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L’isolement de la lymphe mésentérique fluide chez la souris pour quantifier la cinétique in vivo de l’absorption des lipides alimentaires et de la sécrétion de chylomicrons

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DOI :

10.3791/64338

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30 novembre 2022

 ,  , 
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit un protocole chirurgical détaillé pour isoler la lymphe intestinale en écoulement en réponse aux perfusions intraduodénales de nutriments chez la souris. Cela permet la détermination physiologique de l’absorption totale des lipides intestinaux et de la synthèse et de la sécrétion de chylomicrons en réponse à divers nutriments expérimentaux.

Résumé

Les lipoprotéines intestinales, en particulier les chylomicrons riches en triglycérides, sont un facteur majeur du métabolisme, de l’inflammation et des maladies cardiovasculaires. Cependant, isoler les lipoprotéines intestinales est très difficile in vivo car elles sont d’abord sécrétées de l’intestin grêle dans les lymphatiques mésentériques. La lymphe contenant du chylomicron se vide ensuite dans la veine sous-clavière du canal thoracique pour délivrer les composants du repas au cœur, aux poumons et, finalement, à la circulation du corps entier. L’isolement des chylomicrons naïfs est impossible à partir du sang puisque les triglycérides de chylomicrons subissent une hydrolyse immédiatement après l’interaction avec la lipoprotéine lipase et d’autres récepteurs de lipoprotéines en circulation. Par conséquent, la procédure originale de fistule lymphatique de 2 jours, décrite par Bollman et al. chez le rat, a toujours été utilisée pour isoler la lymphe mésentérique fraîche avant son entrée dans la veine thoracique. Ce protocole a été amélioré et professionnalisé par le laboratoire de Patrick Tso au cours des 45 dernières années, permettant l’analyse de ces lipoprotéines critiques et des sécrétions de l’intestin. La procédure de fistule lymphatique Tso a maintenant été mise à jour et est présentée ici visuellement pour la première fois. Cette procédure révisée est une technique chirurgicale d’une journée pour l’installation d’une sonde d’alimentation duodénale, la canulation du canal lymphatique mésentérique et la collecte de lymphe après un repas chez des souris conscientes. Les principaux avantages de ces nouvelles techniques comprennent la capacité de collecter de manière reproductible la lymphe de souris (qui exploite la puissance des modèles génétiques de souris); la réduction du temps d’anesthésie pour les souris lors de l’implantation du tube de perfusion duodénale et de la canule lymphatique; la capacité d’échantillonner continuellement la lymphe tout au long de la période d’alimentation et post-prandiale; la capacité de mesurer quantitativement les hormones et les cytokines avant leur dilution et leur hydrolyse enzymatique dans le sang; et la capacité de recueillir de grandes quantités de lymphe pour isoler les lipoprotéines intestinales. Cette technique est un outil puissant pour mesurer directement et quantitativement l’absorption des nutriments alimentaires, la synthèse des lipoprotéines intestinales et la sécrétion de chylomicrons.

Introduction

L’importance physiologique du système lymphatique mésentérique
Les lymphatiques mésentériques ont été décrits sous une forme ou une autre depuis ~300 av. J.-C., lorsque Hérophile a décrit le système porte hépatique et toutes les « veines absorbantes dans les intestins»1,2,3,4,5. Pendant plus de 1 700 ans après cette description initiale, une caractéristique déterminante de la lymphatique intestinale était la présence de liquide laiteux dans la lymphe mésentérique peu de temps après un repas3. On sait maintenant que la lymphe laiteuse contenant des chylomicrons (lymphe « chyleuse ») ne s’écoule pas dans la veine porte et le foie, mais se déplace plutôt à travers la citerne chyli dans le canal thoracique et, finalement, rejoint le sang à la veine sous-clavière gauche6. En raison de cet arrangement anatomique, la lymphe chyleuse se déplace d’abord à travers le cœur et les poumons avant de circuler dans le reste du corps. Cela signifie que le cœur et les poumons obtiennent un « premier passage » aux sécrétions dans la lymphe mésentérique7.

Un rôle majeur des lymphatiques mésentériques est leur transport des lipides alimentaires de l’intestin grêle 8,9,10. Anatomiquement, chylomicrons, cellules immunitaires intestinales 11,12,13,14, hormones intestinales 15,16,17,18, antigènes 19,20,21, composés lipophiles non chylomicroniques 22,23 , et l’excès de liquide pénètre dans les lactéales sous-jacentes à la membrane basale des entérocytes et est ensuite concentré à travers les capillaires lymphatiques lymphatiques mésentériques. Il existe probablement de nombreux composants lymphatiques mésentériques inconnus, y compris des métabolites, des antigènes, des contaminants environnementaux, des nutriments et des molécules de signalisation.

Les composants de la lymphe mésentérique n’ont pas été systématiquement identifiés, en grande partie en raison de la difficulté d’isoler la lymphe mésentérique. L’accès à la lymphe mésentérique a toujours été un sérieux défi car les canaux lymphatiques sont incolores, et sauf après un repas gras où ils deviennent chyleux et laiteux, les lymphatiques mésentériques contiennent du liquide lymphatique incolore 6,8,9,10.

Méthodes actuelles et communes pour isoler la lymphe intestinale
La lymphe mésentérique n’est pas accessible chez les humains (sauf dans des circonstances rares et extrêmes où un traumatisme gastro-intestinal grave s’est produit)24. La collecte de lymphe in vivo est chirurgicalement complexe et exigeante. La procédure originale de fistule lymphatique de 2 jours a été décrite par Bollman et al.25 et a été améliorée et professionnalisée par le laboratoire de Patrick Tso au cours des 45 dernières années26,27. La procédure de fistule lymphatique permet aux chercheurs de recueillir la lymphe qui coule d’animaux conscients pendant une période de perfusion lipidique duodénale de 6 heures.

