Génération d’un modèle de décidualisation artificielle de souris avec ovariectomie pour la recherche sur la décidualisation de l’endomètre

Résumé

Ici, nous décrivons la méthode de génération d’un modèle de décidualisation artificielle à l’aide de la souris ovariectomisée, une expérience classique de décidualisation de l’endomètre dans le domaine de la recherche sur la décidualisation de l’endomètre.

Résumé

La décidualisation de l’endomètre est un processus de différenciation unique de l’endomètre, étroitement lié à la menstruation et à la grossesse. L’altération de la décidualisation entraîne divers troubles de l’endomètre, tels que l’infertilité, les fausses couches récurrentes et les naissances prématurées. Le développement et l’utilisation du modèle de décidualisation de l’endomètre dans les études sur la reproduction sont depuis longtemps un point culminant pour les chercheurs en reproduction. La souris a été largement utilisée dans l’étude de la reproduction et de la décidualisation. Il existe trois modèles murins bien établis en ce qui concerne la décidualisation, à savoir la décidualisation naturelle de grossesse (NPD), la décidualisation artificielle (AD) et la décidualisation in vitro (IVD). Parmi eux, la MA est considérée comme un modèle fiable pour la décidualisation de la souris, facile à mettre en œuvre et proche du NPD. Cet article se concentre sur une méthode modifiée du processus de génération et d’application du modèle de décidualisation artificielle de la souris avec ovariectomie pour éviter les effets ovariens, ce qui peut obtenir des résultats hautement reproductibles avec de petites variances au sein du groupe. Cette méthode fournit un modèle animal bon et fiable pour l’étude de la décidualisation de l’endomètre.

Introduction

Avec le développement de la technologie de procréation assistée, le taux de grossesse clinique actuel de fécondation in vitro et de transfert d’embryons (FIV-ET) a atteint ou même dépassé celui de la grossesse naturelle. Malgré cela, de nombreuses patientes en pratique clinique de procréation assistée subissent encore de multiples transferts d’embryons, mais ne parviennent pas à obtenir la grossesse souhaitée. Cependant, son mécanisme moléculaire spécifique n’est pas encore clair, de sorte que l’intervention clinique est inefficace, ce qui est l’un des défis importants auxquels est confrontée la médecine de la reproduction ^1,2.

Les facteurs endométriaux représentent environ les deux tiers des causes d’échec de la FIV³. L’implantation de l’embryon humain est divisée en trois étapes : positionnement, adhésion et invasion ^4,5,6. L’endomètre maternel subit une série de changements pour répondre à l’arrivée de l’embryon. La formation d’une « fenêtre fenêtre » d’implantation offre des conditions favorables à l’implantation embryonnaire ^7,8.

Chez la plupart des mammifères, après que le blastocyste adhère à l’épithélium luminal de l’utérus, les cellules stromales entourant le blastocyste commencent rapidement à proliférer et à se différencier, et le remodelage rapide du mésenchyme change de forme et de fonction, conduisant à l’implantation de l’embryon 5,9,10. L’augmentation rapide du volume et du poids du site permet au blastocyste de s’intégrer dans le stroma utérin, un processus connu sous le nom de décidualisation¹¹. Le stroma de l’endomètre se différencie et se remodèle en préparation à la grossesse, tandis que la transition des cellules stromales fournit de l’espace et de nouvelles connexions de signalisation aux cellules déciduales pour remplir leurs fonctions^12,13. Les cellules stromales se transforment en cellules déciduales et sécrètent de nombreux facteurs emblématiques tels que la prolactine (PRL), la protéine 1 de liaison au facteur de croissance analogue à l’insuline (Igfbp1), etc. Des études ont montré que la décidualisation anormale est l’une des principales raisons de l’échec de l’implantation embryonnaire, mais la cause de la décidualisation anormale n’est toujours pas claire et doit être clarifiée^{davantage 1,14}.

