Article de méthode
De nombreux gènes régulés à la hausse stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales, ce qui entraîne un mauvais pronostic. Il est essentiel de déterminer quels gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Ce protocole présente une méthode permettant d’étudier en temps réel les effets de l’augmentation de l’expression d’un gène sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.
Les cellules tumorales sont très mobiles et invasives et présentent des profils d’expression génique altérés. La connaissance de la façon dont les changements dans l’expression des gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales est essentielle pour comprendre les mécanismes de l’infiltration des cellules tumorales dans les tissus sains voisins et les métastases. Auparavant, il a été démontré que l’inactivation des gènes suivie de la mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules tumorales basée sur l’impédance permet d’identifier les gènes nécessaires à la migration et à l’invasion des cellules tumorales. Récemment, les vaccins à ARNm contre le SRAS-CoV-2 ont suscité un intérêt accru pour l’utilisation de l’ARNm synthétique à des fins thérapeutiques. Ici, la méthode utilisant l’ARNm synthétique a été révisée pour étudier l’effet de la surexpression des gènes sur la migration et l’invasion des cellules tumorales. Cette étude démontre qu’une expression génique élevée avec une transfection d’ARNm synthétique suivie d’une mesure en temps réel basée sur l’impédance peut aider à identifier les gènes qui stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Cet article de méthode fournit des détails importants sur les procédures d’examen de l’effet de l’expression modifiée des gènes sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.
La motilité des cellules tumorales joue un rôle crucial dans les métastases 1,2. La propagation des cellules tumorales aux tissus sains voisins et éloignés rend le traitement du cancer difficile et contribue à la récidive 3,4. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes de motilité des cellules tumorales et de développer des stratégies thérapeutiques pertinentes. Étant donné que de nombreuses cellules tumorales ont des profils d’expression génique altérés, il est crucial de comprendre quels changements dans le profil d’expression géni....
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1. Synthèse de l’ARNm
REMARQUE : Pour la synthèse de l’ARNm, tous les réactifs et équipements doivent être spécialement traités pour inactiver les RNases avant utilisation. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.
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Les protéines Crk et CrkL jouent un rôle important dans la motilité de nombreux types de cellules, notamment les neurones22, les lymphocytes T23, les fibroblastes 18,19 et une variété de cellules tumorales13. Étant donné que les protéines Crk et CrkL ont été rapportées comme étant élevées dans le glioblastome24,25,26, les effets de la surexpression de CrkI, une variant.......
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La migration et l’invasion sont des caractéristiques importantes des cellules tumorales. La mesure de la motilité des cellules tumorales et la compréhension du mécanisme sous-jacent qui contrôle la motilité des cellules tumorales fournissent des informations essentielles sur les interventions thérapeutiques 2,27. Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier la migration cellulaire7. Le test de cicatrisation des plaies à l’aide de ra.......
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Les auteurs remercient le Medical Writing Center de Children’s Mercy Kansas City pour l’édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation A.R.T. de Natalie (à T.P.) et par une subvention du conseil consultatif des partenaires de MCA du Children’s Mercy Hospital (CMH) et du Centre de cancérologie de l’Université du Kansas (KUCC) (à T.P.).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Système d’imagerie sur gel d’agarose |
| &alpha ;-tubuline | anticorps Sigma | T9026 | Utilisé pour détecter la protéine &alpha ;-tubuline (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Plaques d’invasion et de migration cellulaires |
| Anticorps Crk | BD Biosciences | 610035 | Utilisé pour détecter les protéines CrkI et CrkII (dilution 1:1 500) |
| Anticorps CrkL | Santa Cruz | sc-319 | Utilisé pour détecter la protéine CrkL (dilution 1:1 500) |
| Dulbecco' s Aigle modifié' s Milieu (DMEM) | ATCC | 302002 | Milieu de culture cellulaire |
| Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Tampon utilisé pour laver les cellules |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Complément de milieu de culture |