Le modèle de fistule lymphatique a principalement été utilisé chez le rat pour mesurer le débit lymphatique, la production de triglycérides et de cholestérol (ou d’autres composés infusés de duodénaux), la composition en chylomicrons et les concentrations d’hormones intestinales. Dans une moindre mesure, cette technique peut également être utilisée chez la souris, bien que la survie chirurgicale et le volume lymphatique en souffrent. En raison des difficultés à voir les canaux lymphatiques mésentériques, les méthodes historiques ont inclus la canulation de la lymphe mésentérique chez les plus gros animaux comme les mini-porcs28, les moutons29, les porcs30, les chiens31 et les rats17. Travailler avec ces modèles plus importants exige beaucoup de ressources et ne permet pas d’étudier les modèles knock-in ou knock-out.

D’autres approches ont également été utilisées. Les chylomicrons peuvent être isolés du sang à l’état postprandial (bien qu’ils soient partiellement hydrolysés par la lipoprotéine lipase plasmatique)32,33,34,35. Le canal thoracique peut également être canulé, bien que la lymphe recueillie contienne un mélange de lymphe mésentérique et de drainage lymphatique extra-intestinal26,36. In vitro, les cellules Caco-2 sécrètent une particule de type chylomicron en réponse au traitement par acides gras, et ces cellules peuvent être co-cultivées avec des cellules lymphatiques endothéliales ou vasculaires pertinentes37,38. Il a été démontré que les cultures organoïdes intestinales humaines et de souris traitent les lipides apicaux et sécrètent des chylomicrons 39,40,41,42. Ces modèles sont très avantageux et permettent de mieux comprendre la physiologie de l’intestin grêle, mais ils ne peuvent pas reproduire la complexité, les gradients physico-chimiques ou le flux lymphatique dynamique de la lymphatique mésentérique in situ.

Avantages du modèle de fistule lymphatique de souris 1 jour présenté ici
En ce qui concerne ces autres méthodes d’isolement des lipoprotéines intestinales, la technique de fistule lymphatique de Tso Lab a traditionnellement été considérée comme la technique de référence pour mesurer l’absorption des nutriments alimentaires dans la lymphe mésentérique. Cette technique in vivo a l’avantage de capturer les aspects physiologiques clés de l’absorption des lipides alimentaires - l’aspect dynamique des composés au cours de la période d’absorption, ce qui nécessite l’échantillonnage répété de la lymphe mésentérique en flux chez les animaux vivants avec des nutriments duodénaux. Cette technique chirurgicale mesure également les hormones intestinales et les cytokines directement dans leur compartiment physiologique plutôt que dans le sang, où elles sont diluées et dégradées enzymatiquement17,43.

Si la question expérimentale nécessite une compréhension de la dynamique de sécrétion lipidique ou de l’absorption dynamique et du métabolisme de tout composé ou médicament gastro-intestinal hydrophobe, alors cette technique est non seulement appropriée, mais c’est aussi la seule approche qui interpole le mouvement du contenu luminal de l’intestin proximal à l’intestin distal (de l’estomac au côlon) et de l’apical à la surface basolatérale (contenu luminal à travers entérocyte aux latées et circulation portale). Comme cette technique utilise l’apport luminal de nutriments à travers le cathéter intraduodénal, et parce que la lymphe mésentérique qui coule est détournée et recueillie, l’ensemble de l’appareil d’absorption est sous contrôle expérimental et peut être utilisé pour évaluer qualitativement les profils d’absorption de l’intestin grêle.

Présenté visuellement ici pour la première fois est une mise à jour majeure du modèle de fistule lymphatique de Tso Lab, qui (1) réduit le temps expérimental à une période d’implantation chirurgicale et de collecte expérimentale de 1 jour; (2) améliore la survie des souris et les considérations de bien-être animal; et (3) augmente la reproductibilité de l’approche chez la souris pour exploiter la puissance des modèles génétiques de souris. Cette technique doit être considérée comme un étalon-or pour toutes les questions expérimentales de sécrétions intestinales, de lipoprotéines ou d’absorption des lipides alimentaires et est la meilleure technique pour la détermination haute fidélité de la cinétique d’absorption des lipides et des chylomicrons.

Protocole

Toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par le Comité interne de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh [Protocole # 20047008] et sont conformes au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris mâles C57BL6/J, âgées de 8 à 14 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Toutes les souris ont été logées sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures avec un accès ad libitum au chow standard et à l’eau.

1. Préparation des animaux

  1. Selon la conception expérimentale, nourrissez les souris ou laissez-les jeûner.
    REMARQUE: Un jeûne nocturne est inutile à moins qu’il n’y ait des préoccupations concernant les différences dans le taux de vidange de l’estomac.
  2. Induire l’anesthésie par 5% de gaz isoflurane et assurer une anesthésie adéquate par pincement de la queue et des orteils. Une fois anesthésiées, gardez les souris sur un plan anesthésique approprié avec 2% à 3% de gaz isoflurane et positionnez-les avec du ruban adhésif sur la plate-forme chirurgicale.
  3. Gardez les souris au chaud sur une plate-forme chirurgicale chauffée qui utilise de l’eau chaude en circulation (voir le tableau des matériaux).