Le modèle de décidualisation artificielle de la souris est essentiel pour étudier le processus physiologique et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la décidualisation. La décidualisation artificielle (DA) fait principalement référence au processus de décidualisation de l’endomètre établi par des méthodes artificielles pour simuler la grossesse ou le cycle menstruel. En termes de morphologie, il y a peu de différence globale entre la décidualisation de grossesse et la décidualisation artificielle^15,16. Les glandes utérines existent dans l’endomètre avant la forme de décidua et disparaissent après la décidualisation. En ce qui concerne l’expression des gènes, seule une légère différence est identifiée entre la décidualisation naturelle de la grossesse (NPD) et AD¹⁵. Par conséquent, le modèle de décidualisation artificielle chez la souris peut simuler la décidualisation de la grossesse pour explorer la pathogenèse inconnue et le nouveau traitement des maladies de reproduction humaine.

NPD, AD et décidualisation in vitro (DIV) sont trois méthodes pour obtenir une décidualisation de souris. Le modèle NPD dépend de la grossesse naturelle et est le plus proche de l’état physiologique maternel, y compris les effets des embryons. Comparer les différences entre les sites d’implantation et de non-implantation est une approche plus physiologique et pratique pour étudier la décidualisation. Le modèle AD a été développé en utilisant une injection intra-utérine d’huile de sésame comme stimulant pour induire la décidualisation chez une souris femelle pseudo-enceinte accouplée avec des mâles vasectomisés pour éviter l’impact des embryons. Les modèles NPD et AD jouent tous deux un rôle essentiel à des fins de recherche différentes, mais ils ne peuvent éviter l’échec de l’accouplement et les différences au sein des groupes causées par les différentes activités du métabolisme hormonal maternel. Le DIV est une méthode dépendant du traitement combiné des œstrogènes et de la progestérone au niveau cellulaire, qui nécessite des conditions expérimentales et une capacité opératoire plus strictes. Cependant, le modèle in vitro ne peut pas simuler complètement la réponse déciduale dans des conditions physiologiques¹⁵. Par conséquent, nous proposons une méthode d’induction simple et améliorée modifiée par rapport à la MA traditionnelle pour réduire l’effet des hormones endogènes sur la décidualisation. Basé sur le succès de l’induction de décidualisation, il est plus proche de l’état physiologique et plus adapté aux expériences qui doivent exclure les facteurs embryonnaires.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité sur l’utilisation et le soin des animaux (n ° 20171202) de l’hôpital affilié Drum Tower de la faculté de médecine de l’Université de Nanjing. Toutes les opérations suivent les directives appropriées de l’agence de soin et d’utilisation des animaux et les lignes directrices nationales.

REMARQUE : Les souris ont été élevées dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques (FPS), avec une température de 22 °C ± 1 °C, une humidité relative de 50 % ± 1 %, un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h et un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.

