15553-035Détergent utilisé pour la réaction de protéinase K
Centrifugeuse Sorvall Legend XTThermo Scientific75004532Centrifugeuse de paillasse pour la rotation des cellules
Trypsine-EDTAGibco25300-054Utilisée pour la dissociation des cellules
U-118MG  ;ATCCHTB15Une lignée cellulaire adhérente dérivée d’un patient atteint de glioblastome humain
Anticorps de vinculineSigmaV9131Utilisé pour détecter la protéine de vinculine (dilution 1:100 000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Instrument utilisé pour l’analyse
cellulaire en temps réel1Les paramètres d’électroporation et d’autres informations connexes pour diverses lignées cellulaires sont disponibles sur la page d’accueil du fabricant (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html ?).

Références

  1. Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
  2. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  3. Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92(2020).
  4. Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
  5. Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
  6. Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
  7. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  8. Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390(2021).
  9. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
  10. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  11. Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997(2020).
  12. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  13. Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739(2021).
  14. Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
  15. Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52(2021).
  16. Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
  17. Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396(2021).
  18. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  19. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  20. Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958(1984).
  21. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  22. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  23. Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
  24. Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
  25. Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
  26. Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  27. Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
  28. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
  29. Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
  30. Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
  31. Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
  32. Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422(2022).
  33. Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
  34. Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
  35. Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
  36. Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
  37. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  38. Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Invasion cellulaireanalyse cellulaire en temps r elmesure de l imp dancelectroporationsurexpression g niqueessai de gel de MECcellules de glioblastomeessai de migration cellulaire

Articles connexes