2. Chirurgie et conception expérimentale

  1. Commencez la chirurgie en appliquant une pommade vétérinaire sur les yeux, en rasant l’abdomen et en appliquant un gommage chirurgical antiseptique (voir le tableau des matériaux) sur le site chirurgical. Cela stérilise l’incision et réduit la génération de fourrure en suspension dans l’air pendant l’incision médiane.
  2. Maintenez une zone de travail stérile en utilisant des instruments stériles, des champs et d’autres équipements et fournitures nécessaires.
  3. Injecter la première dose de carprofène (voir le tableau des matières) pour soulager la douleur (i.p.) à une dose de 5 mg/kg.
  4. Saisissez la peau avec une pince à épiler et faites une incision abdominale médiane avec de petits ciseaux. Couper vers le sternum (jamais au-dessus) et couper jusqu’à la graisse inguinale. Ensuite, coupez la couche musculaire séparément à l’aide des ciseaux.
    REMARQUE : Stérilisez tout l’équipement avant utilisation.
  5. À l’aide de l’écarteur, éloignez les viscères péritonéaux jusqu’à ce que le canal lymphatique soit visible.
  6. À l’aide d’un coton-tige imbibé de solution saline (voir le tableau des matériaux), déplacez le foie vers le côté supérieur droit du corps et les intestins et l’estomac vers la gauche de l’animal.
  7. Étirez le duodénum vers la gauche transversalement pour exposer l’artère mésentérique supérieure et le canal lymphatique intestinal.
  8. Préparer un tube de canule d’une longueur de 30 à 40 cm en insérant une aiguille émoussée dans le tube de la canule (voir le tableau des matières) et rincer une petite quantité d’héparine (1 000 U/L) dans le tube à l’aide d’une seringue de 1 mL.
    REMARQUE : Le flux lymphatique est aidé par gravité à s’écouler vers le bas et dans les tubes de collecte de microcentrifugeuses sur la glace. Selon l’endroit où le seau à glace de collecte est situé à côté de l’installation chirurgicale, la longueur du tube de canule peut devoir être ajustée.
  9. Utilisez des ciseaux pour couper un biseau à l’extrémité du tube de la canule.
  10. Faites une incision peu profonde avec des ciseaux d’iris (voir le tableau des matériaux) dans le canal lymphatique à environ 5 mm de son apparition dans l’intestin grêle.
  11. Tenez le tube de la canule avec une paire de pinces fines et insérez doucement le biseau de l’embout dans le conduit.
    REMARQUE: Il est important de ne pas pousser la canule trop loin dans le canal, car cela pourrait empêcher le flux lymphatique lorsque les organes rétractés sont remis dans leur position initiale.
  12. Le canal lymphatique est beaucoup trop fragile pour les manipulations associées à l’attache du cathéter avec une suture. Utilisez plutôt une goutte de colle cyanoacrylate (voir le tableau des matières) pour coller la canule lymphatique dans le canal lymphatique mésentérique.
  13. Vérifiez la lymphe blanche laiteuse (si un gavage à l’huile d’olive préopératoire a été utilisé) ou la lymphe claire (si les souris ont jeûné avant la chirurgie) qui commence à circuler immédiatement à travers la canule de la fistule lymphatique.
    NOTE: Vérifiez que la canule lymphatique est correctement placée et que la lymphe coule; Poursuivre la mise en place de la canule intraduodénale.
  14. À l’aide d’une aiguille de 18 G, percez un trou dans la région pylorique de l’estomac postérieure au sphincter pylorique.
  15. Insérez le tube de perfusion duodénale (voir le tableau des matériaux) à travers ce trou dans l’estomac jusqu’à environ 1-2 mm au-delà du sphincter pylorique dans le duodénum.
  16. Fixez par une ligature de cordons de bourse à l’aide d’une suture en soie 5-0 (voir Tableau des matériaux) avec une aiguille sur l’estomac et scellez avec une goutte de colle cyanoacrylate pour éviter les fuites.
  17. Commencez la perfusion intraduodénale de solution saline à 5 % de glucose à 0,9 % à 0,3 mL/h.
    REMARQUE: Lorsque vous utilisez des souris dont le poids corporel varie légèrement et qui pèsent environ 25 g (~ 8 semaines), la perfusion de 0,3 mL / h de glucose / solution saline est appropriée. Si les souris sont considérablement plus grosses, le débit de perfusion doit être ajusté à la hausse pour tenir compte de l’évolution du poids corporel et du volume sanguin.
  18. Remplacez les organes de la cavité corporelle et suture (5-0) les tissus musculaires et cutanés séparément.
    REMARQUE : La canule lymphatique et la sonde d’alimentation intraduodénale sont toutes deux extériorisées par la même incision. Il n’y a pas de priorité pour séparer les tubes avec une suture et pas de préférence pour l’angle d’extériorisation des tubes.
  19. Après la chirurgie mais avant le retrait de l’anesthésique, placez doucement les souris dans des dispositifs de contention Snuggle (voir Tableau des matériaux) pour limiter la motilité.
    REMARQUE: Les dispositifs de retenue des câlins empêchent les souris de saisir ou de faire pivoter la tête pour mâcher les points de suture et les tubes.
  20. Ensuite, placez les souris dans une boîte en plexiglas transparent sur un rotateur à bascule douce et réchauffez-les à l’aide d’un coussin chauffant pour amphibiens et reptiles disponible dans le commerce et collé sur le côté de la boîte de confinement. Fournir également une humidification sous forme de contenants d’eau désionisée stérile aux coins de la boîte de confinement (voir le tableau des matériaux).
  21. 30 minutes avant le retrait de l’isoflurane, administrer aux souris leur deuxième dose de soulagement de la douleur (Buprenex, 0,1 mg/kg, i.p.).
  22. Selon l’expérience, fournir aux souris une perfusion intraduodénale continue de solution saline à 5 % de glucose à 0,9 % à raison de 0,3 mL/h pendant 1 h.
    REMARQUE: La solution saline à 5% glucose-0,9% est préparée à l’aide d’un sac salin stérile (pour usage humain, pH 7,4) de la pharmacie et d’un flacon stérile pour usage humain de 50% de dextrose, en suivant des directives strictes pour la stérilité. La solution doit être fraîche et jetée si les dates de péremption indiquées sur le sac de solution saline ou le flacon de dextrose sont dépassées.
  23. Administrer aux souris l’un des lipides énumérés dans le tableau 1 comme lipide expérimental via une canule intraduodénale (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Pour toutes les données présentées à la figure 1, SMOFlipid (émulsion injectable lipidique à 20 %, USP, voir le tableau des matériaux) a été perfusé par voie intraduodénale. Cette perfusion pré- et post-intraduodénale bolus lipidique remplace le liquide perdu qui s’écoule par le canal lymphatique et est une exigence absolue. Les souris sont maintenant prêtes à être perfusées avec une dose expérimentale de lipides.
  24. Effectuer la perfusion lipidique classique d’un bolus d’émulsion lipidique de 0,3 mL (émulsion injectable SMOFlipid 20% lipidique, USP) via le tube de perfusion intra-duodénale (voir Tableau des matériaux).
  25. Après la perfusion en bolus de lipides intraduodénaux, repasser la perfusion à une solution saline à 5 % de glucose à 0,9 % à 0,3 mL/h en continu jusqu’à la fin de l’expérience.
  26. Prélever les échantillons de lymphe dans des tubes microcentrifugés prépesés pendant 60 minutes et garder la lymphe sur la glace. Peser les tubes une deuxième fois pour établir le poids de la lymphe sécrétée chaque période de 60 minutes.
    REMARQUE: Attendez-vous à recueillir environ 50-300 μL de lymphe par heure, par souris dans les ~ 6 heures après un bolus lipidique de 0,3 mL.
  27. La lymphe peut circuler jusqu’à 6 heures après la perfusion de lipides. Au point de temps de 6 heures, euthanasier les souris via l’isoflurane et la luxation cervicale.
    REMARQUE : Un chirurgien et/ou un technicien de laboratoire doit être présent pour surveiller les animaux tout au long de l’expérience. Pendant l’observation, recherchez des caillots dans le drainage lymphatique et des changements dans le comportement animal qui indiquent une douleur / détresse. Si le canal lymphatique est obstrué à un moment quelconque de l’expérience, l’expérience est terminée et l’animal est euthanasié. L’animal peut techniquement être maintenu en vie jusqu’à 24 heures après la chirurgie (selon les règles de chirurgie de survie de l’IACUC). Cependant, les taux de survie diminuent avec le temps, et 6 h est une période de survie reproductible où l’absorption des lipides imite encore la physiologie in vivo , et l’animal ne lutte pas pour sa survie.
  28. Effectuer un prélèvement de tissus en phase terminale après l’euthanasie (étape 3.1).
    REMARQUE: La différence dans les profils d’absorption des lipides alimentaires chez les souris gardées pendant 6 heures ou 24 heures après la chirurgie a été récemment testée44. Nous avons constaté que la procédure de 24 heures réduit les taux de survie des animaux et l’excursion des lipides alimentaires dans la lymphe. Pour ces raisons, nous recommandons fortement l’approche des 6 heures. Cette conception chirurgicale mise à jour réduit la mort inutile des animaux et le risque de détresse animale dans la période postopératoire. Cela soutient un objectif majeur de l’American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, qui est le remplacement des animaux, la réduction, le raffinement [ref PMID: 21595115].