1. Ovariectomie chez la souris

1. Stérilisez les instruments chirurgicaux avec un stérilisateur à haute température et haute pression 1 jour avant l’opération.
2. Peser des souris C57BL/6 âgées de 8 semaines et injecter par voie intrapéritonéale (i.p) du pentobarbital de sodium à 1 % en conséquence pour anesthésier les souris. La dose utilisée est de 40 mg/kg¹⁷. Cette dose fournit 40 à 60 minutes de sédation, ce qui répond aux exigences d’une ovariectomie. Pour l’analgésie préopératoire, injecter chez la souris 5 mg/kg de méloxicam (s.c).
   REMARQUE: Une anesthésie réussie chez la souris peut être indiquée par la disparition des réflexes musculaires profonds et une respiration régulière. Les signes d’anesthésie réussie comprennent l’absence de clignement des yeux au toucher du canthus interne, l’absence de déglutition lors de la traction de la langue, l’absence de flexion de la jambe lors du pincement de la peau entre les orteils et l’absence de rebond lors de l’aiguilletage de la queue.
3. Appliquez la pommade protectrice pour les yeux sur les globes oculaires pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.
4. Démarrez l’opération lorsque les souris sont complètement anesthésiées. Placez et fixez les souris en position couchée sur la surface d’opération et rasez les poils sur le dos après les avoir mouillés avec de l’eau savonneuse. Désinfectez la peau avec de l’éthanol à 70% après le rasage.
5. Trouvez le site d’incision de l’opération à 0,5 cm (ou 1,0 cm sous la côte) sur le bord supérieur de la racine de la cuisse des deux membres postérieurs parallèlement à la colonne vertébrale (Figure 1A).
   REMARQUE: Un emplacement correct de l’incision est essentiel pour localiser rapidement l’ovaire.
6. Prenez le site d’incision comme centre et désinfectez la zone d’incision avec iodophor 3x, puis placez un champ chirurgical autour de la zone d’incision.
7. Faites une incision longitudinale d’environ 0,5 à 1,0 cm à l’aide de ciseaux. Coupez le fascia et séparez passivement les muscles avec une pince à épiler.
8. Trouvez un morceau du coussinet adipeux blanc dans le champ d’incision près du pôle inférieur du rein à travers la fine couche musculaire (Figure 1B).
   REMARQUE: Le coussinet adipeux blanc est l’indicateur le plus évident de l’emplacement de l’ovaire.
9. Serrez la masse grasse avec des clips hémostatiques et tirez l’ovaire enveloppé par le coussinet graisseux hors de l’incision.
10. Serrez la jonction de l’ovaire et de la trompe de Fallope avec une pince à épiler incurvée et retirez l’ovaire le long du pédicule ovarien avec des ciseaux. Arrêtez le saignement à l’aide d’un stylo d’électrocoagulation ou d’une aiguille d’une seringue de 1 ml chauffée sur la lampe à alcool.
    REMARQUE: Assurez-vous de préserver la trompe de Fallope, qui est le point de repère anatomique pour l’injection ultérieure d’huile de sésame dans les cornes utérines.
11. Rincez l’incision chirurgicale avec une solution saline normale pour empêcher l’adhésion des tissus, utilisez une suture 4-0 pour coudre le muscle et la peau respectivement, et désinfectez à nouveau l’incision chirurgicale avec de l’iodophore.
12. Placez les souris en position couchée dans la cage et réanimez-les dans un incubateur à 25 °C équipé d’une source lumineuse et d’un système de ventilation pendant environ 2 h.
13. Faites attention aux souris après l’opération, remettez-les seules dans le lieu d’alimentation d’origine jusqu’à ce qu’elles se rétablissent complètement et donnez-leur suffisamment d’eau et de nourriture.

2. Repos postopératoire et formulation d’œstrogènes et de progestérone

1. Assurez-vous que les souris se reposent pendant 2 semaines après l’ovariectomie.
2. Dans une armoire ultra-propre, ajouter de l’œstrogène (2 ng / μL) et de la progestérone (0,2 ng / μL) dans l’huile de sésame dans des tubes centrifuges sans enzyme ARN.
3. Placer les tubes centrifugeuses dans un bain-marie thermostatique à 37 °C et agiter les tubes en continu pour accélérer la dissolution.
4. Après dissolution complète, diviser la solution d’huile de sésame en aliqouts de 100 μL pour une utilisation pratique. Conservez les solutions préparées d’œstrogènes et de progestérone au réfrigérateur à 4 °C.

3. Modèle de décidualisation artificielle induite

1. Injecter par voie sous-cutanée (s.c) 100 ng d’œstrogène dans 50 μL d’huile de sésame dans chaque souris pendant 3 jours, suivis de 2 jours de repos¹⁵.
   REMARQUE: Assurez-vous que l’œstrogène et la progestérone ont été formulés et placés à des endroits différents. Toute contamination de l’œstrogène par la progestérone peut entraîner un échec.
2. Injecter (s.c.) 1 mg de progestérone et 10 ng d’œstrogène dans 50 μL d’huile de sésame dans chaque souris pendant 3 jours^{supplémentaires 15}.
3. Faire fonctionner les souris pour induire le modèle de décidualisation artificielle¹⁵ 6 h après la troisième injection combinée œstrogène-progestérone.
4. Trouvez la corne utérine à l’extrémité inférieure des trompes de Fallope et injectez 20 μL d’huile de sésame lentement avec la corne utérine, repoussez le tissu, suturez l’incision et laissez la souris récupérer. L’approche de l’opération est la même que celle de l’ovariectomie chez la souris¹⁵.
   REMARQUE: Ne procéder à la deuxième intervention chirurgicale qu’en cas d’ovariectomie réussie (l’incision cutanée est bien cicatrisée, l’ovaire est complètement excisé et l’extrémité résiduelle de la trompe de Fallope n’est pas adhérée aux tissus environnants).
   NOTE: Pour induire le modèle AD, 20 μL d’huile de sésame sont appropriés; plus de 20 μL d’huile de sésame pénètrent facilement de l’autre côté.
5. Injecter (s.c.) 50 μL d’huile de sésame contenant 1 mg de progestérone et 10 ng d’œstrogène (H.) pendant 4 jours supplémentaires. Voir détails dans la figure 2^15,18.