| Heracell VIOS 160i Incubateur CO2 | Thermo Scientific | 51030285 | Incubateur CO2 |
| IRDye 800CW chèvre anticorps secondaire IgG anti-souris | Li-Cor | 926-32210 | Anticorps secondaire pour l’analyse par transfert Western (dilution 1:10 000) |
| IRDye 800CW anticorps secondaire IgG anti-lapin | Li-Cor | 926-32211 | Anticorps secondaire pour l’analyse par transfert Western ; (dilution 1:10 000) |
| Chlorure de lithium ; | Invitrogen | AM9480 | Utilisé pour la précipitation de l’ARN |
| Matrice matrigel | Corning | 354234 | Matrice extracellulaire (ECM) |
| Gel MEGAscript T7 Kit de transcription | Invitrogen | AM1334 | Utilisé pour la synthèse de l’ARN |
| Marqueurs d’ARN millénaires | Invitrogen | AM7150 | Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de formaldéhyde |
| Mini centrifugeuse | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Utilisé pour faire tourner les cellules |
| Cerveau de souris QUICK-Clone ADNc | TaKaRa | 637301 | Source des gènes (inserts) pour le clonage |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Système de quantification des acides nucléiques |
| Système d’électroporation au néon ; | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Système d’électroporation1 |
| Neon système de transfection 10 µ ; L kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Kit d’électroporation |
| Neon transfection system 100 µ ; L kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Kit d’électroporation |
| Tampon de gel dénaturant NorthernMax | Invitrogen | AM8676 | Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de formaldéhyde |
| NorthernMax Colorant de charge de formaldéhyde | Invitrogen | AM8552 | Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de formaldéhyde |
| Tampon de fonctionnement NorthernMax | Invitrogen | AM8671 | Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de formaldéhyde |
| Eau sans nucléase | Teknova | W3331 | Utilisé pour diverses réactions lors de la synthèse de l’ARNm |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager pour l’analyse par transfert Western | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | Vecteur dans lequel les inserts (ADNc CrkI et CrkL de souris) ont été clonés |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source de l’épitope FLAG : étiquette |
| Phénol : chloroforme : alcool isoamylique | Sigma | P2069 | Utilisé pour l’extraction de l’ADN |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Utilisé pour linéariser les plasmides pour la synthèse de l’ARNm |
| Kit de résidus Poly(A) | Invitrogen | AM1350 | Utilisé pour la réaction de la queue poly(A) |
| Boîte de culture de tissus en polystyrène (style 100 x 20 mm) | Corning | 353003 | Utilisé pour la culture de cellules avant la transfection |
| Boîte de culture tissulaire en polystyrène (style 35 x 10 mm) | Corning | 353001 | Utilisé pour la culture de cellules transfectées |
| Protéinase K | Invitrogen | 25530049 | Utilisé pour éliminer les protéines dans le mélange réactionnel |
| Purificateur Axiom Classe II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Enceinte de biosécurité pour la manipulation stérile des cellules |
| Tampon de remise en suspension R | ThermoFisher Scientific | Un tampon inclus dans les kits d’électroporation, MPK1025 et MPK10096. Le tampon est utilisé pour réactiver les cellules avant l’électroporation, et sa composition est une information exclusive. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Solution de décontamination de l’ARN |
| Scepter | Millipore | C85360 | Compteur de cellules automatisé portable ; |
| Kit ScriptCap 2'-O-méthyltransférase | Cellscript | C-SCMT0625 | Utilisé pour la réaction de bouchage |
| ScriptCap m7G Système de bouchage | Cellscript | C-SCCE0625 | Utilisé pour la réaction de bouchage |
| Solution de dodécylsulfate de sodium | Invitrogen | 15553-035 | Détergent utilisé pour la réaction de protéinase K |
| Centrifugeuse Sorvall Legend XT | Thermo Scientific | 75004532 | Centrifugeuse de paillasse pour la rotation des cellules |
| Trypsine-EDTA | Gibco | 25300-054 | Utilisée pour la dissociation des cellules |
| U-118MG ; | ATCC | HTB15 | Une lignée cellulaire adhérente dérivée d’un patient atteint de glioblastome humain |
| Anticorps de vinculine | Sigma | V9131 | Utilisé pour détecter la protéine de vinculine (dilution 1:100 000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument utilisé pour l’analyse |
| cellulaire en temps réel1Les paramètres d’électroporation et d’autres informations connexes pour diverses lignées cellulaires sont disponibles sur la page d’accueil du fabricant (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html ?). |
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