3. Collecte du contenu luminal et du tissu muqueux

  1. À la fin de la période de perfusion lipidique de 6 h, sacrifier les souris via l’isoflurane et la luxation cervicale. Attachez les deux extrémités de l’estomac, de l’intestin grêle et du caecum avec des sutures 5-0 pour éviter les fuites du contenu luminal.
  2. Recueillir l’estomac, le caecum et le côlon, et placer chacun dans un tube de verre de 15 mL. Diviser l’intestin grêle en trois ou quatre segments et recueillir le contenu luminal en rinçant le tissu dans 2-3 mL de PBS froid après avoir coupé longitudinalement.
  3. Retirer la muqueuse intestinale comprenant les cellules épithéliales et la lamina propria associée de la couche musculaire en grattant chaque section dans 2-3 mL de PBS froid avec une pince à épiler incurvée.
  4. Placer tous les tissus, les isolats luminaux et muqueux et la couche musculaire dans des tubes de verre et ajouter 8 mL de CHCl3:MeOH 2:1 vol/vol à chaque tube.
  5. Déterminer la radioactivité et/ou les concentrations lipidiques par comptage par scintillation liquide et/ou par dosage des triglycérides (voir le tableau des matières) après extraction de Folch45.

4. Chromatographie sur couche mince (CCM)

  1. Extraire les lipides totaux des isolats luminaux et muqueux par extraction Folchmodifiée 45.
  2. Sécher les lipides extraits dans le solvant sous un évaporateur d’azote, puis les remettre en suspension dans 2:1 vol/vol de CHCl3:MeOH avant de les charger sur une plaque de gel de silice TLC (voir Tableau des matériaux).
  3. Séparer les lipides à l’aide d’un système de solvant composé d’éther de pétrole, d’éther éthylique et d’acide acétique glacial (25:5:1 vol/vol/vol). Utilisez de la vapeur d’iode pour la visualisation de différents lipides, y compris les normes.
  4. Grattez les taches sur la plaque TLC correspondant aux monoglycérides/phospholipides, aux diglycérides, aux acides gras, aux triglycérides et à l’ester de cholestérol dans des flacons de scintillation individuels avant d’ajouter 4 mL de liquide scintillant (voir le tableau des matières) pour le comptage des scintillations.
  5. Exprimez les données en pourcentage de la dose totale de lipides en bolus ou en fraction du lipide total détecté pour chaque échantillon.