4. Prélèvement d’échantillons

1. Euthanasier les souris (n = 6) par asphyxie au dioxyde de carbone et recueillir l’utérus. Observez la forme de l’utérus bilatéral, prenez des photos et pesez les cornes utérines (Figure 3A, B).
2. Fixez 3-5 mm du tissu utérin avec 10% de formol, incorporez-les dans la paraffine et sectionnez-les. Colorer les coupes avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour observer les changements morphologiques¹⁹ (Figure 4A).
3. Incorporer 3 à 5 mm supplémentaires de tissu utérin dans un composé à température de coupe optimale (OCT), congeler dans de l’azote liquide et conserver au réfrigérateur à -80 °C. Couper le tissu congelé à 10 μm et détecter l’activité de la phosphatase alcaline dans le tissu utérin par la méthode de couplage azoïque²⁰ (Figure 4B).
   NOTE: Des résultats satisfaisants peuvent être obtenus en utilisant des sections congelées pour détecter la teneur en ALP, et non des sections de paraffine.
4. Extraire les ARN totaux de l’utérus avec le réactif Trizol et effectuer une PCR quantitative en temps réel (qPCR) sur un système de PCR en temps réel (Table of Materials) avec qPCR mélange maître (Table of Materials) pour détecter l’expression relative de l’ARNm du membre 2 de la sous-famille 2 de la famille 8 de la prolactine (Prl8a2), de la phosphatase alcaline foie/os/rein (Alpl) et de la protéine 1 (Igfbp1)¹⁵ de liaison au facteur de croissance analogue à l’insuline par normalisation aux niveaux d’ARNm 18S (Figure 4C-E ). Suivre les conditions PCR : Stage 1, 95 °C pendant 30 s ; Étape 2, 95 °C pendant 10 s et 60 °C pendant 30 s; Répétez le cycle 40x. Une liste complète des séquences d’amorces est fournie dans le tableau 1.
5. Analyser les données qPCR à l’aide de la méthode ^2-ΔΔCT et d’une méthode t-test pour l’analyse statistique dans le logiciel approprié. Dans cette étude, p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Les index du modèle de décidualisation de la souris comprennent la morphologie générale de l’utérus, le rapport de masse de l’utérus décidualisé et non décidualisé, la morphologie histologique de l’endomètre et le niveau d’expression des molécules marqueurs de décidualisation. La morphologie générale de l’utérus décidualisé artificiel de souris induite par l’huile est plus proche de celle de l’utérus pendant la grossesse. Le corps utérin devient épais et la cavité utérine devient plus petite que le côté non induit. Le vo...

Discussion

La décidualisation chez la souris est un processus spontané dépendant de la présence d’embryons, ce qui est différent de l’homme. Cependant, il a été constaté que la stimulation artificielle telle que l’injection utérine de billes de verre et la lacération utérine peuvent induire la décidualisation de l’endomètre au lieu des embryons. En outre, les chercheurs ont constaté que de nombreux facteurs pouvaient induire une décidualisation ou participer à la décidualisation, tels que l’injection d’hormones stéroïdes, de prosta...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Complément hormonal	Estrogen	Sigma	E2758
Progestérone	Sigma	P0130	Supplément hormonal
Huile de sésame  ;	Sigma	S3547	Supplément hormonal
Pentobarbital sodique  ;	Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.		Anesthésie
Meloxicam injection	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgésie
phophatase alcaline (méthode de couplage kaplow/azo)	Solarbio	G1480	Coloration alcaline à la phophatase
Eosin	Servicebio	G1005-2	Coloration HE
Hématoxyline	Servicebio	G1005-1	Coloration HE
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70 % éthanol	Lircon	ZH1120090	Désinfecter
Iodophor	Runzekang	RZK-DF	Désinfecter
Erythromycine Pommade oculaire	Guangzhou Baiyunshan		Souris globe oculaire protéger
4-0 suture	Ethicon	W329	Suture d’incision
	10 % formolYulu	L25010118	Tissue fix
Température de coupe optimale Composé	Sakura	4583	Ssection
Réactif de trizol	Ambion	15596018	qPCR