5. Isolement et caractérisation des chylomicrons

  1. Transférer les échantillons de lymphe combinés du bolus post-lipidique de 6 h (étape 2.29) dans des tubes à ultracentrifugation, mélangés avec 0,9% de NaCl (300-500 μL), puis recouvrir soigneusement avec un volume approprié de NaCl à 0,87% (300-500 μL).
    1. Ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux) les échantillons à 110 000 x g à 4 °C pendant 16 h. Recueillir la fraction supérieure contenant des chylomicrons isolés et les transférer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
  2. Déterminez les concentrations de triglycérides de chylomicrons, de cholestérol et d’apoB en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Déterminer les concentrations de triglycérides et de cholestérol à l’aide d’une trousse de dosage des triglycérides et du cholestérol (voir le tableau des matières).
    2. Brièvement, incuber 2 μL des échantillons avec 200 μL de réactif enzymatique à 37 °C pendant 5 min dans une plaque de 96 puits. Lisez la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque à 500 nm pour les triglycérides et à 600 nm pour le cholestérol.
      NOTE: Des étalons et des blancs ont été utilisés pour le calcul des concentrations. Les concentrations d’ApoB ont été déterminées à l’aide de la trousse ELISA ApoB de souris (voir le tableau des matériaux).
  3. Déterminer la taille des particules de chylomicrons.
    1. Utiliser des échantillons de chylomicrons frais à des concentrations de triglycérides d’environ 40 mg / dL pour l’imagerie TEM. En bref, placer 5 à 10 μL de chaque échantillon sur une grille TEM et sécher.
    2. Examinez la grille à l’aide d’un microscope électronique à transmission et capturez des images. Mesurer la taille des particules de lipoprotéines et les analyser à l’aide du logiciel ImageJ (voir Tableau des matériaux).

Résultats

La figure 2 montre la sécrétion de triglycérides dans la lymphe mésentérique et les débits lymphatiques moyens chez les souris n = 17 plus récentes de type sauvage (WT) qui ont subi la procédure de fistule lymphatique d’une journée décrite ici. Comme le montre la figure 2A, la concentration de triglycérides dans la lymphe augmente en réponse à un bolus intraduodénal de 300 μL de SMOFLipid. La concentration maximale de triglycérides est atteinte à ~2-3 h après le bolus et diminue régulièrement pendant les 6 heures (immédiatement avant l’euthanasie). Parallèlement à la sécrétion de triglycérides, le débit lymphatique augmente à partir de la perfusion du bolus Time 0 jusqu’à la fin de l’expérience (Figure 2B).

Ces résultats montrent que l’implantation chirurgicale du canal lymphatique mésentérique et de la canule intraduodénale a eu lieu et sont représentatifs d’un contrôle positif auquel d’autres contenus lymphatiques (hormones, peptides, nutriments) pourraient être comparés. S’il n’y a pas de changement dans la concentration de triglycérides dans la lymphe en réponse aux lipides intraduodénaux en bolus, cela indique que la chirurgie a causé des dommages importants à l’intestin grêle, de sorte que la capacité d’absorption des lipides est absente, ou, dans les modèles génétiques précédemment non phénotypés, cela suggérerait que la souris a un défaut d’absorption des lipides physiologiquement significatif.

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Figure 1 : Chronologie proposée pour le modèle murin de fistule lymphatique. T-4, T-3, T-2: La double canulation prend environ 2-4 h, suivie du placement des souris dans des chambres de récupération. T-1: Une fois que les souris sont dans la période de récupération, elles reçoivent une perfusion duodénale continue de 5% de glucose - 0,9% de solution saline. T0: la perfusion intraduodénale continue passe d’une solution saline à 5% de glucose à 0,9% à une infusion de nutriments expérimentaux. T0-T6: Les souris reçoivent du glucose intraduodénal continu à 5% dans une solution saline ou, alternativement, des nutriments continus. La lymphe est recueillie toutes les heures pendant cette période. Point final : Les souris sont euthanasiées et les tissus peuvent être prélevés. La figure a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Concentration et débit des triglycérides lymphatiques mésentériques. Les souris de type sauvage ont été équipées d’une sonde d’alimentation intraduodénale et d’une canule lymphatique mésentérique. Les souris ont reçu une perfusion en bolus de 300 μL de lipides. La lymphe a été recueillie pendant 6 heures dans des aliquotes horaires et conservée sur la glace. (A) La teneur en triglycérides lymphatiques a été déterminée par un dosage chimique dans chaque aliquote horaire de lymphe. (B) Dans les 6 heures après la perfusion du bolus, le flux lymphatique est tracé en grammes de lymphe sécrétés par heure. Les points sont des moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Méthodes d’administration des lipidesRecommandations/Instructions
Bolus d’émulsion lipidique mixteUne dose de 0,3 mL de ( A ) Liposyn III injectable à 20 % lipidique ou (B) d’émulsion injectable injectable à 20 % de lipides SMOFlipid, USP, par tube de perfusion intra-duodénale peut être utilisée. Ces lipides émulsionnés sont utiles parce qu’ils n’ont pas besoin d’être préparés à l’avance, sont liquides à température ambiante, sont stériles et parce qu’ils contiennent un mélange « facilement digestible » d’acides gras libres, de triglycérides, de phospholipides et de taurocholate de sodium. C’est une bonne perfusion de démarrage pour les souris qui peuvent avoir des insuffisances pancréatiques ou biliaires.
Bolus de triglycérides0,3 ml d’huile d’olive doucement réchauffée (ou de trioléine purifiée) en tant que lipide neutre qui reflète une alimentation riche en graisses insaturées, le saindoux (reflétant un régime à forte teneur en graisses saturées) ou l’huile de noix de coco (reflétant un régime à forte teneur en triglycérides à chaîne moyenne) peuvent tous être administrés par tube de perfusion intra-duodénale ou gavage oral. Si les triglycérides expérimentaux sont saturés, ils doivent être chauffés pour être liquides à température ambiante.
Bolus de repas composés0,3 mL Ensure avec la formulation contenant 0,075 g de lipides (21,6%), 0,5 g de glucides (64,0%) et 0,1125 g de protéines (14,4%) et reflète un repas mixte faible en gras, peut être administré par perfusion intra-duodénale.
Bolus lipidique radiomarqué5,0 μCi 3 trioléate de glycérol marqué H et/ou 1,0 μCi 14C-cholestérol dans 0,3mL d’huile d’olive peuvent être administrés par perfusion intra-duodénale. 14 C-cholestérol: Cholestérol-[4-14C] avec une activité spécifique de 55Ci/mmol et une concentration de 0,1mCi/mL. 3 H-TG Trioléine [9,10-3H(N)] (3H-TG) avec activité spécifique de 60Ci/mmol et concentration de 1mCi/mL
Dose continueLa perfusion de l’une des formulations nutritives expérimentales ci-dessus à un débit de 0,3 mL/h (plutôt que 0,3 mL de bolus total) entraînera une production régulière de triglycérides dans la lymphe. Cela diffère d’une perfusion en bolus, où la concentration de triglycérides dans la lymphe culmine à ~2-3 h, puis revient aux concentrations de base à ~6-8 h.

Tableau 1 : Tableau des perfusions lipidiques.

Discussion

La procédure originale de fistule lymphatique de 2 jours a été décrite par Bollman et al.25 et pratiquée par le laboratoire de Patrick Tso depuis 45 ans 26,27. Le protocole présenté ici est un ajout puissant à cette méthode classique de référence pour identifier, quantifier et comprendre les sécrétions chyleuses uniques de l’intestin grêle, ainsi que la dynamique in vivo de l’absorption et du métabolisme des nutriments alimentaires, des hormones intestinales et de l’immunité intestinale.

Les avantages de ce modèle comprennent (1) la capacité d’échantillonner continuellement la lymphe mésentérique tout au long de la période d’alimentation et post-prandiale plutôt que l’échantillonnage statique à un moment donné pendant l’absorption, la digestion ou la sécrétion; 2° la mesure des hormones intestinales et des cytokines directement dans leur compartiment physiologique plutôt que dans le sang, où elles sont diluées et dégradées enzymatiquement 17,44; (3) la capacité d’isoler, de quantifier et de caractériser les lipoprotéines sécrétées par l’intestin grêle à la suite de l’ingestion d’un repas lipidique et de l’absence de lipases endothéliales dans la lymphe mésentérique, ce qui préserve les concentrations de triglycérides chylomicrons et la structure du chylomicron natif46,47; (4) la capacité de mesurer directement le débit lymphatique, la production de triglycérides et de cholestérol (ou d’autres composés infusés de duodénaux), la composition en chylomicrons et les concentrations d’hormones intestinales. Enfin, ce protocole permet de recueillir des quantités relativement importantes de >50 μL de lymphe toutes les heures sur une période de 6 heures. Au fur et à mesure que le liquide est reconstitué avec une solution saline intra-duodénale et une perfusion de glucose, le modèle de fistule lymphatique est considérablement amélioré par rapport aux autres techniques d’échantillonnage lymphatique et donne lieu à des pools fluides plutôt que statiques de lymphe mésentérique. Comme le volume est un obstacle majeur pour les approches lipidomiques, protéomiques et métabolomiques, il s’agit d’une force majeure.

Le protocole de fistule lymphatique de souris de 1 jour décrit ici présente plusieurs avantages par rapport au protocole original de fistule lymphatique, notamment une réduction du nombre total d’animaux expérimentaux par rapport aux protocoles de fistule lymphatique de 2 joursdécrits précédemment 26,27 en raison d’un taux de survie plus élevé après la chirurgie; une réduction du temps expérimental global de 2 jours à un seul jour; et, enfin, une réduction de la période de récupération pour les souris de la nuit (>18 h), où des douleurs paroxystiques ou de mauvais résultats post-chirurgicaux peuvent survenir, à une période plus gérable de ~6 heures après la chirurgie.

Une caractéristique de ce protocole de 1 jour est l’accent mis sur les considérations et les critères d’évaluation sans cruauté. Ceux-ci doivent avoir la plus haute priorité: (1) les animaux doivent recevoir des liquides de remplacement intraduodénaux ou IV; (2) ils doivent être maintenus au chaud et aussi indolores que possible (avec du Buprenex et/ou du carprofène postopératoires, selon la conception expérimentale et la nécessité d’éviter les effets anti-inflammatoires); (3) les saignements, les tremblements, la diarrhée ou les signes de détresse sont tous des raisons impérieuses d’établir un critère d’évaluation humain. Selon les directives strictes de l’IACUC, l’isoflurane suivi d’une luxation cervicale est un bon critère d’évaluation. Les taux de survie chirurgicale sont de ~70% pour une seule journée (contre ~40% pour la chirurgie initiale de 2 jours), mais les chercheurs ne devraient pas hésiter à terminer l’expérience à un signe de détresse. Cela devrait être pris en considération lors de la planification du nombre d’animaux.

En termes de dépannage de cette technique, la mise en place réussie de la canule lymphatique est le principal goulot d’étranglement de cette intervention chirurgicale. Tout en pratiquant la chirurgie, il est utile de gavage de la souris avec 0.3 mL d’huile d’olive environ 2 h avant la chirurgie. Cela provoquera la sécrétion de chylomicrons dans le canal lymphatique mésentérique, le rendant « laiteux » et plus visible. Le bleu de méthylène peut également être utilisé, mais il est souvent moins évident que le canal lymphatique laiteux. Si, après la mise en place de la canule lymphatique et son placement avec de la colle, la lymphe mésentérique circule avec succès à travers la canule dans un récipient de collecte, on peut procéder à la mise en place d’un tube de perfusion duodénale. Parfois, la lymphe peut ne pas circuler continuellement, mais peut recommencer à circuler lorsque l’animal est placé sur la table tournante. De manière critique, faites attention aux caillots dans les tubes lymphatiques. Ceux-ci doivent être massés hors des tubes pour éviter la pression de refoulement sur le canal lymphatique.

En plus de la sécrétion de triglycérides et du débit lymphatique, cette technique peut être utilisée pour déterminer les caractéristiques suivantes de la cinétique d’absorption des lipides et du chylomicron:

Sécrétion de chylomicrons45,48,49
Immédiatement après un repas contenant des matières grasses, il y a une augmentation transitoire des triglycérides plasmatiques circulants. Comme les triglycérides sont intrinsèquement hydrophobes, ils doivent d’abord être émulsionnés pour être solubles dans le sang50. Les entérocytes de l’intestin grêle remplissent ce rôle et conditionnent les triglycérides alimentaires dans des particules d’émulsion de chylomicron51. Les chylomicrons contiennent du cholestérol et des triglycérides alimentaires dans leur noyau, entourés de phospholipides et d’apolipoprotéines, y compris apoB-48, apoA-I, apoA-IV et apoC-III52,53,54,55. L’apoB-48 est la protéine structurelle essentielle, et les autres apolipoprotéines ont diverses fonctions requises pour le métabolisme des chylomicrons et la clairance du sang. Pour déterminer les caractéristiques clés des chylomicrons, y compris leur teneur en triglycérides et en apolipoprotéines, la technique de fistule lymphatique de 1 jour présentée ici doit être utilisée. Le taux de sécrétion de chylomicrons est le pourcentage de 3H-triglycérides perfusés qui est sécrété dans la lymphe et mesuré par scintillation en comptant des échantillons de lymphe horaires. Ceci peut être combiné avec la caractérisation détailléedes chylomicrons 48,49,56,57,58. Les échantillons de lymphe horaires peuvent être combinés ou conservés séparément. La lymphe est transférée dans des tubes à ultracentrifugeuses, mélangée à 0,9% de NaCl, puis soigneusement recouverte de 300 à 500 μL de NaCl à 0,87%. Les échantillons sont ensuite ultracentrifugés à 110 000 x g à 4 °C pendant 16 h. Les fractions supérieures contenant des chylomicrons isolés sont collectées et testées pour les concentrations de triglycérides à l’aide du kit de dosage des triglycérides. Brièvement, 2 μL du chylomicron (dilution 1:10) sont incubés avec 200 μL de réactif enzymatique à température ambiante pendant 10 min dans une plaque de 96 puits. La plaque est lue par un lecteur de plaques à 500 nm, et les étalons et les blancs sont utilisés pour le calcul des concentrations de triglycérides. La taille des chylomicrons peut ensuite être déterminée par coloration négative et microscopie électronique à transmission (MET)14,29. Les triglycérides et le cholestérol peuvent être quantifiés par dosage chimique et teneur en apolipoprotéines (apoB-48, A-I, C-II, C-III) par des kits ELISA ou Western blot.

Détermination du site primaire d’absorption des lipides 48,59
En isolant les compartiments des cellules luminales et épithéliales du duodénum, du jéjunum et de l’iléon 6 h après la perfusion de 3H-triglycérides ou d’un repas mixte radiomarqué, le contenu est extrait de Folch pour déterminer la quantité de 3H-triglycérides absorbée à travers la membrane cellulaire épithéliale (normale) ou est retenue dans la lumière (anormale) le long de l’intestin grêle48 . Ces études sont particulièrement percutantes s’il existe des différences potentielles dans la motilité gastro-intestinale 60,61,62, s’il existe une hypothèse concernant les acides biliaires (très actifs tout au long de l’absorption des lipides et eux-mêmes réabsorbés dans l’iléon)63,64,65,66, ou si l’on craint que les nutriments soient absorbés au mauvais endroit anatomique (iléon ou même côlon)67 ,68,69,70.

Identification des mécanismes du trafic de 3 H-triglycérides dans les cellules épithéliales absorbantes48
Ceci est effectué en calculant le pourcentage de 3 H-triglycérides hydrolysés en acidegras 3 H-libre dans la lumière intestinale, absorbés dans la muqueuse et réestérifiés en 3H-triglycérides intracellulaires avant la sécrétion sous forme de chylomicrons. Il s’agit d’un marqueur puissant des défauts d’absorption / sécrétion, car il peut être tracé pour montrer le mouvement des triglycérides alimentaires dans ses produits de dégradation et son emballage ultérieur en chylomicrons. L’expression de l’ARNm de la machinerie d’absorption des acides gras (CD36, FABPs, ACSL), de la voie de réestérification (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) et des apolipoprotéines (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) peut être quantifiée par RT-PCR.

Les applications futures de cette technique ne sont limitées que par l’intérêt pour la diaphonie intestin-organe, le métabolisme, l’immunité, l’absorption des nutriments, les contaminants alimentaires environnementaux ou toute autre maladie jouant un rôle dans le système gastro-intestinal. Il est probable que de nombreuses expériences et hypothèses convaincantes ont été bloquées en raison de la difficulté d’accès au système lymphatique mésentérique critique, et le but de ce protocole visualisé est de rendre cette technique plus facilement disponible. L’isolement des chylomicrons et de la lymphe mésentérique dans laquelle ils résident initialement est un élément essentiel de la compréhension du métabolisme du corps entier; Le modèle de fistule lymphatique de souris de 1 jour est un modèle physiologique puissant pour étudier ces événements.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes extrêmement reconnaissants à la Fondation de la mucoviscidose (Pilot and Feasibility Award 1810, à ABK), à la Fondation Rainin (Synergy Award, à PI GJ Randolph et Co-I ABK) et aux National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 à ABK) pour leur soutien à ces études.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de sodium injectable à 0,9 %, USP stérileHospira, Lake Forest, IL, USNDC 0409-4888-06
Tubes Eppendorf de 1,7 mLFisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis7200184
14C-cholestérol : Cholestérol-[4-14C] (0,1 mCi/ mL)American Radiomarked Chemicals Inc., St. Louis, MO, USARC 0857
Aiguillede 18 gBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, États-Unis305199
2 Pince à micro-dissection DumontFine Science Tools, Foster City, CA, US11251-35
2 ForcepsROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5130
3H-TAG :  ; Trioléine [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL)American Radiomarked Chemicals Inc., St. Louis, MO, États-UnisART0199
3H-TG Trioléine [9,10-3H(N)] (3H-TG)American Radiomarked Chemicals, INC. St. LouisMO 63146
50 % Dextrode Injection, USP 25gs/50 mL  ; stérileHospira, Lake Forest, IL, USNDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates : matrice de gel de silice Z265500-1PAKFisher Scientific, Waltham, MA, US11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep SwabstickFisher Scientific, Waltham, MA, US14-910-501
Gommage chirurgical à la bétadineDynarex Corp., Orangeburg, NY, US1201
Canuleà coupe biseautéeBraintree Scientific.,  ; Braintree , MA, USMRE025
Buprénorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex)HenrySchein, Warrendale, PA, US1278184
C57BL6/J souris mâlesJackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrepBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US260100
Kit de dosage du cholestérolFujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US
Cholestérol-[4-14C]American Radiomarked Chemicals, INC. St. LouisMO 63146
Boîte en plexiglas transparent L43cm X L26 X H 21 avec coussin chauffant à température contrôlée et humidificationnotre propre conception et modifications
disponibles dans le commerce  ; coussin chauffant pour amphibiens/reptilesShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, ChineXHC-F035D
Applicateurs à embout en cotonFisher Scientific, Waltham, MA, US22363156
Tube de perfusion duodénal - canualaBraintree Scientific, Braintree, MA, USMRE037
EnsureAbbott Nutrition, Columbus, OH
Plate-forme chirurgicale de coussin chauffant avec combinaison de pompe à eau chaude circulantePatterson Scientific, Waukesha, WI, USGaymar T/ Pompe classique
d’injection d’hétarine sodique, USP 1 000 unités/mL stérileMylan, Morgantown, WV, USNDC-67457-384-31
Image J SoftwareNational Institute of Health, Bethesda, Maryland,
ciseaux à irisROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5602
IsofluranePiramal Pharma Solutions, Riverview, MI, États-UnisNDC 66794-017-25
Appareil d’induction d’isoflurane et appareil d’anesthésiePatterson Scientific, Waukesha, WI, États-Unisd’induction de souris
Colle KrazyElmer’s products Inc., Columbus, OH, USKG484
Liposyn III 20 % lipidique injectableHospira Inc. Lake Forest, Illinois, États-Unis
LS 6500 Compteur à scintillation polyvalentBeckman Coulter, Brea, CA
Ciseaux à ressort de micro-dissectionROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5602
Souris apoB ELISA KitABCAM Inc., Waltham, MA, USab230932-1
Porte-aiguilleFine Science Tools, Foster City, CA, US12002-12
EnrouleursKent Scientific Co., Torrington, CT, USSURGI-5001
Rimadyl (Carprofen)Zoetis Inc., Kalamazoo MI, États-Unis4019449
Table tournante Barnstead ThermolyneLabquake, Zü ; rich, SuisseBarnstead Thermolyne
SMOFlipid 20 % lipid injectable émulsion, USPFresenius Kabi, Warrendale, PA, USNDC-63323-820-01
SnuggleLomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Π; le-Perrot, QC J7V 7M4, CanadaMS 02.5PM
Ciseaux chirurgicauxROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5912SC
Suture (soie 5-0 avec aiguille)DemeTECH, Miami Lakes, FL, USDT-719
Microscope électronique à transmission (JEOL 1400-FLASH 120KV )JEOL, Peabody, MA
Kit de dosage des triglycéridesRandox Laboratories, Crumlin, Royaume-UniTR210
ULTIMA GOLD XR Fluide à scintillationPerkin Elmer, Hebron, KY, États-Unis6013119
Ultracentrifugeuse, rotor S100AT4-497SORVALL RC M120 GX
99902601 Chambre

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Isolation de la lymphe m sent riquefistule lymphatiquelipoprot ines intestinalesperfusion intraduod nalem tabolisme postprandialcanulation lymphatiquemesure des triglyc ridescommunication intestin organe
L’isolement de la lymphe mésentérique fluide chez la souris pour quantifier la cinétique in vivo de l’absorption des lipides alimentaires et de la sécrétion de chylomicrons
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